Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

Podsumowanie

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Streszczenie

Neurony w ludzkim mózgu stają się postmitotyczne głównie w trakcie rozwoju prenatalnego, w związku z czym zachowują swoje jądra przez cały okres życia. Niemniej jednak niewiele wiadomo na temat zmian w chromatynie neuronalnej i organizacji jądrowej w przebiegu rozwoju i starzenia się, a także w przewlekłych chorobach neuropsychiatrycznych. Do tej pory większość analiz opartych na chromatynie i DNA (z wyjątkiem metody FISH) nie posiadała rozdzielczości na poziomie pojedynczych komórek. W tym kontekście znaczna heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie, ponieważ zazwyczaj różne subpopulacje neuronów są wymieszane z różnymi typami gleju i innymi komórkami nieneuronalnymi. Jednym z możliwych rozwiązań byłoby hodowanie kultur specyficznych dla danego typu komórek, jednak większość komórek OUN, w tym neurony, jest w warunkach ex vivo utrzymywalna w najlepszym przypadku przez zaledwie kilka tygodni, co stanowiłoby niepełny model mechanizmów epigenetycznych potencjalnie działających przez cały okres życia. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół ekstrakcji i oczyszczania jąder z zamrożonego (nigdy nieutrwalonego) ludzkiego mózgu pobranego po śmierci. Metoda ta obejmuje ekstrakcję jąder w hipotonicznym buforze lizującym, a następnie ultrawirowanie i immunoznakowanie przeciwciałem anty-NeuN. Znakowane jądra neuronalne są następnie oddzielnie zbierane przy użyciu sortowania aktywowanego fluorescencją. Metoda ta powinna być możliwa do zastosowania w każdym regionie mózgu u szerokiego spektrum gatunków i odpowiednia do badań immunoprecypitacji chromatyny z użyciem przeciwciał antyhistonowych specyficznych dla miejsca i modyfikacji, a także do analiz metylacji DNA i innych testów.

Protokół

Ekstrakcja jąder komórkowych

1. Umieść 250 mg zamrożonej tkanki mózgowej pobranej po śmierci w 5 mL buforu do lizy (Lysis Buffer¹ ) w homogenizatorze typu douncer i umieść go na lodzie. Aby otrzymać około 5 milionów jąder po sortowaniu FACS, zazwyczaj używamy 1000 mg tkanki na próbkę.
2. Po rozmrożeniu tkanki homogenizuj ją w douncerze przez 1 minutę na lodzie.
3. Przenieś zhomogenizowaną tkankę do przezroczystej probówki do ultrawirówki o pojemności 15 mL. Umieść probówkę na lodzie.
4. Pobierz pipetą 9 mL roztworu sacharozy (Sucrose Solution²), wprowadź końcówkę pipety na dno przezroczystej probówki do ultrawirówki i powoli uwolnij roztwór sacharozy (Sucrose Solution²), aby stworzyć gradient stężeń z zhomogenizowaną tkanką w górnej warstwie nad roztworem sacharozy (Sucrose Solution²).
5. Zważ probówki do ultrawirówki, aby upewnić się, że będą one zrównoważone podczas wirowania w ultrawirówce. W razie potrzeby skoryguj wagę, dodając bufor do lizy (Lysis Buffer¹) do górnej warstwy.
6. Po zważeniu probówek umieść je w koszyczkach rotora.
7. Włóż wszystkie koszyczki do rotora SW28, a następnie ostrożnie umieść rotor w ultrawirówce.
8. Wiruj próbki w ultrawirówce przy 107163.6 RCF przez 2,5 godziny w temperaturze 4°C.
9. Po zakończeniu wirowania usuń nadpływ wraz z warstwą zanieczyszczeń znajdującą się w gradiencie stężeń za pomocą odkurzacza próżniowego, uważając, aby nie naruszyć osadu zawierającego jądra na dnie probówki.
10. Dodaj 500 µL 1X PBS do każdego osadu i pozostaw na lodzie na 20 minut. Pozwala to osadowi częściowo rozpuścić się samoistnie, co ułatwia jego późniejsze mechaniczne rozbicie poprzez pipetowanie w górę i w dół, zmniejszając tym samym stres poddawane jądra.
11. Po inkubacji jąder na lodzie przez 20 minut, mechanicznie pipetuj w górę i w dół, aby całkowicie rozpuścić jądra w 1X PBS.
12. Przenieś roztwór zawierający jądra z probówek do ultrawirówki i połącz zawartość dwóch probówek w jednej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL. Ponownie umieść próbki na lodzie.

