2.9: Ilościowe oznaczanie mikroorganizmów i wirusów środowiskowych za pomocą qPCR

1. Kolekcja próbek

1. Zbierz ziemię za pomocą świdra lub łopaty na określoną głębokość. Jeśli zbierasz glebę z ryzosfery, zbieraj glebę tylko w promieniu 7 mm wokół korzenia rośliny, uderzając w nadmiar gleby z korzenia i zeskrobując żądaną glebę do beczki zbiorczej.
2. Umieść sterylną butelkę Nalgene w patyczku do maczania. Przytrzymaj koniec patyczka i zbierz wodę, zanurzając butelkę. Umieść butelkę w chłodziarce z lodem.
3. Przenieś próbki do laboratorium.

2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

1. Aby wyizolować mikroorganizmy z pobranych próbek i wyekstrahować z nich DNA i/lub RNA, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education na temat ekstrakcji kwasów nukleinowych przez społeczność.

3. Odwrotna transkrypcja

1. Jeśli badany materiał genetyczny jest RNA, przed przystąpieniem do PCR należy go użyć do wytworzenia komplementarnego DNA (cDNA) poprzez odwrotną transkrypcję. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z filmem JoVE Science Education na temat RT-PCR.

4. Konfiguracja qPCR

1. Pobrać odczynniki przechowywane w temperaturze -20 °C i rozmrozić je na lodzie lub w temperaturze pokojowej w czystym okapie. Odczynniki użyte w tym przykładzie obejmują mieszaninę reakcyjną qPCR (w zależności od użytej maszyny qPCR; zawiera polimerazę DNA), startery do przodu i do tyłu oraz sondę TaqMan. Sekwencje startera i sondy są zaprojektowane z sekwencjami specyficznymi dla organizmu, który jest liczony. Zapoznaj się z aktualną literaturą, aby znaleźć interesujące sekwencje. W tym przykładzie zostanie użyty system odczynników Roche Light Cycler 480 Probes Mix. Wirus łagodnej pstrości papryki zostanie wymieniony w próbce wody. ^1,2 Zobacz Tabela 1 dla sekwencji starterów i sond.
2. Rozmrozić wyekstrahowane (c)DNA z próbek i DNA kontroli pozytywnej (które składa się z sekwencji specyficznych dla organizmu sklonowanych do plazmidów bakteryjnych) w temperaturze pokojowej.
3. Przygotuj 96-komórkowy szablon tabeli, który przypomina 96-dołkową płytkę qPCR. Oznacz każdą komórkę reakcją, która zostanie załadowana na płytkę. Uwzględnić reakcje dla każdej próbki i wzorca w trzech egzemplarzach, jak również dla kontroli dodatniej i kontroli ujemnej, takie jak reakcja bez DNA.
4. Obliczyć objętości odczynników potrzebne do reakcji "mieszaniny wzorcowej", która obejmuje wszystkie odczynniki, które są stałe w reakcjach, w oparciu o instrukcje producenta i literaturę. Przygotować wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej do trzech reakcji dla wszystkich próbek plus kontrolnych oraz dodatkowe 10% na uwzględnienie błędu pipetowania. Przykładowy przepis na mieszankę wzorcową znajduje się w Tabela 2.
5. Pracując w czystym kapturze, po całkowitym rozmrożeniu wszystkich odczynników, dodaj obliczoną ilość każdego odczynnika do 1,5 ml probówki do mikrodymów o niskiej wiązalności, aby utworzyć mieszankę główną. Zwirować i krótko odwirować każdy odczynnik przed dodaniem. Wymieniaj końcówkę pipety między każdym odczynnikiem, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zapewnić prawidłowe stężenia. Po dodaniu wszystkich odczynników, należy spłukać rurkę wirową i miniwirówkę z mieszanką główną, aby zapewnić jednorodność.
6. Porcjować odpowiednią objętość mieszanki wzorcowej do każdego wyznaczonego dołka w 96-dołkowej płytce PCR.
7. Dodaj odpowiednią objętość próbki (c)DNA, plazmidu kontroli pozytywnej i kontroli ujemnej (woda o jakości cząsteczkowej) do wyznaczonych studzienek.
8. Po dodaniu wszystkich próbek i kontroli należy uszczelnić płytkę folią uszczelniającą. Użyj narzędzia uszczelniającego, aby wypchnąć powietrze spod folii i zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Ostrożnie oderwij krawędzie folii.
9. Odwirować szczelnie zamkniętą 96-dołkową płytkę w wirówce z uchwytem na płytkę, aby zebrać mieszaninę na dnie każdej studzienki. Upewnij się, że używasz płytki przeciwwagi, aby upewnić się, że wirówka będzie odpowiednio wyważona podczas obracania. Wiruj impulsowo do 1000 obr./min, a następnie pozwól wirówce powoli zatrzymać się bez hamulców.

