Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA

23.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/935

⸱

2 stycznia 2009

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Genetics and Developmental Biology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC, 4Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 5Department of Medical Genetics, Life Sciences Institute,, University of British Columbia - UBC

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA (MeDIP). MeDIP jest dwudniową procedurą, która pozwala na selektywne wyodrębnienie zmetylowanych fragmentów DNA z próbki genomowego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5-metylocytozyny (anti-5 mC).

Streszczenie

Identyfikacja wzorów metylacji DNA jest powszechną procedurą w badaniach nad epigenetyką, ponieważ wiadomo, że metylacja wywiera istotny wpływ na ekspresję genów i bierze udział w prawidłowym rozwoju, jak również w procesach chorobowych1-4Zatem zdolność rozróżniania między DNA zmetylowanym a niezmetylowanym jest niezbędna do tworzenia profili metylacji na potrzeby takich badań. Immunoprecypitacja DNA zmetylowanego (MeDIP) jest wydajną techniką ekstrakcji zmetylowanego DNA z badanego preparatu5-7Próbka zawierająca zaledwie 200 ng DNA jest wystarczająca do reakcji z przeciwciałem, czyli immunoprecypitacji (IP). DNA poddaje się sonikacji w celu uzyskania fragmentów o rozmiarach od 300-1000 bp, a następnie dzieli na porcje immunoprecypitowane (IP) oraz wejściowe (IN). DNA IP jest następnie denaturowane termicznie, a potem inkubowane z przeciwciałem anty-5'mC, co umożliwia związanie zmetylowanego DNA przez przeciwciało monoklonalne. Następnie dodaje się kulki magnetyczne zawierające przeciwciało wtórne wykazujące powinowactwo do przeciwciała pierwotnego i poddaje się je inkubacji. Przeciwciała związane z kulkami wiążą przeciwciało monoklonalne użyte w pierwszym kroku. DNA związane z kompleksem przeciwciał (DNA zmetylowane) oddziela się od reszty DNA, używając magnesu do wyciągnięcia kompleksów z roztworu. Następnie wykonuje się kilka płukań buforem IP, aby usunąć niezwiązane, niezmetylowane DNA. Kompleksy zmetylowanego DNA/przeciwciał są następnie trawione Proteinazą K w celu rozkładu przeciwciał, pozostawiając nienaruszone jedynie zmetylowane DNA. Wzbogacone DNA oczyszcza się poprzez ekstrakcję fenol:chloroformową w celu usunięcia białek, a następnie wytrąca i resuspenduje w wodzie do późniejszego użycia. Techniki PCR mogą być wykorzystane do walidacji wydajności procedury MeDIP poprzez analizę produktów amplifikacji DNA IP i IN w regionach znanych z braku oraz obecności sekwencji zmetylowanych. Oczyszczone zmetylowane DNA może być następnie wykorzystane do badań metylacji specyficznych dla konkretnych loci (PCR) lub w skali całego genomu (mikromacierze i sekwencjonowanie); jest ono szczególnie użyteczne w połączeniu z innymi narzędziami badawczymi, takimi jak profilowanie ekspresji genów i komparatywna hybrydyzacja genomowa na mikromacierzach (CGH).8Dalsze badania nad metylacją DNA doprowadzą do odkrycia nowych celów epigenetycznych, co z kolei może być przydatne w opracowywaniu nowych terapeutycznych lub prognostycznych narzędzi badawczych w chorobach takich jak nowotwory, które charakteryzują się aberracyjną metylacją DNA2, 4, 9-11empty

