Name: Mysi model niedokrwienia kończyn tylnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Poznaj technikę chirurgiczną indukcji niedokrwienia kończyn tylnych u myszy poprzez podwiązanie tętnicy udowej. Metoda ta umożliwia badanie chorób naczyniowych i regeneracji naczyń krwionośnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Andreie Axtell, dr. Satoshi Itoh, dr. Jeffowi Velottcie, Grantowi Hoytowi, dr. Robertowi C. Robbinsowi, dr. Jin Yu, dr. Timowi Doyle’owi oraz Stanford Small Animal Imaging Core za pomoc techniczną. Autorzy dziękują również firmie A.M. Bickford, Inc. za wsparcie w zakresie sprzętu weterynaryjnego. Badania te były finansowane z grantów badawczych National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), California Tobacco Related Disease Research Program Uniwersytetu Kalifornijskiego (15IT-0257 i 1514RT-0169) oraz California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183). N.H. otrzymuje wsparcie w ramach stypendium z American Heart Association.

1. Indukcja jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej
<ol>
<li>Narzędzia chirurgiczne potrzebne do tej operacji obejmują: pęsetę precyzyjną z ostrymi końcówkami, pęsetę ostrą, nożyczki sprężynowe, nożyczki chirurgiczne, uchwyt igłowy oraz retraktor. Własnoręcznie wykonujemy retraktor z spinacza do papieru, ponieważ jest on mniejszy niż retraktory dostępne w handlu. Narzędzia te należy wysterylizować przed operacją w autoklawie lub sterylizatorze kulkowym. Do zabiegu będą również potrzebne kauteryzator oraz sterylne precyzyjne patyczki bawełniane. Zaleca się ponowną sterylizację końcówek narzędzi w razie potrzeby w trakcie procedury.</li>
<li>Po przygotowaniu narzędzi umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej 1–3% izofluranu w 100% tlenu przy przepływie 1L/min.</li>
<li>Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie wyjmij zwierzę z komory. Zaleca się przedwdmuchanie środka znieczulającego z pudełka przed otwarciem pokrywy, aby zmniejszyć ekspozycję operatora na izofluran.</li>
<li>Następnie ułóż zwierzę w pozycji na plecach na stole przedoperacyjnym i podłącz je do ciągłego przepływu izofluranu. Za pomocą golarki elektrycznej usuń owłosienie z kończyny tylnej. Aby dokładnie usunąć włosy, zastosuj krem do depilacji.</li>
<li>Umieść mysz w pozycji na plecach na przykrytej podkładce grzewczej na stole operacyjnym i podłącz ją do ciągłego przepływu izofluranu. Wyprostuj i unieruchom kończynę tylną za pomocą kawałka taśmy. Po zabezpieczeniu kończyny tylnej przemyj skórę trzykrotnie, naprzemiennie stosując betadynę i alkohol. W dalszej części procedury chirurgicznej używaj mikroskopu sekcyjnego z powiększeniem 10X lub 20X, aby uzyskać powiększony obraz obszaru kończyny tylnej.</li>
<li>Za pomocą pęsety precyzyjnej i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry o długości około 1 cm, od kolana w kierunku przyśrodkowym uda.</li>
<li>Używając precyzyjnych patyczków bawełnianych zwilżonych solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS), delikatnie usuń tkankę tłuszczową podskórną otaczającą mięsień uda.</li>
<li>Następnie zastosuj kauteryzację w poprzek, aby naciąć i rozdzielić tkankę tłuszczową podskórną, odsłaniając leżącą pod nią tętnicę udową.</li>
<li>Użyj retraktora, aby rozszerzyć ranę i uzyskać lepszy widok na naczynia krwionośne kończyny dolnej.</li>
<li>Za pomocą pęsety precyzyjnej i precyzyjnego patyczka bawełnianego delikatnie przebij błoniastą pochewkę tętnicy udowej, aby odsłonić pęczek naczyniowo-nerwowy.</li>
<li>Następnie, używając czystego zestawu pęsety precyzyjnej i patyczka bawełnianego, wypreparuj i oddziel tętnicę udową od żyły udowej i nerwu w miejscu proksymalnym w pobliżu pachwiny. Po dyssekcji przeprowadź nitkę szwu jedwabnego 7-0 pod proksymalnym końcem tętnicy udowej. Zamknij proksymalną część tętnicy udowej za pomocą podwójnych węzłów. Zawiąż naczynie jak najbliżej proksymalnej krawędzi rany, aby pozostawić odpowiednią długość dla drugiego wiązania i intervening segmentu, który zostanie przecięty.</li>