5. Operacja qPCR

1. Umieścić szczelnie zapieczętowaną 96-dołkową płytkę w maszynie qPCR. Upewnij się, że maszyna wskazuje, że jest gotowa do uruchomienia.
2. Postępuj zgodnie z instrukcjami maszyny qPCR, aby poprawnie wprowadzić wszystkie informacje wymagane przez oprogramowanie, a następnie ustaw maszynę qPCR do działania.
3. Po zakończeniu pracy maszyny oprogramowanie będzie w stanie wykorzystać znane stężenia kontroli pozytywnej do obliczenia ilości cDNA w każdej reakcji. Następnie można obliczyć ilość wirusa w oryginalnej próbce na podstawie procesów rozcieńczania, filtracji, zagęszczania, amplifikacji i/lub ekstrakcji przeprowadzonych w celu uzyskania próbki DNA.

Tabela 1. Przykładowe sekwencje startera i sondy do wykrywania wirusa łagodnej pstrości papryki.

Tabela 2. Objętości odczynników dla poszczególnych reakcji i mieszaniny wzorcowej.

Pojawienie się ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) umożliwiło ilościowe określenie ilości dowolnego mikroorganizmu w próbce środowiskowej.

Podobnie jak standardowy PCR, qPCR identyfikuje mikroorganizmy, wykrywając obecność lub brak sekwencji DNA specyficznych dla organizmów będących przedmiotem zainteresowania. Pozwala to na wykrywanie drobnoustrojów, których nie można hodować w laboratorium, co umożliwia oznaczanie znacznie szerszego zakresu organizmów środowiskowych. Ponadto qPCR pozwala na ilościową ocenę ilości DNA. Jednocześnie jednak metodologie PCR wykrywają DNA wszystkich organizmów martwych lub żywych, co ogranicza możliwość poszukiwania tylko aktywnie rosnących drobnoustrojów w próbce.

W tym filmie dokonamy przeglądu innowacji chemicznych, które odróżniają qPCR od zwykłego PCR, wyjaśnimy, w jaki sposób qPCR można wykorzystać do ilościowego pomiaru DNA, zademonstrujemy protokół użycia qPCR do wykrywania wirusa RNA z próbek gleby i wreszcie pokażemy, w jaki sposób qPCR jest obecnie stosowany w mikrobiologii środowiskowej.

Podstawowe zasady qPCR są takie same jak w przypadku zwykłego PCR - powtarzające się cykle wyżarzania startera do matrycy, wydłużanie produktu PCR i denaturacja produktu z matrycy, prowadzące do wykładniczej amplifikacji docelowej sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania, znanej jako amplikon, z puli materiału wyjściowego.

Innowacja qPCR polega na dodaniu do reakcji fluorescencyjnych substancji chemicznych, co pozwala na bezpośrednią wizualizację syntezy produktu PCR w każdym cyklu w "czasie rzeczywistym" przez wyspecjalizowane termocyklery, co umożliwia ilościowe określenie ilości sekwencji matrycy w oryginalnej próbce. Ilość jest zwykle mierzona w kategoriach cyklu progowego, w skrócie Ct, znanego również jako cykl kwantyfikacyjny lub Cq, który jest cyklem PCR, w którym ilość produktów fluorescencyjnych przekracza poziom tła.