Protokół

IZOLACJA DNA I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK

Do procedury MeDIP można wykorzystać DNA z różnych rodzajów próbek (komórek hodowlanych, tkanek świeżo zamrożonych, a także tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie). Ważne jest użycie wysoko oczyszczonego DNA, pozbawionego białek towarzyszących, takich jak histony. Należy również usunąć z próbki jak najwięcej RNA, ponieważ może ono zakłócać zarówno oznaczanie ilości DNA, jak i wiązanie przeciwciał. Ilość DNA wykorzystywanego do MeDIP może wynosić od 200 ng do 1 µg, w zależności od dostępnej ilości DNA. W celu zademonstrowania niniejszego protokołu zostanie użyte 1 µg DNA. Poniższy protokół pozwoli na uzyskanie wysokiej jakości dwuniciowego DNA z komórek hodowlanych. W przypadku ekstrakcji DNA z innych rodzajów próbek należy zastosować inne protokoły.

  1. Do osadu komórkowego w probówce Eppendorfa o pojemności 1,7 ml dodać 400 μl buforu do trawienia.
  2. Do probówki dodać 100 μg proteinazy K i inkubować przez noc w temperaturze 50°C.
  3. Dodać 500 μl fenolu o pH 7 i wymieszać delikatnie, ale dokładnie, odwracając probówkę.
  4. Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  6. Powtórzyć kroki od 3 do 5 raz.
  7. Dodać 500 µl mieszaniny fenol/chloroform 1:1 o pH 7 i wymieszać delikatnie, ale dokładnie, odwracając probówkę.
  8. Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  9. Przenieść frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  10. Dodać 40 μg RNazy A i inkubować przez 1 h w temperaturze 37°C.
  11. Dodać 500 μl fenolu o pH 7 i wymieszać delikatnie, ale dokładnie, odwracając probówkę.
  12. Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  13. Przenieść frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  14. Powtórzyć kroki od 11 do 13 raz.
  15. Dodać 500 µl mieszaniny fenol/chloroform 1:1 o pH 7 i wymieszać delikatnie, ale dokładnie, odwracając probówkę.
  16. Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  17. Przenieść frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  18. Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu (40 μl) i dobrze wymieszać.
  19. Dodać 2 objętości (900 μl) 100% etanolu, dobrze wymieszać i pozostawić w temperaturze -20°C na 20 min.
  20. Wirować przy 13 000 g przez 20 min w temperaturze 4°C.
  21. Usunąć etanol, krótko odwirować (pulse spin) i usunąć pozostałości etanolu.
  22. Do przemycia dodać 500 μl zimnego 70% etanolu. Wirować przy 13 000 g przez 20 min w temperaturze 4°C.
  23. Usunąć 70% etanol, krótko odwirować (pulse spin) i usunąć pozostałości etanolu za pomocą pipety.
  24. Suszyć osad na powietrzu z otwartą zakrętką przez 10 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady pozostałego etanolu.
  25. Resuspendować DNA w 50 μl sterylnej dH2O przez noc w temperaturze 4°C.
  26. Oznaczyć ilość DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Idealny stosunek A260:A280 wynosi 1,8.
  27. Określić jakość i zakres wielkości DNA na żelu agarozowym z markerem 100 bp. Na żelu agarozowym 1,7% można rozdzielić nawet 10 ng DNA genomicznego, a następnie przeprowadzić barwienie przy użyciu barwnika o wysokiej czułości na małe ilości DNA, takiego jak SYBR Gold.
  28. W jednej silikonizowanej probówce na próbkę przygotować 1 µg DNA w całkowitej objętości 50 μl, uzupełniając pozostałą objętość sterylną dH2O.

