Izolacja jąder neuronalnych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej

Summary

Niejednorodność komórkowa tkanki mózgowej stanowi znaczące ograniczenie dla badania znaczników epigenetycznych w chromatynie, ponieważ większość testów nie ma rozdzielczości pojedynczej komórki. Neurony zazwyczaj mieszają się z komórkami glejowymi i innymi komórkami nieneuronalnymi. Udostępniamy protokół ekstrakcji i pobierania jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Abstract

Neurony w ludzkim mózgu stają się postmitotyczne głównie podczas rozwoju prenatalnego, a tym samym utrzymują swoje jądra przez cały okres życia. Jednak niewiele wiadomo na temat zmian w chromatynie neuronalnej i organizacji jąder w trakcie rozwoju i starzenia się lub w przewlekłej chorobie neuropsychiatrycznej. Jednak do tej pory większość testów opartych na chromatynie i DNA (innych niż FISH) nie ma rozdzielczości pojedynczej komórki. W tym celu znaczna heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie, ponieważ zazwyczaj różne subpopulacje neuronów są mieszane z różnymi typami komórek glejowych i innych komórek nieneuronalnych. Jednym z możliwych rozwiązań byłoby hodowanie kultur specyficznych dla typu komórki, ale większość komórek OUN, w tym neurony, jest w najlepszym razie zrównoważona ex vivo tylko przez kilka tygodni, a zatem stanowiłaby niekompletny model mechanizmów epigenetycznych potencjalnie działających przez cały okres życia. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekstrakcji i oczyszczania jąder z zamrożonego (nigdy nie ustalonego) ludzkiego mózgu pośmiertnego. Metoda polega na ekstrakcji jąder w hipotonicznym buforze do lizy, a następnie ultrawirowaniu i immunoznakowaniu przeciwciałem anty-NeuN. Znakowane jądra neuronalne są następnie zbierane oddzielnie za pomocą sortowania aktywowanego fluorescencją. Metoda ta powinna mieć zastosowanie do każdego obszaru mózgu w szerokim zakresie gatunków i być odpowiednia do badań immunoprecypitacji chromatyny z przeciwciałami antyhistonowymi specyficznymi dla miejsca i modyfikacji oraz do metylacji DNA i innych testów.

Protocol

Ekstrakcja jąder

1. Umieść 250 mg zamrożonej pośmiertnej tkanki mózgowej w 5 ml buforu do lizy¹ w leżaku i umieść go na lodzie. Aby otrzymać około 5 milionów jąder po sortowaniu FACS, zwykle używamy 1000 mg tkanki na próbkę.
2. Gdy tkanka się rozmrozi, odbijaj ją przez 1 minutę na lodzie.
3. Weź homogenizowaną tkankę i umieść ją w 15 ml przezroczystej probówce do ultrawirówki. Połóż rurkę na lodzie.
4. Weź 9 ml roztworu sacharozy² za pomocą pipety, umieść pipetę na dnie przezroczystej probówki ultrawirówki i uwolnij roztwór sacharozy², aby utworzyć gradient stężeń z homogenizowanym roztworem tkankowym na wierzchu roztworu sacharozy².
5. Zważ probówki ultrawirówkowe, aby upewnić się, że wszystkie będą wyważone podczas obracania się w ultrawirówce. Dokonaj dowolnych korekt wagi, dodając bufor do lizy¹ do górnej warstwy.
6. Po zważeniu rur umieść je w wiadrach wirnika.
7. Umieść wszystkie wiadra w wirniku SW28 i ostrożnie umieść wirnik w ultrawirówce.
8. Ultraodwirować próbki w temperaturze 107163.6 RCF przez 2,5 godziny w temperaturze 4°C.
9. Po zakończeniu wirowania należy usunąć supernatant wraz z warstwą zanieczyszczeń znajdujących się w gradiencie stężeń za pomocą próżni, uważając, aby nie naruszyć osadu zawierającego jądra na dnie probówki.
10. Dodaj 500 μl 1X PBS do każdej granulki i pozostaw na lodzie na 20 minut. Dzięki temu osad może się nieco rozpuścić samodzielnie, co ułatwia późniejsze mechaniczne rozpuszczenie go poprzez pipetowanie w górę iw dół, co zmniejsza ilość naprężeń, jakich doświadczają jądra.
11. Po inkubacji jąder na lodzie przez 20 minut, mechanicznie pipetować w górę iw dół, aby całkowicie rozpuścić jądra w ciągu 1XPBS.
12. Usunąć roztwór zawierający jądra z probówek ultrawirówek i połączyć zawartość dwóch probówek w jedną probówkę do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Ponownie umieść próbki na lodzie.

