Artykuł metodologiczny

Immunoprecypitacja metylowanego DNA

DOI:

10.3791/935

⸱

2 stycznia 2009

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Genetics and Developmental Biology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC, 4Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 5Department of Medical Genetics, Life Sciences Institute,, University of British Columbia - UBC

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten film demonstruje protokół immunoprecypitacji metylowanego DNA (MeDIP). MeDIP to dwudniowa procedura, która selektywnie ekstrahuje metylowane fragmenty DNA z próbki genomowego DNA przy użyciu przeciwciał o swoistości dla 5-metylocytozyny (anty-5 mC).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Identyfikacja wzorców metylacji DNA jest powszechną procedurą w badaniach epigenetyki, ponieważ wiadomo, że metylacja ma znaczący wpływ na ekspresję genów i jest zaangażowana w prawidłowy rozwój, a także chorobę 1-4. W związku z tym zdolność do rozróżniania między metylowanym DNA a niemetylowanym DNA jest niezbędna do generowania profili metylacji dla takich badań. Immunoprecypitacja metylowanego DNA (MeDIP) jest skuteczną techniką ekstrakcji metylowanego DNA z próbki będącej przedmiotem zainteresowania 5-7. Próbka o długości zaledwie 200 ng DNA jest wystarczająca do reakcji przeciwciała lub immunoprecypitacji (IP). DNA jest sonikowane na fragmenty o wielkości od 300 do 1000 pz i jest dzielone na części immunoprecypitowane (IP) i wejściowe (IN). DNA IP jest następnie denaturowane termicznie, a następnie inkubowane z anty-5'mC, co pozwala przeciwciału monoklonalnemu na związanie metylowanego DNA. Następnie dodaje się kulki magnetyczne zawierające przeciwciało wtórne o powinowactwie do przeciwciała pierwszorzędowego i inkubuje się. Te przeciwciała połączone kulkami zwiążą przeciwciało monoklonalne użyte w pierwszym etapie. DNA związane z kompleksem przeciwciał (metylowane DNA) jest oddzielane od reszty DNA za pomocą magnesu w celu wyciągnięcia kompleksów z roztworu. Następnie wykonuje się kilka płukań przy użyciu bufora IP w celu usunięcia niezwiązanego, niemetylowanego DNA. Metylowane kompleksy DNA/przeciwciała są następnie trawione proteinazą K w celu trawienia przeciwciał, pozostawiając nienaruszone tylko zmetylowane DNA. Wzbogacone DNA jest oczyszczane przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową w celu usunięcia materii białkowej, a następnie wytrącane i ponownie zawieszane w wodzie w celu późniejszego wykorzystania. Techniki PCR można wykorzystać do walidacji skuteczności procedury MeDIP poprzez analizę produktów amplifikacji DNA IP i IN dla regionów, o których wiadomo, że nie mają sekwencji metylowych i o których wiadomo, że je zawierają. Oczyszczone metylowane DNA może być następnie wykorzystane do badań metylacji specyficznych dla locus (PCR) lub całego genomu (mikromacierz i sekwencjonowanie) i jest szczególnie przydatne, gdy jest stosowane w połączeniu z innymi narzędziami badawczymi, takimi jak profilowanie ekspresji genów i porównawcza hybrydyzacja genomu macierzy (CGH) 8. Dalsze badania nad metylacją DNA doprowadzą do odkrycia nowych celów epigenetycznych, co z kolei może być przydatne w opracowywaniu nowych narzędzi terapeutycznych lub prognostycznych dla chorób takich jak rak, które charakteryzują się nieprawidłowo metylowanym DNA 2, 4, 9-11.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EKSTRAKCJA DNA I PRZYGOTOWANIE PRÓBKI

DNA z różnych próbek (hodowane komórki, świeżo mrożone, a także tkanki zatopione w parafinie utrwalonej w formalinie) mogą być używane do MeDIP. Ważne jest, aby używać wysoce oczyszczonego DNA bez powiązanych białek, takich jak histony. Ważne jest również, aby usunąć jak najwięcej RNA z próbki, ponieważ może to zakłócać zarówno kwantyfikację DNA, jak i wiązanie przeciwciał. Ilość DNA użytego do MeDIP może wynosić od 200 ng do 1 μg, w zależności od ilości dostępnego DNA. Aby zademonstrować ten protokół, zostanie użyty 1 μg DNA. Poniższy protokół zapewni wysokiej jakości dwuniciowe DNA z hodowanych komórek. Do ekstrakcji DNA z innych typów próbek należy zastosować inne protokoły.

