Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Podsumowanie

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Streszczenie

Zarodek kurczaka jest cennym narzędziem w badaniach nad wczesnym rozwojem embrionalnym. Jego przezroczystość, dostępność i łatwość manipulacji sprawiają, że jest to idealny model do badania ekspresji genów podczas formowania się pączków mózgu, rurki neuralnej, somytów i serca. Niniejszy film prezentuje poszczególne etapy dwukolorowej hybrydyzacji in situ w preparatach całych (whole mount in situ hybridization). W pierwszej kolejności zarodek zostaje wyjęty z jaja i utrwalony w paraformaldehydzie. Następnie zarodek jest poddawany procedurom prehybrydyzacji. Kolejno przeprowadza się hybrydyzację zarodka z dwiema różnymi sondami: jedną sprzężoną z DIG, a drugą z FITC. Po nocnej hybrydyzacji zarodek inkubuje się z przeciwciałem sprzężonym z DIG. Następnie przeprowadza się reakcję barwną z substratem dla DIG, w wyniku której badany obszar przybiera kolor niebieski. Zarodek jest następnie inkubowany z przeciwciałem sprzężonym z FITC. Następnie przeprowadza się reakcję barwną dla FITC, w wyniku której badany obszar przybiera kolor czerwony. Na koniec zarodek zostaje utrwalony i przygotowany do fotografowania oraz cięcia na sekcje. Przedstawiono również przewodnik rozwiązywania problemów.

Protokół

Część 1: Fiksacja embrionów

1. Napełnić naczynie do sekcji lodowatym roztworem depc-PBS. Przechowywać w lodzie. Otworzyć jajo, uderzając w skorupkę pęsetą, a następnie usunąć odłamki skorupki.
2. Usunąć gęste albuminy za pomocą pęsety. Przechylić worek żółtkowy za pomocą pęsety grubościennej tak, aby embrion był skierowany ku górze.
3. Za pomocą nożyczek wyciąć kwadrat z worka żółtkowego wokół embrionu.
4. Za pomocą łyżeczki wyjąć embrion z żółtka i umieścić go w lodowatym roztworze depc-PBS.
5. Pod mikroskopem usunąć błony oraz żółtko i przenieść embrion do naczynia do fiksacji.
6. Przyszpilić preparat i usunąć depc-PBS. Zastąpić go 4% PFA w depc-PBS i fiksować przez noc w temperaturze 4°C.
7. Usunąć utrwalacz. Zastąpić go lodowatym roztworem depc-PBS. Za pomocą tępej igły mikrokapiilarnej lub noża do mikrodysekcji wykonać perforacje w obrębie układu nerwowego oraz jam serca, aby zapobiec uwięzieniu sondy.
8. Przemyć 2x przez 10 mn roztworem depc-PBS z 0,1% Tween-20 (PBT). Odwadniać przez 10 mn w kolejnych stężeniach metanolu w PBT: 25%, 50%, 75%. Odwadniać embriony dwukrotnie w 100% metanolu. Przechowywać w temperaturze -20°C w metanolu.

Część 2: Prehybrydyzacja

1. Rehydratuj zarodki przez 10 min każdy w 75%, 50% i 25% metanolu w PBT. Przemyj 2x po 10 min w PBT.
2. W międzyczasie przygotuj lodowaty utrwalacz (4% paraformaldehyd w PBT). Zastąp PBT roztworem proteinazy K (3 ml/fiolka; stężenie końcowe [5?g/ml] w PBT). Upewnij się, że cała zawartość fiolki ma kontakt z roztworem proteinazy K, delikatnie obracając fiolkę; czasy ekspozycji sprawdź w sekcji Rozwiązywanie problemów.
3. Za pomocą pipety Pasteura wolnej od RNaz usuń proteinazę K i dodaj utrwalacz (2 ml). Natychmiast umieść na lodzie dokładnie na 20 min.
4. Wszystkie płukania w temperaturze pokojowej wykonuje się na nutatorze. Przemyj 2x po 10 min w PBT oraz 1x przez 10 min w PBT zawierającym 50% buforu hybrydyzacyjnego.
5. Przemyj 1x w buforze hybrydyzacyjnym. Inkubuj w 65°C w 2 ml buforu hybrydyzacyjnego przez 4-5 godz.