<li>Oddziel tętnicę udową od żyły udowej w miejscu dystalnym, blisko kolana. Przeprowadź nitkę szwu 7-0 pod dystalnym końcem tętnicy udowej, proksymalnie względem tętnicy podkolanowej. Zamknij naczynie za pomocą podwójnych węzłów.</li>
<li>Zamknij dystalną tętnicę udową drugim zestawem podwójnych węzłów tuż proksymalnie od pierwszego zestawu węzłów. Ten drugi zestaw szwów będzie służył do uchwycenia tętnicy podczas procedury przecinania.</li>
<li>Podobnie, w celu uchwycenia naczynia, zamknij proksymalną tętnicę udową drugim zestawem podwójnych węzłów tuż dystalnie od pierwszego zestawu węzłów.</li>
<li>Przetnij odcinek tętnicy udowej pomiędzy węzłami dystalnymi a proksymalnymi za pomocą precyzyjnego patyczka bawełnianego i nożyczek sprężynowych. Zachowaj ostrożność, aby nie przebić ściany żyły udowej.</li>
<li>Usuń retraktor i zamknij nacięcie za pomocą szwów Vicryl 5-0. Szwów tych nie trzeba usuwać w późniejszym czasie, ponieważ rozpuszczają się one samoistnie.</li>
<li>Po zamknięciu nacięcia umieść zwierzę na przykrytej podkładce grzewczej w klatce regeneracyjnej i monitoruj je不ustannie aż do wybudzenia.</li>
<li>Po tym, jak zwierzę regenerowało się przez 1 godzinę, przejdź do etapu pomiaru perfuzji krwi metodą laserowego Dopplera, aby potwierdzić indukcję niedokrwienia.</li>
</ol>
2. Laserowy pomiar przepływu krwi metodą Dopplera
<ol>
<li>Aby rozpocząć etap pomiaru perfuzji metodą laserowego dopplera, umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej 1–3% isofluranu w 100% tlenie przy przepływie 1L/min.</li>
<li>Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu utraty reakcji na bodźce zewnętrzne, a następnie wyjmij zwierzę z komory. Zaleca się przed otwarcie pokrywy usunąć środek znieczulający z pudełka, aby zmniejszyć ekspozycję operatora na isofluran.</li>
<li>Umieść zwierzę na stole przedoperacyjnym podłączonym do ciągłego przepływu isofluranu. Następnie usuń sierść z kończyny tylnej za pomocą golarki elektrycznej, a w razie potrzeby zastosuj krem do depilacji.</li>
<li>Po usunięciu sierści umieść zwierzę na powierzchni podgrzewanej do 37°C na 5 minut pod ciągłym przepływem isofluranu. Monitoruj temperaturę wewnętrzną, aby zapewnić eutermię, ponieważ zmiany temperatury znacząco wpływają na perfuzję.</li>
<li>Po 5 minutach ułóż zwierzę w pozycji grzbietowej na powierzchni nieodbijającej i pochłaniającej światło, takiej jak zielone tkanina, podłączając je do ciągłego przepływu isofluranu. Wyprostuj kończyny tylne.</li>
<li>Następnie włącz obrazowy system laserowego dopplera oraz oprogramowanie do akwizycji i zainicjuj program. Określ rozmiar pola widzenia i rozdzielczość. W celu ułatwienia późniejszej analizy najlepiej zachować spójne pole widzenia i gęstość pikseli dla wszystkich zwierząt.</li>
<li>Otwórz nowy plik. Naciśnij start, aby rozpocząć zbieranie danych obrazowych. Zazwyczaj urządzenie automatycznie wykrywa odległość myszy, ale jeśli pojawi się prośba, określ odległość zwierzęcia od obrazownika. Laser wyznaczy granice pola widzenia, a następnie rozpocznie akwizycję danych.</li>
<li>Po zakończeniu akwizycji obraz zacznie wyświetlać zakres kolorów wskazujących poziom perfuzji krwi w kończynach. Kolory można ustawić dla konkretnego zakresu perfuzji, aby lepiej porównać dane między zwierzętami.</li>
<li>Po zakończeniu zbierania danych zapisz plik.</li>
<li>Następnie przenieś zwierzę do klatki regeneracyjnej i monitoruj je nieprzerwanie aż do wybudzenia.</li>
<li>Aby przeanalizować dane, użyj funkcji regulacji progu w oprogramowaniu analitycznym, aby odjąć szum tła. Wartość progu 0,2 jest zazwyczaj odpowiednia. Wyznacz 2 regiony zainteresowania (ROI), które obejmują obszar każdej kończyny tylnej. Do standaryzacji ROI między kończynami i zwierzętami można wykorzystać różne punkty orientacyjne. Następnie wyznacz średnią perfuzję i zmienność w ROI. Można wówczas łatwo określić różnicę w perfuzji oraz stosunek perfuzji między kończyną niedokrwienną a kontrolną.</li>