  1. Dodać 400 μl buforu wytrawiającego do osadu komórkowego w probówce Eppendorfa o pojemności 1,7 ml.
  2. Dodać 100 μg proteinazy K do probówki i inkubować przez noc w temperaturze 50°C.
  3. Dodać 500 μl fenolu o pH 7 i delikatnie, ale dokładnie wymieszać, odwracając.
  4. Wirować z prędkością 13 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usuń frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  6. Powtórz kroki od 3 do 5 jeden raz.
  7. Dodać 500 μl 1:1 fenolu/chloroformu o pH 7 i delikatnie, ale dokładnie wymieszać, odwracając.
  8. Wirować z prędkością 13 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Usuń frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  10. Dodać 40 μg RNazy A i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
  11. Dodać 500 μl fenolu o pH 7 i delikatnie, ale dokładnie wymieszać, odwracając.
  12. Wirować z prędkością 13 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Usuń frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  14. Powtórz kroki od 11 do 13 jeden raz.
  15. Dodać 500 μl 1:1 fenolu/chloroformu o pH 7 i delikatnie, ale dokładnie wymieszać, odwracając.
  16. Wirować z prędkością 13 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  17. Usuń frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  18. Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu (40 μl) i dobrze wymieszać.
  19. Dodać 2 objętości (900 μl) 100% etanolu, dobrze wymieszać i umieścić w temperaturze -20°C na 20 minut.
  20. Wirować z prędkością 13 000 g przez 20 minut w temperaturze 4°C.
  21. Usuń etanol, wiruj pulsacyjnie i usuń resztki etanolu.
  22. Dodaj 500 μl zimnego 70% etanolu do umycia. Wirować z prędkością 13 000 g przez 20 minut w temperaturze 4°C.
  23. Usuń 70% etanolu, wiruj pulsacyjnie i usuń resztki etanolu przez pipetowanie.
  24. Wysuszyć granulkę na powietrzu z otwartą nakrętką przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady pozostałości etanolu.
  25. Zawiesić DNA w 50 μl wysterylizowanego dH2O przez noc w temperaturze 4°C.
  26. Określ ilościowo DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Stosunek A260:A 280 wynoszący 1,8 jest idealny.
  27. Określ jakość i zakres wielkości DNA na żelu agarozowym za pomocą drabinki 100 pz. Zaledwie 10 ng genomowego DNA można przepuścić na 1,7% żelu agarozowym, a następnie wybarwić przy użyciu barwnika, który jest bardzo wrażliwy na niewielkie ilości DNA, takiego jak SYBR Gold.
  28. W jednej silikonowanej probówce na próbkę przygotować 1 μg DNA o łącznej objętości 50 μl, a pozostałą część objętości uzupełnić wysterylizowanymdH 2O.

SONIKACJA DNA

Sonikacja DNA i protokół MeDIP muszą być wykonywane w silikonowych probówkach, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek ze ściankami probówki. Optymalne czasy sonikacji dla próbek DNA opierają się na stopniu fragmentacji próbki DNA określonym za pomocą elektroforezy żelowej (Krok 27). Na przykład DNA wyekstrahowane z hodowanych komórek powinno mieć bardzo dużą masę cząsteczkową, a następnie będzie wymagało większej sonikacji niż DNA wyekstrahowane z próbek archiwalnych, które często są częściowo zdegradowane. Jeżeli próbki mają jednolicie wysoką masę cząsteczkową, w tym momencie uzasadnione jest przeprowadzenie sonikacji zgodnie z opisem w niniejszym protokole bez sprawdzania każdej próbki z osobna. Jeśli próbki są rozdrobnione, tak jak w przypadku próbek archiwalnych, konieczne będzie dostosowanie procedury sonikacji, prawdopodobnie poprzez skrócenie czasu sonikacji w celu uzyskania fragmentów o długości 300-100 pz. Jeśli spodziewasz się przetwarzania próbek, które są częściowo zdegradowane, optymalizację parametrów sonikacji można przeprowadzić na próbce reprezentatywnej spośród tych, które są przedmiotem zainteresowania. Opierając się na stopniu fragmentacji DNA zaobserwowanym w elektroforezie żelowej (Krok 27), eksperymentator może z góry określić optymalny czas sonikacji dla próbki. W tym miejscu opisujemy metodę uzyskiwania fragmentów DNA o długości 300-1000 pz metodą sonikacji za pomocą automatycznego urządzenia sonizującego (Bioruptor firmy Diagenode, UCD-200 TM) przy użyciu DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.