Część 3: Hybrydyzacja zarodków z sondami

1. Synteza sond sprzężonych z DIG i FITC została opisana w dodatku. Sondę, od której oczekuje się silnego sygnału, należy zsyntetyzować z nukleotydów zawierających FITC; sondę słabszą należy zsyntetyzować z nukleotydów zawierających DIG.
2. Podgrzej wstępnie sondy w buforze do hybrydyzacji (każda w stężeniu 500 ng/ml), używając probówki o pojemności 2 ml. Bezzwłocznie zastąp bufor do hybrydyzacji roztworem sondy. Nie dopuść do wyschnięcia embrionów. Inkubuj przez 16 hr w temperaturze 65°C.
3. Zastąp sondę buforem do hybrydyzacji, wykonaj 2 płukania po 30 mn każde w temperaturze 65°C. Płucz przez 15 mn w roztworze bufor do hybrydyzacji/MABT (1/1 v/v/) w temperaturze 65°C.

Część 4: Inkubacja z przeciwciałami anty-DIG i reakcja barwna

1. Przemyć 2x po 20 mn w MABT. Przemyć przez 1 hr w 2% BBR/MABT. Przemyć przez 5 hr w 2% BBR/20%HISS/MABT (bufor blokujący). Inkubować z przeciwciałem anty-DIG w rozcieńczeniu 1:2000 w buforze blokującym, przez noc (O/N) w temperaturze 4°C na nutatorze.
2. Przemyć 3x po 10 mn w MABT, a następnie 3x po 1 hr w MABT.
3. Przemyć 2x po 20 mn w NTMT. Dodać 200ul substratu NBT/BCIP do 10 ml NTMT. Bezzwłocznie usunąć NTMT z probówki i zastąpić go 1-2 ml buforu NBT/BCIP. Przechowywać w ciemności. Monitorować reakcję barwną po 20 mn, a następnie w odstępach 20 mn.
4. Po wystąpieniu reakcji barwnej (powinien pojawić się kolor niebieski), przemyć w PBS przez 10 mn, przytwierdzić na szalce do fiksacji wypełnionej PBS i zastąpić roztwór 4% PFA w PBS. Utwierdzić przez noc (O/N) w temperaturze 4°C.
5. Przenieść do nowej probówki scyntylacyjnej. Przemyć w PBST (PBS z 1% Tween-20) 2x po 10 mn. Przemyć w MABT 2x po 10 mn.
6. Inkubować w MABT przez 30 mn w temperaturze 63°C.

Część 5: Inkubacja z przeciwciałem FITC i reakcja barwna

1. Przemywać 2x przez 10 mn w MABT, inkubować przez 1 hr w 2%BBR/MABT, a następnie przez 5 hr w buforze blokującym
2. Inkubować z przeciwciałem anty-FITC sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (1:500) przez noc (O/N) w 4°C.
3. Przemywać 3x po 10 mn w MABT, a następnie 3x po 1 hr w MABT.
4. Przemywać 2x przez 20 mn w TBS pH 8.45 z 0.1% Tween-20 (TBST).
5. Przygotować roztwór roboczy Vector Red (5 ml) w TBST, używając odczynników 1, 2 i 3 dołączonych do zestawu. Natychmiast usunąć TBST z fiolki i zastąpić go buforem Vector Red. Przechowywać w ciemności. Monitorować reakcję barwną po 40 mn, a następnie w odstępach co 30 mn.
6. Po wystąpieniu reakcji barwnej (powinien pojawić się kolor czerwony) przenieść embriony do PBS.