<li>Procedurę tę można powtórzyć, aby śledzić zmiany perfuzji kończyn tylnych w czasie. W wybranym punkcie czasowym zwierzę można poddać eutanazji w celu oceny funkcji tkanek i porównania wyników z danymi obrazowymi perfuzji.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Anatomia naczyń krwionośnych kończyny tylnej przedstawiona jest na Rysunku 12. Reprezentacyjny schemat kończyny tylnej po eksplantacji tętnicy udowej pokazano na Rysunku 2. Aby potwierdzić indukcję niedokrwienia kończyny tylnej, przeprowadzono analizę obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera, która wykazuje gwałtowny spadek przepływu krwi w kończynie niedokrwionej w porównaniu z kończyną kontrolną, co przedstawiono na Rysunku 3.
<img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_26_9/figure1_1035.png" alt="Schemat anatomiczny zabiegu pokazujący tętnicę, żyłę i nerw udowy; proksymalne i dystalne miejsca podwiązania." width="600" height="406" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Rysunek 1. Anatomia naczyń krwionośnych kończyny tylnej. Gwiazdkami oznaczono miejsca podwiązania w celu indukcji niedokrwienia kończyny tylnej.
<img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_7/Niiyama_HLI_Fig2.png" alt="Schemat operacji eksperymentalnej przedstawiający ligację proksymalnej i dystalnej tętnicy udowej; procedura naczyniowa." width="600" height="450" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2">
Rysunek 2. Reprezentatywny schemat przedstawiający anatomię kończyny tylnej po podwiązaniu tętnicy udowej w miejscach proksymalnym i dystalnym po usunięciu tętnicy udowej.
<img src="/files/ftp_upload/old/1035_2009_1_20_8/Niiyama_HLI_Fig3.png" alt="Porównanie przepływu krwi przed i po niedokrwieniu, obraz termograficzny zmian naczyniowych." width="600" height="256" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3">
Rysunek 3. Obrazy z laserowej dopplerometrii pokazujące przepływ krwi przed i po wywołaniu niedokrwienia w lewej kończynie tylnej (wskazanej strzałką).

<ol><li>Huang, N. F., Niiyama, H., De, A., Cooke, J. P., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+non-invasive+tracking+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+treatment+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation and non-invasive tracking of embryonic stem cell-derived endothelial cells for treatment of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCook%2C+MJ+%22The+anatomy+of+the+laboratory+mouse%22">The anatomy of the laboratory mouse</a>. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Dokun, A. O., Keum, S., Hazarika, S., Li, Y., Lamonte, G. M., Wheeler, F., Marchuk, D. A., Annex, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+trait+locus+%28LSq-1%29+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li>
</ol>

Podczas planowania i przeprowadzania modeli niedokrwienia kończyn dolnych należy wziąć pod uwagę kilka źródeł zmienności. Po pierwsze, stopień niedokrwienia może różnić się w zależności od miejsca podwiązania w stosunku do odgałęzień bocznych. Dlatego, dla zachowania spójności modelu, zwierzęta powinny zostać poddane podwiązaniu tętnicy na tym samym poziomie. Innym źródłem zmienności w regeneracji niedokrwiennej jest wiek zwierząt; młodsze osobniki (6–8 tygodni) wykazują szybszy i pełniejszy stopień regeneracji niż zwierzęta starsze (8–10 miesięcy), co potwierdzają pomiary hemodynamiczne (np. laserowy pomiar przepływu Dopplerem) lub funkcjonalne (np. testy na bieżni). W badaniach nad czynnikami angiogennymi może być korzystniejsze zastosowanie starszych zwierząt, ponieważ interwencja terapeutyczna może przynieść wyraźniejszą różnicę między grupami. Z kolei w badaniach nad czynnikami antyangiogennymi może być preferowane użycie młodszych zwierząt, aby zmaksymalizować wielkość efektu3.