  1. Woda w Biorupter musi mieć temperaturę 4°C.
  2. Sonicate przez 7 minut na ustawieniach automatycznych (30 sekund włączone, 30 sekund wyłączone przy maksymalnej mocy).
  3. Usunąć 800 ng (40 μl) sonikowanego produktu i umieścić w silikonowanej probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml do reakcji immunoprecypitacji (IP).
  4. Pozostałe 200 ng (10 μl) należy odłożyć na bok, aby posłużyły jako wejściowe (IN) referencyjne DNA (przechowywać w temperaturze 4°C).

IMMUNOPRECYPITATON METYLOWANEGO DNA

  1. Denaturować DNA, które zostanie użyte do reakcji IP (800 ng) w temperaturze 95°C przez 10 minut w łaźni wodnej.
  2. Ostudzić natychmiast na lodzie. Poczekaj, aż DNA całkowicie ostygnie (około 5 minut na lodzie) przed przejściem do następnego kroku.
  3. Dodać 5 μg przeciwciała monoklonalnego.
  4. Dodać bufor IP (używany w temperaturze pokojowej w całym protokole) do końcowej objętości 500 μl.
  5. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4°C w obrotowym uchwycie probówki.
  6. Tuż przed zakończeniem kroku 5 przygotuj Dynabeads, myjąc (kroki 6-11). Najpierw dokładnie zawiesić kulki w fiolce poprzez wirowanie.
  7. Przenieś 30 μl (~ 2 x 107) zawieszonych Dynabeads na reakcję plus 1, do nowej silikonowanej probówki (na przykład, jeśli przeprowadzasz 8 reakcji, usuń wystarczającą ilość kulek na 9, tj. 270 μl).
  8. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. Odpipetować supernatant. Podczas usuwania supernatantu należy unikać dotykania koralików o wewnętrzną ścianę (w miejscu, w którym kulki przyciągają się do magnesu) końcówką pipety.
  10. Wyjmij rurkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w nadmiarze objętości bufora IP (750 μl-1000 μl). Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  11. Powtórz pranie jeszcze raz, a następnie ponownie zawieś umyte koraliki w buforze IP w oryginalnej objętości usuniętej w kroku 7.
  12. Dodać 30 μl przemytych Dynabeads do każdej reakcji IP
  13. Inkubować w obrotowym uchwycie probówki przez 2 godziny w temperaturze 4°C.
  14. Po zakończeniu inkubacji umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  15. Odpipetować supernatant. Unikaj dotykania końcówką pipety wewnętrznej ścianki rurki (w miejscu, w którym koraliki przyciągają się do magnesu). Dodać 500 μl bufora IP. Wymieszaj zawartość probówki i umieść ją z powrotem na stojaku magnetycznym na 2 minuty. Powtórz mycie z buforem 500 ul IP jeden raz.
  16. Po usunięciu supernatantu z ostatniego płukania, ponownie zawiesić kulki w 400 μl buforu wytrawiającego.
  17. Potraktuj reakcję 100 μg proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 50°C.

OCZYSZCZANIE IMMUNOLOGICZNIE WYTRĄCONEGO DNA

  1. Dodać 500 μl 1:1 fenolu/chloroformu pH 7 i dokładnie wymieszać.
  2. Wirować z prędkością 13 000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  4. Powtórz kroki od 1 do 3, jeśli interfaza między warstwami wodnymi i organicznymi wydaje się mętna.
  5. Dodać 1/10objętości 3 M octanu sodu (40 μl) i odwirować.
  6. Dodać 1 μl glikogenu (20 μg/μl) i odwirować.
  7. Dodaj 2 objętości (1000 μl) 100% etanolu, odwiruj i umieść w temperaturze -20°C na 20 minut.
  8. Wirować z prędkością 13 000 g przez 20 minut w temperaturze 4°C.
  9. Usuń etanol, wiruj pulsacyjnie i usuń resztki etanolu.
  10. Dodaj 500 μl zimnego 70% etanolu do umycia. Krótko wirować i wirować z prędkością 13 000 g przez 20 minut w temperaturze 4°C.
  11. Usuń 70% etanolu, wiruj pulsacyjnie i usuń resztki etanolu przez pipetowanie.
  12. Wysuszyć granulkę na powietrzu z otwartą nakrętką przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady pozostałości etanolu.
  13. Zawiesić osad DNA w 10 μl wysterylizowanego dH20.