SONIKACJA DNA

Sonikacja DNA oraz protokół MeDIP muszą być przeprowadzane w probówkach silikonizowanych, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu białek do ścianek probówek. Optymalny czas sonikacji próbek DNA zależy od stopnia fragmentacji DNA w próbce, określonego na podstawie elektroforezy żelowej (Krok 27). Na przykład DNA wyizolowane z hodowli komórkowych powinno mieć bardzo wysoką masę cząsteczkową i w konsekwencji będzie wymagało dłuższej sonikacji niż DNA wyizolowane z próbek archiwalnych, które są często częściowo zdegradowane. Jeśli próbki mają jednorodnie wysoką masę cząsteczkową, na tym etapie można przystąpić do sonikacji zgodnie z opisem w niniejszym protokole, bez konieczności sprawdzania każdej próbki z osobna. W przypadku próbek pofragmentowanych, tak jak w przypadku próbek archiwalnych, konieczne będzie dostosowanie procedury sonikacji, prawdopodobnie poprzez skrócenie czasu sonikacji w celu uzyskania fragmentów o długości 300-1000 bp. Jeśli planowane jest przetwarzanie próbek częściowo zdegradowanych, optymalizację parametrów sonikacji można przeprowadzić na reprezentatywnej próbce z grupy badanych materiałów. Na podstawie stopnia fragmentacji DNA zaobserwowanego w elektroforezie żelowej (Krok 27), badacz może wcześniej określić optymalny czas sonikacji dla danej próbki. W niniejszej sekcji opisujemy metodę uzyskiwania fragmentów DNA o długości 300-1000 bp poprzez sonikację za pomocą automatycznego urządzenia sonikującego (Bioruptor firmy Diagenode, UCD-200 TM) z wykorzystaniem DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.

  1. Woda w urządzeniu Biorupter musi mieć temperaturę 4°C.
  2. Sonicować przez 7 min w ustawieniach automatycznych (30 s włączone, 30 s wyłączone przy maksymalnej mocy).
  3. Odebrać 800 ng (40 μl) produktu sonicowanego i przenieść do silikonizowanej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml w celu przeprowadzenia reakcji immunoprecypitacji (IP).
  4. Odstawić pozostałe 200 ng (10 μl) jako referencyjne DNA wejściowe (IN) (przechowywać w temperaturze 4°C).

IMMUNOPRECYPITACJA ZMETYLOWANEGO DNA

  1. Zdenaturuj DNA, które zostanie użyte do reakcji IP (800 ng), w kąpieli wodnej w temperaturze 95°C przez 10 min.
  2. Natychmiast schłodź na lodzie. Pozostaw DNA do całkowitego ostygnięcia (około 5 min na lodzie) przed przejściem do następnego kroku.
  3. Dodaj 5 μg przeciwciała monoklonalnego.
  4. Dodaj bufor IP (używany w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania tego protokołu) do uzyskania objętości końcowej 500 μl.
  5. Inkubuj przez 2 h w temperaturze 4°C w obrotowym uchwycie na probówki.
  6. Tuż przed zakończeniem kroku 5, przygotuj Dynabeads poprzez płukanie (kroki 6-11). Najpierw dokładnie resuspenduj koraliki w fiolce za pomocą vortexa.
  7. Przenieś 30 μl (~ 2 x 107) resuspendowanych Dynabeads na jedną reakcję plus jedną, do nowej probówki silikonizowanej (na przykład, przy wykonywaniu 8 reakcji, pobierz koraliki dla 9, tj. 270 μl).
  8. Umieść probówkę na statywie magnetycznym na 2 min w temperaturze pokojowej.
  9. Odsącz naddatek pipetą. Podczas usuwania naddatku unikaj dotykania końcówką pipety koralików przy wewnętrznej ściance (tam, gdzie koraliki przyciągają się do magnesu).
  10. Zdejmij probówkę z magnesu i resuspenduj koraliki w nadmiarze buforu IP (750 μl-1000 μl). Ponownie umieść probówkę na statywie magnetycznym na 2 min w temperaturze pokojowej.
  11. Powtórz płukanie jeszcze raz, a następnie resuspenduj wypłukane koraliki w buforze IP w objętości pierwotnie pobranej w kroku 7.
  12. Dodaj 30 μl wypłukanych Dynabeads do każdej reakcji IP.
  13. Inkubuj w obrotowym uchwycie na probówki przez 2 h w temperaturze 4°C.
  14. Po zakończeniu inkubacji umieść probówkę na statywie magnetycznym na 2 min w temperaturze pokojowej.
  15. Odsącz naddatek pipetą. Unikaj dotykania końcówką pipety wewnętrznej ścianki probówki (tam, gdzie koraliki przyciągają się do magnesu). Dodaj 500 μl buforu IP. Wymieszaj zawartość probówki i ponownie umieść ją na statywie magnetycznym na 2 min. Powtórz płukanie 500 μl buforu IP jeden raz.
  16. Po usunięciu naddatku z ostatniego płukania, resuspenduj koraliki w 400 μl buforu do trawienia.
  17. Potraktuj reakcję 100 μg Proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 50°C.