Przy prawidłowym wykonaniu powikłania, takie jak krwawienie, infekcja czy śmiertelność, powinny być minimalne. W przypadku wystąpienia krwawienia w wyniku przypadkowego uszkodzenia żyły udowej lub innych naczyń, w miejscu krwotoku należy zastosować umiarkowany ucisk za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką lub gazy, aż do czasu ustąpienia krwawienia. Zwierzęta wykazujące objawy infekcji powinny być leczone środkami przeciwinfekcyjnymi. Zwierzęta z istotną gangreną mogą wymagać eutanazji. Powikłanie to występuje częściej u starszych zwierząt oraz u niektórych szczepów, takich jak myszy BALB c4. Ponadto model niedokrwienia kończyn dolnych może powodować lekki lub umiarkowany ból. W związku z tym, zgodnie z zaleceniami IACUC, w razie potrzeby należy podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina lub karprofen, w celu leczenia bólu.
Podsumowując, zaprezentowaliśmy prostą i powtarzalną metodę badania PAD w mysim modelu niedokrwienia kończyny dolnej. Model niedokrwienia kończyny dolnej z analizą obrazowania laserowskim Dopplerem stanowi doskonały system do badania patologii naczyniowych oraz oceny potencjalnych środków terapeutycznych.

<table><tbody><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patyczki bawełniane Constix</td><td>Narzędzie</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (powidonu jodowy</td><td>Odczynnik</td><td>PDI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% alkohol</td><td>Odczynnik</td><td>Kendall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nici jedwabne 7-0</td><td>Narzędzie</td><td>Genzyme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nici vicryl 5-0</td><td>Narzędzie</td><td>Ethicon Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golarka elektryczna</td><td>Narzędzie</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kauteryzator</td><td>Narzędzie</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Laser Doppler i PeriScan PIM 3</td><td>Urządzenie</td><td>Perimed</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

W Stanach Zjednoczonych choroba tętnic obwodowych (PAD) dotyka około 10 milionów osób i jest również powszechna na całym świecie. Możliwości terapii medycznych w celu łagodzenia objawów są ograniczone. Interwencje chirurgiczne lub wewnątrznaczyniowe są pomocne u niektórych pacjentów, lecz długoterminowe wyniki są często rozczarowujące. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania nowych metod leczenia PAD. Model niedokrwienia kończyny tylnej myszy jest modelem PAD i jest przydatny do testowania nowych terapii. W porównaniu z innymi modelami niedokrwienia tkanek, takimi jak podwiązanie tętnicy wieńcowej lub mózgowej, podwiązanie tętnicy udowej zapewnia prostszy model tkanki niedokrwionej. Innymi zaletami tego modelu są łatwy dostęp do tętnicy udowej oraz niski wskaźnik śmiertelności. 
W tym filmie prezentujemy metodologię tworzenia mysiego modelu jednostronniego niedokrwienia kończyny tylnej. Opisane zostaną konkretne materiały i procedury służące do opracowania i oceny modelu, w tym ocena perfuzji kończyny za pomocą obrazowania laser Dopplerowskiego. Niniejszy protokół może być również wykorzystany do transplantacji i nieinwazyjnego śledzenia komórek, co zostało zademonstrowane przez Huang et al.1.

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

W Stanach Zjednoczonych choroba tętnic obwodowych (PAD) dotyka około 10 milionów osób i jest również powszechna na całym świecie. Terapie medyczne w przypadku...