Barwienie immunologiczne dla FACS

1. W tym momencie przygotuj mieszaninę immunologiczną składającą się z przeciwciała pierwszorzędowego i wtórnego oraz mieszanki blokującej. Dla każdej próbki połącz 300 μl 1XPBS zawierającego 1,2 μl przeciwciała NeuN, 100 μl mieszanki blokującej, która zawiera 0,5% BSA i 10% normalnej surowicy koziej w 1XPBS i 1 μl Alexa Fluor 488. W przypadku próbek kontrolnych należy wykluczyć przeciwciało pierwszorzędowe NeuN i zamiast tego po prostu dodać więcej 1XPBS.
2. Zwiruj mieszaninę immunobarwiającą i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
3. Podczas inkubacji mieszaniny barwiącej należy przeprowadzić kontrole dla próbek. Do sortowania FACS potrzebna jest próbka zawierająca same jądra, zwana "niebarwioną kontrolą"; potrzebna jest również druga próbka, kontrola ujemna, zawierająca jądra z przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 bez przeciwciała pierwszorzędowego NeuN.
4. Podwielokrotność 20 μl jąder zawierających roztwór do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1XPBS do kontroli niebarwionej i kolejne 20 μl do innej probówki o pojemności 2 ml zawierającej 980 μl 1XPBS do kontroli ujemnej. Zwiększyć objętość próbki zawierającej jądra z powrotem do 1 ml za pomocą 1XPBS. Wszystkie próbki umieszcza się z powrotem na lodzie.
5. Teraz, gdy mieszanina do barwienia immunologicznego zakończyła inkubację, dodaj jej zawartość 401 μl do odpowiednich próbek. Próbka jąder otrzyma mieszaninę zawierającą zarówno NeuN, jak i Alexa Fluor 488, podczas gdy próbka ujemna otrzyma mieszaninę zawierającą tylko przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 488.
6. Próbki należy przenieść do chłodni, aby obracały się w ciemności przez 45 minut.
7. Po inkubacji próbek w ciemności przez 45 minut, umieścić je na lodzie i przywieźć do zakładu FACS. Podczas transportu do zakładu FACS próbki powinny być przechowywane na lodzie i w ciemności.

FACS

1. W zakładzie FACS przefiltrować próbki przez filtr o średnicy 40 um. Następnie przepuść je przez urządzenie przez kilka minut, trzymając je w niskiej temperaturze, aby uzyskać wstępne dane przed sortowaniem.
2. W tym momencie konieczne jest ustawienie odpowiednich bramek wymaganych do sortowania. Do sortowania próbek używa się kilku różnych bramek. Pierwsza bramka daje wyobrażenie o rozmiarach różnych jąder znalezionych w próbce i pozwala na oddzielenie szczątków od rzeczywistych jąder. Druga bramka pozwala nam sortować jądra indywidualnie. Odrzuć wszystkie agregaty są odrzucane w tym momencie. Wreszcie trzecia bramka jest ustawiona na określoną długość fali fluorescencji, pasującą do fluorochromu znajdującego się w naszym przeciwciałie drugorzędowym. Umieszczenie tej bramki pozwala nam sortować i oddzielać NeuN+, a więc jądra neuronalne od NeuN - jąder.
3. Po wybraniu wszystkich bramek, jądra można posortować do 1XPBS.
4. Po przejściu całej próbki należy sprawdzić czystość sortowania, przepuszczając podwielokrotność posortowanej próbki przez urządzenie. Upewnij się, że fluorescencja próbki nie jest rozproszona, ale raczej zawarta w jednym kwadrancie. Najlepiej wybierać próbki, które są czyste w ponad 90%.

Po FACS

1. Po posortowaniu próbki można rozpocząć przetwarzanie jąder. Weź 10 ml posortowanej próbki i dodaj do niej 2 ml roztworu sacharozy², 50 μl 1M CaCl₂ i 30 μl 1 Mg (Ace)₂. Przypominamy, że zawsze należy trzymać próbkę na lodzie, ponieważ jądra są nieunieruchomione.
2. Jeśli posortowana próbka jest mniejsza niż 10 ml, zwiększ objętość do 10 ml, dodając 1XPBS lub odpowiednio dostosuj dodatkowe materiały.
3. Odwrócić próbkę kilka razy i umieścić ją na lodzie na 15 minut.
4. Po 15 minutach inkubacji próbek na lodzie, należy je odwirować w wirniku kubełkowym z odchylanym wirnikiem o temperaturze 1786 RCF przez 15 minut w temperaturze 4^°C.
5. Odrzucić supernatant za pomocą próżni, nie naruszając białego osadu znajdującego się na dnie probówki.
6. Rozpuść osad w 200 μl dowolnego roztworu, który jest potrzebny do przeprowadzenia eksperymentów, a następnie pipetuj w górę i w dół.
7. Przenieś roztwór do mniejszej probówki i umieść go w zamrażarce w temperaturze -80°C do dalszego użycia.

Discussion

Przedstawiony tutaj protokół powinien być szczególnie przydatny w badaniach skoncentrowanych na zmianach epigenetycznych chromatyny neuronalnej oraz, bardziej ogólnie, na fenotypie molekularnym jądra neuronalnego, podczas normalnego rozwoju i starzenia się lub w chorobie neurologicznej lub psychiatrycznej. Metoda ta jest szczególnie korzystna, gdy problemem jest niejednorodność komórkowa tkanki mózgowej, w tym potencjalne zmiany w proporcji neuronów do gleju w trakcie starzenia się lub z powodu choroby ¹. Na p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynniki: 1. Bufor do lizy 0,32M sacharoza 5,47 g 5 mM CaCl2 250 μ l 3 mM Mg(Octan)2 150 μ l 0,1 mM EDTA 10 μ l 10mM Tris-HCl, pH8 500 μ l 1 mM DTT 17 μ l 0.1% Triton X-100 50 μ l Dostosuj objętość do 50 ml za pomocą autoklawizowanej wody 2. Roztwór sacharozy 1,8 M Sacharoza 30,78 g 3 mM Mg(octan)2 150 μ l 1 mM DTT 17 μ l 10 mM Tris-HCl, pH8 500 μ l Dostosuj objętość do 50 ml za pomocą autoklawizowanej wody 3. Bufor odcinowy 10 mM Tris 0,242 g 4 mM MgCl2 0,163 g 1 mM CaCl2 0,03 g Dostosuj pH do 7,5 i objętość do 200 ml za pomocą wody autoklawizowanej