Część 6: Fixacja i przetwarzanie

1. Przenieść do naczynia do utrwalania zawierającego PBS i utrwalić w 4% PFA przez 20 mn w RT lub przez noc w 4°C.
2. Przemyć w PBS, 2x 10 mn. W celu przygotowania do fotografii przenieść do 20% glicerolu w PBS (sprawi to, że embriony staną się półprzezroczyste). Aby utworzyć komorę, wyciąć 2 paski taśmy PVC i nałożyć je na siebie na szkiełku. Za pomocą skalpela wyciąć kwadrat w centrum. Usunąć kwadrat pęsetą.
3. W celu przygotowania do cięcia w wosku przenieść z powrotem do PBS, przemyć 2x 10 mn, a następnie odwodnić w stopniowanych seriach metanolu (25%, 50%, 75% i 100% w PBS, po 10 mn każda).
4. Zastąpić propanolem, 3mn. Zastąpić 1,2,3,4-tetrahydronaftalenem, 20 mn, a następnie Histoclear (2x 1 h). Zastąpić mieszaniną Histoclear/wosk 1/1 (v/v) w 60°C przez 1 h. Zastąpić woskiem i przetworzyć do badania histologicznego.

Część 7: Roztwory

Bufor do hybrydyzacji, przechowywać w -20°C w probówce Falcon, 50 ml: 25 ml formamidu; 3,25 ml (20xSSC); 0,5 ml (0,5M EDTA); 1 ml (10% Tween-20); 2,5 ml (1% SDS); 125 ul (20mg/ml tRNA); 100ul (50 mg/ml heparyny). MABT, przygotować 100mM kwasu maleinowego; dostosować pH do 7,5 za pomocą granulek NaOH. Dodać 150mM NaCl i 0,1% Tween-20.

NTMT (przygotowany bezpośrednio przed użyciem), 50 ml: 1ml (5M NaCl); 2,5 ml (2M Tris-HCl pH9,5); 1,25 ml (2M MgCl₂); 5 ml (10% Tween-20).

TBST: 0.1M Tris-HCl, 0.15M NaCl, pH 8.45, 0.1% Tween-20.

Część 8: Rozwiązywanie problemów

Problem	Przyczyna	Rozwiązanie
Zwinięty zarodek	Niewystarczająca dehydratacja/rehydratacja	Zachowanie 10 mn odstępów podczas kolejnych etapów dehydratacji/rehydratacji
Brak sygnału sondy	Sonda uległa degradacji z powodu zanieczyszczenia fiolki RNazą	Przeprowadzić elektroforezę sondy na 1% żelu agarozowym. Upewnić się, że cała zawartość fiolki ma kontakt z roztworem Proteinazy K w kroku 2
Sonda znakuje jamy serca i cewkę nerwową	Sonda została uwięziona	W kroku 2 należy upewnić się, że wszystkie jamy zostały przebite za pomocą noża do mikrodisekcji lub mikrokapilary
Zarodek uległ dezintegracji po hybrydyzacji (krok 3)	Zbyt długi czas inkubacji z Proteinazą K. Temperatura hybrydyzacji jest zbyt wysoka	Proteinaza K nie powinna być pozostawiona dłużej niż 1 mn (stadia 3+ i 4), 2 mn (stadia 5 do 7), 3 mn (stadia 8-10), 4 mn (stadia 11-13). Nie przeprowadzać hybrydyzacji w temperaturze To wyższej niż 65 o C

Część 9: Reprezentatywne wyniki

Poniżej przedstawiono reprezentatywne zarodki: (A) Zarodek (stadium HH7) znakowany sondą DIG-Sox (niebieski) i sondą FITC-delta-1 (czerwony). (B) Zarodek (stadium HH8) znakowany sondą DIG-Pax6 (niebieski) i sondą FITC-Shh (czerwony). Nf, fałd neuronalny, anp, przednia płytka neuronalna, psm, mezoderma presomityczna, n, notochorda, nt, cewka neuronalna). Sondy otrzymane w prezencie z laboratoriów dr C. Tabina, dr M. Goulding, dr D. Henrique oraz dr J. Briscoe.