WALIDACJA METODĄ PCR

  1. Możesz sprawdzić, czy Twoja procedura MeDIP działa, wykonując protokół MeDIP przy użyciu normalnego ludzkiego DNA (męskiego lub żeńskiego), a następnie oznaczając region, o którym wiadomo, że jest wzbogacony do metylacji.
  2. Usuń 30% produktu MeDIP do probówki PCR i kolejne 30% produktu MeDIP do innej probówki PCR.
  3. Umieść 10 ng DNA IN w probówce PCR i 10 ng DNA IN w innej probówce PCR. Powinieneś teraz mieć cztery oddzielne reakcje PCR do skonfigurowania.
  4. Przeprowadzić PCR przy użyciu starterów H19 i CTRL, jak wskazano w Tabeli 1.
  5. Przygotować dwie mieszanki wzorcowe (po jednej na każdy zestaw starterów) do reakcji PCR o całkowitej objętości 12,5 μl, jak przedstawiono w tabeli 2.
  6. Poddać termocyklowi PCR, stosując warunki przedstawione w tabeli 3.
  7. Uruchom 5 μl produktów PCR na 2% żelu agarozowym w celu wizualizacji.
  8. Oczekiwane wyniki dla udanego MeDIP przedstawiono w Tabeli 4.

Tabele

Tabela 1: Startery H19 i CTRL do walidacji PCR.

Zestaw podkładów Podkład do przodu Podkład odwrotny Przewidywany rozmiar produktu H19 H19_F 5'-cgagtgtgggtgagtgtgag H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa 174 punkty bazowe CTRL (kontrolka) CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt 139 pz

Tabela 2. Mastermixy do reakcji PCR.

  Mieszanka H19 (na Rxn) CTRL Mix (za Rxn) ddH2O 6,875 Pokój 6,875 Pokój Bufor 10X Wydanie orzeczenia 1,25 Wydanie orzeczenia 1,25 Mieszanka dNTP (10 mM każdy) 0,25 pkt. 0,25 pkt. MgCl2 (50 mM) 0,25 pkt. 0,25 pkt. Startery (H19_F/R lub CTRL_F/R) (po 10 μM F/R) 0,625 pkt. 0,625 pkt. Platynowy Taq 0,25 pkt. 0,25 pkt.

Tabela 3. Warunki termocylowania PCR.

  95°C Godzina 5:00 40X
95°C Godzina 0:30 56°C Godzina 0:30 72°C Godzina 0:15

Tabela 4. Oczekiwane wyniki PCR dla udanego MeDIP.

  Szablon DNA Zastosowany podkład w Ip H19 Plus Plus CTRL Plus Minus

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośnie świadomość znaczącej roli, jaką metylacja DNA odgrywa w chorobach, dlatego coraz ważniejsze staje się opracowanie testów do pomiaru tej modyfikacji 3, 12, 13. Technika MeDIP jest podatnym narzędziem do badań przesiewowych zarówno na poziomie całego genomu, jak i specyficznym dla locus poziomie 6, 7. Technika ta zapewnia szybki wgląd w poziomy metylacji DNA przy użyciu ograniczonych ilości wyjściowego DNA i pozwala na łatwe porównania między różnymi źródłami. Dalsze zastosowania produktu Me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pragniemy podziękować członkom laboratoriów Brown i Lam za ich udział w krytyce tego filmu i artykułu. Prace te były wspierane przez fundusze z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem i Fundacji Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sonikator BiorupterNarzędzieDiagenodeUCD-200 TM
1,7 ml Probówki do mikrowirówek SafeSealInneSorenson BioScience11510
ND 3300 Narzędzie do spektrofotometruNanoDrop
Przeciwciało pierwotne: Odczynnik mAb myszy anty-5'-metylocytozynyCalbiochem162 33 D3
Przeciwciało wtórne: Dynabeads M-280 Odczynnik IgG przeciwko mysim owcomInvitrogen112-01D
Magnetyczne narzędzie do stojaka na probówkiInvitrogenCS15000
Mini LabRollerToolLabnet InternationalH5500
IP Buffer10 mM NaPO4 pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Przechowywany w temperaturze pokojowej
Bufor10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl
mineralizacyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
  2. Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
  3. Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
  4. Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
  5. Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
  6. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
  7. Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
  8. Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
  9. Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
  10. Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
  11. Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
  13. Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
  14. Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metylacja DNAsonikacja DNAtrawienie proteinaz Kekstrakcja fenolo chloroformowaizolacja za pomoc kulek magnetycznychprzeciwcia o anty 5mCwalidacja PCRanaliza epigenetyczna

Powiązane artykuły