Ten film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA (MeDIP). MeDIP jest dwudniową procedurą, która pozwala na selektywne wyodrębnienie zmetylowanych fragmentów DNA z próbki genomowego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5-metylocytozyny (anti-5 mC).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Identyfikacja wzorów metylacji DNA jest powszechną procedurą w badaniach nad epigenetyką, ponieważ wiadomo, że metylacja wywiera istotny wpływ na ekspresję genów i bierze udział w prawidłowym rozwoju, jak również w procesach chorobowych1-4Zatem zdolność rozróżniania między DNA zmetylowanym a niezmetylowanym jest niezbędna do tworzenia profili metylacji na potrzeby takich badań. Immunoprecypitacja DNA zmetylowanego (MeDIP) jest wydajną techniką ekstrakcji zmetylowanego DNA z badanego preparatu5-7Próbka zawierająca zaledwie 200 ng DNA jest wystarczająca do reakcji z przeciwciałem, czyli immunoprecypitacji (IP). DNA poddaje się sonikacji w celu uzyskania fragmentów o rozmiarach od 300-1000 bp, a następnie dzieli na porcje immunoprecypitowane (IP) oraz wejściowe (IN). DNA IP jest następnie denaturowane termicznie, a potem inkubowane z przeciwciałem anty-5'mC, co umożliwia związanie zmetylowanego DNA przez przeciwciało monoklonalne. Następnie dodaje się kulki magnetyczne zawierające przeciwciało wtórne wykazujące powinowactwo do przeciwciała pierwotnego i poddaje się je inkubacji. Przeciwciała związane z kulkami wiążą przeciwciało monoklonalne użyte w pierwszym kroku. DNA związane z kompleksem przeciwciał (DNA zmetylowane) oddziela się od reszty DNA, używając magnesu do wyciągnięcia kompleksów z roztworu. Następnie wykonuje się kilka płukań buforem IP, aby usunąć niezwiązane, niezmetylowane DNA. Kompleksy zmetylowanego DNA/przeciwciał są następnie trawione Proteinazą K w celu rozkładu przeciwciał, pozostawiając nienaruszone jedynie zmetylowane DNA. Wzbogacone DNA oczyszcza się poprzez ekstrakcję fenol:chloroformową w celu usunięcia białek, a następnie wytrąca i resuspenduje w wodzie do późniejszego użycia. Techniki PCR mogą być wykorzystane do walidacji wydajności procedury MeDIP poprzez analizę produktów amplifikacji DNA IP i IN w regionach znanych z braku oraz obecności sekwencji zmetylowanych. Oczyszczone zmetylowane DNA może być następnie wykorzystane do badań metylacji specyficznych dla konkretnych loci (PCR) lub w skali całego genomu (mikromacierze i sekwencjonowanie); jest ono szczególnie użyteczne w połączeniu z innymi narzędziami badawczymi, takimi jak profilowanie ekspresji genów i komparatywna hybrydyzacja genomowa na mikromacierzach (CGH).8Dalsze badania nad metylacją DNA doprowadzą do odkrycia nowych celów epigenetycznych, co z kolei może być przydatne w opracowywaniu nowych terapeutycznych lub prognostycznych narzędzi badawczych w chorobach takich jak nowotwory, które charakteryzują się aberracyjną metylacją DNA2, 4, 9-11empty
Protokół
IZOLACJA DNA I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK
Do procedury MeDIP można wykorzystać DNA z różnych rodzajów próbek (komórek hodowlanych, tkanek świeżo zamrożonych, a także tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie). Ważne jest użycie wysoko oczyszczonego DNA, pozbawionego białek towarzyszących, takich jak histony. Należy również usunąć z próbki jak najwięcej RNA, ponieważ może ono zakłócać zarówno oznaczanie ilości DNA, jak i wiązanie przeciwciał. Ilość DNA wykorzystywanego do MeDIP może wynosić od 200 ng do 1 µg, w zależności od dostępnej ilości DNA. W celu zademonstrowania niniejszego protokołu zostanie użyte 1 µg DNA. Poniższy protokół....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Coraz większa jest świadomość znaczącej roli, jaką metylacja DNA odgrywa w rozwoju chorób, dlatego opracowanie testów pozwalających na pomiar tej modyfikacji staje się coraz ważniejsze 3, 12, 13. Technika MeDIP stanowi przydatne narzędzie do przesiewowej analizy zarówno na poziomie całego genomu, jak i specyficznych loci 6, 7. Metoda ta umożliwia szybki wgląd w poziomy metylacji DNA przy użyciu niewielkich ilości wyjściowego DNA i pozwala na łatwe porównania pomiędzy różnymi źródłami. Dalsze zastoso.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować członkom laboratoriów Brown i Lam za pomoc w recenzji tego filmu oraz artykułu. Praca ta była finansowana ze środków Canadian Institutes for Health Research oraz Michael Smith Foundation for Health Research.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Sonikator Biorupter | Narzędzie | Diagenode | UCD-200 TM | |
| Probówki do mikrowirówki 1,7 ml SafeSeal | Inne | Sorenson BioScience | 11510 | |
| Spektrofotometr ND 3300 | Narzędzie | NanoDrop | ||
| Przeciwciało pierwszorzędowe: mysi mAb przeciwko 5’-metylocytozynie | Odczynnik | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Przeciwciało drugorzędowe: Dynabeads M-280 owcze anty-mysie IgG | Odczynnik | Invitrogen | 112-01D | |
| Magnetyczny statyw na probówki | Narzędzie | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Narzędzie | Labnet International | H5500 | |
| Bufor IP | 10 mM NaPO4 pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Przechowywać w temperaturze pokojowej | |||
| Bufor do trawienia | 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl |
Bibliografia
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilbe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