Dyskusja

Metoda dwukolorowej hybrydyzacji in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization) jest stosowana do określania przestrzennych i czasowych wzorców ekspresji jednego lub dwóch wybranych genów. Zastosowania obejmują ocenę wzorców ekspresji nowych genów (np. ^1,2), a także zmiany w ekspresji genów po oddziaływaniach czynnikami zewnętrznymi (manipulacje embrionalne ³, mikro-koraliki ⁴ oraz elektroporacja konstruktów RNA lub DNA ⁵).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jaja	Zwierzę	Charles River Laboratories	Premium Fertile
Stereomikroskop	Mikroskop	Leica Microsystems	MZ9.5
Automatyczny inkubator Marsh	Narzędzie	Lyon	RX
Inkubator do hybrydyzacji	Narzędzie	Hybaid	Micro-4
Mieszalnik orbitalny Adams Nutator	Narzędzie	Fisher Scientific	14-062
Pinceta zakrzywiona (1)	Narzędzie	Electron Microscopy Sciences	72991-4C
Nożyczki precyzyjne	Narzędzie	Fine Science Tools	14161-10
Łyżeczka	Narzędzie	Fine Science Tools	10370-18
Kapilarna pipeta Pasteura		Electron Microscopy Sciences	70950-12
Rurka mikrokapilarna		Sigma-Aldrich	P1049-1PAK	Wyciągnąć za pomocą pionowego wyciągacza mikrokapilar; stępić koniec precyzyjną pincetą
Nóż do mikrodysekcji		Fine Science Tools	10056-12	Użyć do nakłucia jam przed hybrydyzacją in situ
Szpilki Minuten, średnica 0.2mm		Fine Science Tools	26002-20	Przechowywać szpilki razem za pomocą mieszadła magnetycznego;
Sylgard 184 silikonowy elastomer, utwardzacz i baza	Odczynnik	Dow Corning	0001986475	Wymieszać 1 część utwardzacza i 9 części bazy; pozostawić na noc w 37°C
Diethylopirokarbonian (depc)	Odczynnik	Acros Organics	10025025	Dodać 1ml depc do 1l PBS; wstrząsnąć; autoklawować
16% PFA	Odczynnik	Electron Microscopy Sciences	15710
Tween-20	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
Proteinaza K		Sigma-Aldrich	P2308-5MG	Roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml w depc-H₂O w aliquotach 10µl. Przechowywać w -20°C.
Formamid, dejonizowany	Odczynnik	Ambion	9342
tRNA drożdżowa-25 mg	Odczynnik	Invitrogen	15401-011	Roztwór zapasowy o stężeniu 20 mg/ml w depc-H₂O w aliquotach 125µl. Przechowywać w -20°C
Sól sodowa heparyny	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H4784-250MG	Roztwór zapasowy o stężeniu 50 mg/ml w depc-H₂O w aliquotach 100µl. Przechowywać w -20°C.
SSC x20 pH5.5	Odczynnik	Fisher Scientific	PR-V4261
EDTA (0.5M)	PR-V4231	Fisher Scientific
SDS	Odczynnik	Fisher Scientific	BP166-100
Kwas maleinowy	Odczynnik	Fluka	63189
B–hringer Blocking Reagent	Odczynnik	Roche Group	11096176001	Stosować w stężeniu 2% w MABT. Aby przygotować, podgrzewać z MABT przez 20 min w 60°C. Można przygotować roztwór zapasowy i przechowywać w aliquotach 1-5 ml w 20°C.
Surowica owcza inaktywowana ciepłem	Odczynnik	Jackson ImmunoResearch	013-000-121	Rozpuścić w 10 ml H₂O; podgrzewać w 55°C przez 30 min. Alikwotować po 1ml, -20°C.
Anti-Digoxigenin-AP, fragmenty Fab	Odczynnik	Roche Group	11093274910
Roztwór zapasowy NBT/BCIP	Odczynnik	Roche Group	11681451001
Anti-Fluorescein-AP, fragmenty Fab	Odczynnik	Roche Group	11426338910
2M Tris	BP1759-500	Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit	Odczynnik	Vector Laboratories	SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaftalen	Odczynnik	Sigma-Aldrich	429325-100ML	Pod wyciągiem (dygestorem)