OCZYSZCZANIE DNA PO IMMUNOPRECYPITACJI

  1. Dodać 500 μl dodać fenol/chloroform 1:1 o pH 7 i dokładnie wymieszać na wiertarku (vortexu).
  2. Wirować przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieś frakcję wodną (górną) do nowej probówki.
  4. Powtórzyć kroki od 1 do 3, jeśli granica faz między warstwą wodną a organiczną jest mętna.
  5. Dodać 1/10th objętość 3 M octanu sodu (40 μl) i wymieszać w wirówce typu vortex.
  6. Dodać 1 μl glikogenu (20 μg/μl) i wymieszać w wstrząsarzu vortex.
  7. Dodaj 2 objętości (1000 μl) 100% etanolu, wymieszać na wodotryskach (vortex) i umieścić w temperaturze -20°C przez 20 min.
  8. Wirować przy 13 000 g przez 20 min w 4°C.
  9. Usunąć etanol, krótko odwirować i usunąć pozostałości etanolu.
  10. Dodać 500 μl zimny 70% etanol do przemycia. Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i wirować z przyspieszeniem 13 000 g przez 20 min w 4°C.
  11. Usunąć 70% etanol, krótko odwirować (pulse spin), a następnie usunąć pozostały etanol za pomocą pipety.
  12. Osuszyć osad na powietrzu przy otwartej zakrętce przez 10 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady pozostałego etanolu.
  13. Resuspender osad DNA w 10 μl sterylizowana dH2O20.

WALIDACJA METODĄ PCR

  1. Można sprawdzić prawidłowe działanie procedury MeDIP, wykonując protokół MeDIP z użyciem normalnego ludzkiego DNA (męskiego lub żeńskiego), a następnie analizując region znany z wysokiego stopnia metylacji.
  2. Przenieś 30% produktu MeDIP do probówki PCR oraz kolejne 30% produktu MeDIP do drugiej probówki PCR.
  3. Umieść 10 ng DNA IN w probówce PCR oraz 10 ng DNA IN w drugiej probówce PCR. Powinieneś teraz przygotować cztery oddzielne reakcje PCR.
  4. Przeprowadź PCR z użyciem starterów H19 i CTRL, zgodnie ze wskazówkami w Tabeli 1.
  5. Przygotuj dwie mieszaniny mastermix (po jednej dla każdego zestawu starterów) do reakcji PCR o całkowitej objętości 12,5 µl, zgodnie z opisem w Tabeli 2.
  6. Przeprowadź termocyklowanie PCR zgodnie z warunkami opisanymi w Tabeli 3.
  7. Naniesiesz 5 µl produktów PCR na 2% żel agarozowy w celu wizualizacji.
  8. Oczekiwane wyniki dla prawidłowo przeprowadzonego MeDIP przedstawiono w Tabeli 4.

Tabele

Tabela 1: Primery H19 i CTRL do walidacji PCR.

Zestaw primerówPrimer prawy (Forward)Primer lewy (Reverse)Przewidywana wielkość produktu
H19H19_F 5’-cgagtgtgcgtgagtgtgagH19_R 5’-ggcgtaatggaatgcttgaa174 bp
CTRL (kontrola)CTRL_F5’-gagagcattagggcagacaaaCTRL_R 5’-gttcctcagacagccacattt139 bp

Tabela 2. Mieszaniny Mastermix do reakcji PCR.