Kwantyfikacja może być względna, gdzie wartość Ct jednej sekwencji jest porównywana z wartością innej sekwencji wzorcowej lub kontrolnej; ilość względna jest równa dwóm podniesionej do potęgi różnicy w Ct. Alternatywnie, jeśli seria DNA o znanej ilości zostanie przeprowadzona wraz z próbkami w reakcji, można uzyskać standardową krzywą porównującą wartość fluorescencji z ilością DNA, co pozwala na bezwzględne określenie ilościowe próbki DNA.

Istnieją dwa szerokie typy cząsteczek fluorescencyjnych stosowanych w qPCR. W jednym przypadku w reakcji biorą udział barwniki fluorescencyjne, które wiążą się specyficznie z dwuniciowym DNA. Barwnik fluoryzuje tylko wtedy, gdy jest związany z DNA, co pozwala na ilościowe określenie ilości dwuniciowego produktu DNA.

W drugiej metodzie krótki odcinek DNA, znany jako sonda, jest projektowany względem określonej sekwencji docelowej będącej przedmiotem zainteresowania. Sonda jest chemicznie przyłączona do barwnika fluorescencyjnego, a także do cząsteczki "gaszącej", która tłumi sygnał fluorescencyjny z barwnika, gdy znajduje się w pobliżu. Enzym polimerazy, który syntetyzuje produkt DNA, ma aktywność degradującą DNA, która spowodowałaby "uwolnienie" cząsteczki fluorescencji z sondy, oddzielając w ten sposób barwnik od wygaszacza i umożliwiając wykrycie sygnału fluorescencji.

Teraz, gdy rozumiesz zasady rządzące qPCR, przyjrzyjmy się protokołowi stosowania tej techniki do identyfikacji wirusa RNA, który infekuje rośliny, wirusa łagodnej pstrości papryki, na podstawie próbek gleby.

W tej demonstracji próbka zostanie pobrana z ryzosfery, strefy gleby o szerokości około 7 mm wokół korzeni roślin, na którą wpływ mają korzenie i ich symbiotyczne mikroorganizmy.

Aby zebrać glebę ryzosferową, najpierw ostrożnie wyciągnij interesującą Cię roślinę z ziemi i uderz w nią, aby usunąć jak najwięcej nadmiaru gleby. Zapakuj roślinę do dalszego przetwarzania w laboratorium.

Po przyniesieniu próbek z powrotem do laboratorium użyj sterylnej szpatułki, aby zeskrobać żądaną glebę do naczynia zbiorczego. Następnie zbierz wirusa z gleby i wyekstrahuj RNA.

Po pobraniu RNA z próbki przekształć je w komplementarne lub cDNA poprzez odwrotną transkrypcję. Szczegółowe informacje na temat tej procedury można znaleźć w filmie JoVE SciEd na temat odwrotnej transkrypcji-PCR.

Gdy będziesz gotowy do przeprowadzenia qPCR, rozmroź zamrożone odczynniki w temperaturze pokojowej w dedykowanym okapie z przepływem laminarnym i umieść na lodzie po rozmrożeniu. Składniki odczynników zawierające enzym polimerazę DNA należy zawsze przechowywać na lodzie.

Rozmrozić cDNA próbki i DNA kontroli pozytywnej, takie jak okrągły fragment DNA znany jako plazmid, do którego sklonowany jest amplikon będący przedmiotem zainteresowania.

Przed złożeniem reakcji na 96-dołkowej płytce qPCR należy przygotować na papierze szablon tabeli 96 komórek i oznaczyć każdą komórkę reakcją, która zostanie załadowana do płytki. Uwzględnić reakcje dla każdej próbki i wzorca w trzech egzemplarzach, jak również dla kontroli dodatniej i kontroli ujemnej, takie jak reakcja bez DNA.

Obliczyć objętości odczynników potrzebne do uzyskania "mieszanki wzorcowej" reakcji, która obejmuje wszystkie odczynniki, które są stałe w reakcjach. Przygotować wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej do trzech reakcji dla wszystkich próbek plus kontrolnych oraz dodatkowe 10% na uwzględnienie błędu pipetowania.