Immunobarwienie do analizy FACS

1. Na tym etapie przygotować mieszaninę do immunobarwienia składającą się z przeciwciał pierwszo- i drugorzędowych oraz mieszaniny blokującej (Blocking Mix). Dla każdej próbki połączyć 300 µL 1XPBS zawierającego 1,2 µL przeciwciała NeuN, 100 µL Blocking Mix (zawierającego 0,5% BSA i 10% normalnego surowicy koziej w 1XPBS) oraz 1 µL Alexa Fluor 488. W przypadku próbek kontrolnych pominąć przeciwciało pierwszorzędowe NeuN, dodając w jego miejsce odpowiednią ilość 1XPBS.
2. Mieszaninę do immunobarwienia wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
3. Podczas inkubacji mieszaniny barwiącej przygotować kontrole dla próbek. Do sortowania FACS wymagana jest próbka zawierająca same jądra komórkowe, zwana „kontrolą niebarwioną”, oraz druga próbka – kontrola negatywna – zawierająca jądra z przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488, ale bez przeciwciała pierwszorzędowego NeuN.
4. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL zawierającej 1XPBS odpipetować 20 µL roztworu z jądrami komórkowymi dla kontroli niebarwionej, a kolejne 20 µL do drugiej probówki o pojemności 2 mL zawierającej 980 uL 1XPBS dla kontroli negatywnej. Objętość próbki z jądrami uzupełnić do 1 mL za pomocą 1XPBS. Wszystkie próbki umieścić ponownie w lodzie.
5. Po zakończeniu inkubacji mieszaniny do immunobarwienia dodać jej zawartość (401 µL) do odpowiednich próbek. Próbka z jądrami otrzyma mieszaninę zawierającą zarówno NeuN, jak i Alexa Fluor 488, natomiast próbka negatywna otrzyma mieszaninę zawierającą tylko przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 488.
6. Przenieść próbki do pomieszczenia chłodniczego w celu rotacji w ciemności przez 45 minut.
7. Po 45-minutowej inkubacji próbek w ciemności umieścić je w lodzie i przetransportować do pracowni FACS. Podczas transportu do pracowni FACS próbki należy przechowywać w lodzie i w ciemności.

FACS

1. W laboratorium FACS przefiltrować próbki przez filtr 40 µm. Następnie, utrzymując je w niskiej temperaturze, przepuścić je przez urządzenie przez kilka minut, aby uzyskać wstępne dane przed sortowaniem.
2. Na tym etapie konieczne jest ustawienie odpowiednich bramek (gates) wymaganych do sortowania. Do sortowania próbek wykorzystuje się kilka różnych bramek. Pierwsza bramka pozwala określić rozmiar poszczególnych jąder znajdujących się w próbce i umożliwia oddzielenie debris od właściwych jąder. Druga bramka pozwala na sortowanie poszczególnych jąder. Na tym etapie odrzuca się wszelkie agregaty. Wreszcie trzecią bramkę ustawia się na konkretną długość fali fluorescencji, odpowiadającą fluorochromowi zawartemu w przeciwciałach wtórnych. Ustawienie tej bramki pozwala na sortowanie i oddzielenie jąder NeuN +, czyli jąder neuronalnych, od jąder NeuN -.
3. Po wybraniu wszystkich bramek można przystąpić do sortowania jąder do 1XPBS.
4. Po przepuszczeniu całej próbki należy sprawdzić czystość sortowania, przepuszczając przez urządzenie alikwot posortowanej próbki. Należy upewnić się, że fluorescencja próbki nie jest rozproszona, lecz skupiona w jednym kwadrancie. Zaleca się wybór próbek o czystości powyżej 90%.

Po FACS

1. Po posortowaniu próbki można rozpocząć przetwarzanie jąder. Do 10 mL posortowanej próbki należy dodać 2 mL roztworu sacharozy², 50 uL 1M CaCl₂ oraz 30 ul 1m Mg(Ace)₂. Przypominamy, aby próbkę zawsze przechowywać w lodzie, ponieważ jądra nie są utrwalone.
2. Jeśli objętość posortowanej próbki jest mniejsza niż 10 mL, należy uzupełnić ją do 10 mL za pomocą 1XPBS lub odpowiednio dostosować ilość dodawanych odczynników.
3. Próbkę należy kilkakrotnie odwrócić i pozostawić w lodzie na 15 minut.
4. Po 15-minutowej inkubacji próbek w lodzie, należy je odwirować w rotorze z koszyczkami odchylanymi przy 1786 RCF przez 15 minut w temperaturze 4^°C.
5. Nadpływ należy usunąć za pomocą odsysacza, uważając, aby nie naruszyć białego osadu znajdującego się na dnie probówki.
6. Osad należy rozpuścić w 200 µl roztworu wymaganego do dalszych eksperymentów, pipetując go w górę i w dół.
7. Roztwór należy przenieść do mniejszej probówki i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół powinien być szczególnie użyteczny w badaniach skoncentrowanych na zmianach epigenetycznych chromatyny neuronalnej, a szerzej, na fenotypie molekularnym jądra neuronalnego podczas normalnego rozwoju i starzenia się lub w przebiegu chorób neurologicznych bądź psychiatrycznych. Metoda ta jest szczególnie korzystna w sytuacjach, gdy problemem jest heterogenność komórkowa tkanki mózgowej, w tym potencjalne zmiany w stosunku neuronów do gleju w procesie starzenia lub w wyniku choroby ¹....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki:	1. Bufor lizujący
0,32 M	Sacharoza	5,47 g
5 mM	CaCl22	250 μl
3 mM	octan Mg2	150 μl
0,1 mM	EDTA	10 μl
10 mM	Tris-HCl, pH 8	500 μl
1 mM	DTT	17 μL
0.1%	Triton X-100	50 μl
Dopełnić objętość do 50 ml wodą autoklawowaną

2. Roztwór sacharozy1,8 MSacharoza30,78 g3 mM octan Mg₂150 μl1 mMDTT17 μl10 mMTris-HCl, pH 8500 μlDopełnić objętość do 50 ml wodą autoklawowaną3. Bufor Dounce'a10 mMTris0,242 g4 mMMgCl₂₂0,163 g1 mMCaCl2₂0,03 gDostosować pH do wartości 7,5 i uzupełnić objętość do 200 ml wodą autoklawowaną