 Mieszanina H19 (na reakcję)Mieszanina CTRL (na reakcję)
ddH2O6,8756,875
Bufor 10X1,251,25
Mieszanina dNTP (po 10 mM każda)0,250,25
MgCl2 (50 mM)0,250,25
Startery (H19_F/R lub CTRL_F/R) (po 10 µM każdy F/R)0,6250,625
Platinum Taq0,250,25

Tabela 3. Warunki termocyklerowe PCR.

 95°C5:00
40X
95°C0:30
56°C0:30
72°C0:15

Tabela 4. Oczekiwane wyniki PCR dla prawidłowo przeprowadzonej procedury MeDIP.

 Matryca DNA
Użyty starterINIP
H19DodatniDodatni
CTRLDodatniUjemny

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Coraz większa jest świadomość znaczącej roli, jaką metylacja DNA odgrywa w rozwoju chorób, dlatego opracowanie testów pozwalających na pomiar tej modyfikacji staje się coraz ważniejsze 3, 12, 13. Technika MeDIP stanowi przydatne narzędzie do przesiewowej analizy zarówno na poziomie całego genomu, jak i specyficznych loci 6, 7. Metoda ta umożliwia szybki wgląd w poziomy metylacji DNA przy użyciu niewielkich ilości wyjściowego DNA i pozwala na łatwe porównania pomiędzy różnymi źródłami. Dalsze zastoso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Pragniemy podziękować członkom laboratoriów Brown i Lam za pomoc w recenzji tego filmu oraz artykułu. Praca ta była finansowana ze środków Canadian Institutes for Health Research oraz Michael Smith Foundation for Health Research.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sonikator BiorupterNarzędzieDiagenodeUCD-200 TM
Probówki do mikrowirówki 1,7 ml SafeSealInneSorenson BioScience11510
Spektrofotometr ND 3300NarzędzieNanoDrop
Przeciwciało pierwszorzędowe: mysi mAb przeciwko 5’-metylocytozynieOdczynnikCalbiochem162 33 D3
Przeciwciało drugorzędowe: Dynabeads M-280 owcze anty-mysie IgGOdczynnikInvitrogen112-01D
Magnetyczny statyw na probówkiNarzędzieInvitrogenCS15000
Mini LabRollerNarzędzieLabnet InternationalH5500
Bufor IP10 mM NaPO4 pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Przechowywać w temperaturze pokojowej
Bufor do trawienia10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl

Bibliografia

  1. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
  2. Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
  3. Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development. 134, 3959-3965 (2007).
  4. Feinberg, A. P., Tycko, B. The history of cancer epigenetics. Nature reviews. 4, 143-153 (2004).
  5. Weber, M., et al. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat Genet. 39, 457-466 (2007).
  6. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat Genet. 37, 853-862 (2005).
  7. Wilson, I. M., et al. Epigenomics: mapping the methylome. Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).
  8. Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing. Nature. 449, 1073-1077 (2007).
  9. Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers. Journal of applied. 49, 1-10 (2008).
  10. Maekawa, M., Watanabe, Y. Epigenetics: relations to disease and laboratory findings. Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).
  11. Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. Epigenetics of cancer progression. Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).
  12. Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429, 457-463 (2004).
  13. Jones, P. A., Baylin, S. B. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).
  14. Fraga, M. F., Esteller, M. DNA methylation: a profile of methods and applications. Biotechniques. 33, 632-649 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metylacja DNAsonikacja DNAtrawienie proteinaz Kekstrakcja fenolo chloroformowaizolacja za pomoc kulek magnetycznychprzeciwcia o anty 5mCwalidacja PCRanaliza epigenetyczna
Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.