Po rozmrożeniu odczynników złóż mieszankę wzorcową w probówce do mikrofugi o niskiej adsorpcji o pojemności 1,5 ml. Aby to zrobić, krótko zmieszaj każdy odczynnik, aby dokładnie wymieszać, zbierz płyn z boku probówek za pomocą mini-wirówki i odpipetuj odczynnik do probówki do mikrofuge. Należy pamiętać o użyciu nowych końcówek pipet dla każdego składnika reakcji. Po dodaniu wszystkich odczynników wymieszaj wir i odwiruj. Następnie należy podać odpowiednią ilość mieszanki wzorcowej do wyznaczonych dołków na płytce PCR.

Następnie należy przemieszać wirowo i odwirować każdą probówkę z próbką i kontrolnym DNA, a następnie pipetować odpowiednią ilość do odpowiednich studzienek na płytce PCR. Po dodaniu próbek uszczelnij płytkę folią uszczelniającą i użyj narzędzia do uszczelniania, aby całkowicie spłaszczyć uszczelkę i wypchnąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Ostrożnie oderwij nieprzylepne wypustki od końców uszczelki.

Aby w pełni zebrać mieszaninę reakcyjną na dno studzienek, należy umieścić płytkę reakcyjną w wirówce z uchwytem na płytkę i odpowiednio wyważyć wirnik za pomocą płytki przeciwwagi. Odwiruj pulsacyjnie płytkę do 1 000 obr./min, a następnie pozwól wirówce powoli zatrzymać się bez hamulców.

Umieścić płytkę reakcyjną w maszynie qPCR. Ustaw program PCR zgodnie ze specyfikacją producenta, ustawiając temperaturę topnienia zgodnie z używaną parą starterów. Ustawić program reakcji tak, aby był uruchomiony.

Po zakończeniu programu qPCR oprogramowanie będzie w stanie wykorzystać znane stężenia kontroli pozytywnej do obliczenia ilości cDNA w każdej reakcji. Następnie można obliczyć ilość wirusa w oryginalnej próbce.

Po zakończeniu programu qPCR oprogramowanie będzie w stanie wykorzystać znane stężenia kontroli pozytywnej do obliczenia ilości cDNA w każdej reakcji.

Na podstawie wyników qPCR, objętości przeniesionej do studzienek, ekstrakcji z gleby i czynnika z odwrotnej transkrypcji można obliczyć liczbę wirusów w początkowej próbce gleby.

Teraz, gdy wiesz już, jak przeprowadza się qPCR, przyjrzyjmy się, jak można go wykorzystać do analizy różnych próbek środowiskowych.

qPCR może być używany do ilościowego określania ilości wirusów odzyskanych z wielu różnych typów próbek. W tym zastosowaniu dwa różne rodzaje adenowirusów zostały zagęszczone z próbek wody za pomocą wielu różnych metod. DNA zostało następnie wyekstrahowane z wirusów i poddane qPCR, aby ocenić względną skuteczność metod koncentracji.

Innym zastosowaniem liczenia drobnoustrojów na podstawie qPCR jest ilościowe określenie zawartości bakterii w próbkach żywności i produktów rolnych - w tym przykładzie w próbkach kału i ściółki z ferm kurczaków. Zamiast skupiać się na poszczególnych gatunkach, naukowcy przeprowadzili qPCR przy użyciu starterów przeciwko wysoce konserwatywnemu genowi znajdującemu się we wszystkich bakteriach i określili ilościowo całkowitą społeczność bakteryjną znajdującą się w próbkach.

Wreszcie, jak wspomniano wcześniej, jedną z wad tradycyjnej metodologii qPCR jest to, że nie można odróżnić żywych i martwych drobnoustrojów. Jednak poprzez dodanie substancji chemicznej znanej jako monoazyd propidium lub PMA, który może dostać się do martwych komórek tylko tam, gdzie wiąże się z DNA, aby zahamować późniejsze reakcje enzymatyczne, takie jak PCR, naukowcy byli w stanie odróżnić żywe i martwe kultury E. coli O157:H7, powszechnego szczepu chorobotwórczego występującego w skażonej żywności i wodzie.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ilościowego oznaczania mikroorganizmów środowiskowych i wirusów za pomocą qPCR. Powinieneś teraz zrozumieć, jak działa qPCR, jak używać qPCR do pomiaru ilości drobnoustroju w próbce środowiskowej oraz niektóre zastosowania tej techniki. Dzięki za oglądanie!