W Stanach Zjednoczonych choroba tętnic obwodowych (PAD) dotyka około 10 milionów osób, w szczególności palaczy, diabetyków oraz osób powyżej 70. roku życia. Ogólnym celem tej operacji jest wywołanie niedokrwienia kończyny dolnej poprzez podwiązanie proksymalnego i dystalnego odcinka tętnicy udowej. Procedura rozpoczyna się od znieczulenia, wygolenia i ułożenia myszy na stole operacyjnym w pozycji na plecach.Następnie wykonuje się nacięcie skóry od kolana w kierunku przyśrodkowej części uda, odsłaniając leżącą pod nią tętnicę udową. Kolejnie tętnica udowa zostaje ostrożnie oddzielona od żyły udowej. W miejscu podwiązania dystalnego oraz proksymalnego zawiązuje się podwójne węzły.Następnie wycina się odcinek tętnicy udowej. Miejsce nacięcia zostaje zamknięte szwami, a zwierzęciu pozwala się dojść do siebie po znieczuleniu. Aby potwierdzić indukcję niedokrwienia kończyny tylnej, znieczuloną mysz umieszcza się w pozycji na plecach.Następnie obie kończyny tylne są skanowane za pomocą lasera Dopplera. Obraz zostaje zapisany, a następnie oceniony pod kątem perfuzji. Cześć, jestem John Cook.Jestem profesorem medycyny w dziale medycyny układu sercowo-naczyniowego na Uniwersytecie Stanforda. Nasze laboratorium zajmuje się angiogenezą i regeneracją naczyń krwionośnych. W tym filmie dwoje moich stypendystów podoktorskich, dr Nan Wong i Hir Niyama, przedstawi Państwu przygotowanie modelu niedokrwienia kończyny tylnej myszy, który jest istotnym modelem choroby tętnic obwodowych i często wykorzystywanym w naszym laboratorium do oceny wpływu czynników wzrostu oraz terapii komórkowej na angiogenezę.Stosujemy te procedury w naszym laboratorium do badania wpływu komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych na naprawę naczyń krwionośnych. Przejdźmy zatem do części praktycznej. Narzędzia chirurgiczne niezbędne do tego zabiegu obejmują pęsetę precyzyjną, pęsetę ząbkowaną, nożyczki sprężynowe, nożyczki chirurgiczne, uchwyt do igieł oraz rozierak.Własnoręcznie wykonujemy retraktor za pomocą spinacza do papieru, ponieważ jest on mniejszy niż dostępne komercyjnie narzędzia. Przed operacją należy wysterylizować te narzędzia za pomocą sterylizatora kuleczkowego, będą również potrzebne narzędzie do kauteryzacji oraz sterylne bawełniane patyczki z cienkim końcem. Gdy narzędzia będą gotowe, umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej od 1 do 3% izofluranu w 100% tlenie przy przepływie 1 l/min.Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Umieść zwierzę w pozycji grzbietowej na stole operacyjnym i podłącz je do ciągłego przepływu izofluranu.Za pomocą golarki elektrycznej usuń owłosienie z kończyny tylnej. Nałóż krem do depilacji, aby dokładnie usunąć pozostałe włosy. Po ogoleniu myszy wyprostuj kończynę tylną i przymocuj ją za pomocą kawałka taśmy.Po unieruchomieniu kończyny tylnej przemyć skórę trzykrotnie naprzemiennie Betadine i alkoholem. Za pomocą cienkich pęset i nożyczek chirurgicznych wykonać nacięcie skóry o długości około jednego centymetra od kolana w stronę przyśrodkowej części uda, używając do tego nasączonych PBS (buforu fosforanowego) precyzyjnych patyczków bawełnianych.Delikatnie usuń pędzlem tkankę tłuszczową podskórną otaczającą mięsień uda. Następnie, przykładając kauteryzator w poprzek, przetnij tkankę tłuszczową podskórną, aby odsłonić leżącą pod nią tętnicę udową. W dalszej kolejności użyj rozieracza, aby otworzyć ranę i uzyskać lepszy wgląd w naczynia krwionośne kończyny dolnej.Używając precyzyjnej pęsety i cienkiego patyczka z watą, ostrożnie przebijamy błoniastą pochewkę udową, aby odsłonić pęczek naczyniowo-nerwowy. Następnie, używając czystego zestawu precyzyjnej pęsety i patyczka z watą, preparujemy i oddzielamy tętnicę udową od żyły udowej i nerwu w miejscu proksymalnym w pobliżu pachwiny. Po preparacji przekładamy nić jedwabna 7-0 pod proksymalny koniec tętnicy udowej.Zamknij proksymalny odcinek tętnicy udowej za pomocą podwójnych węzłów. Umieść wiązanie na naczyniu tak proksymalnie w ranie, jak to możliwe, aby pozostawić miejsce na drugie wiązanie oraz pomiędzy nimi odcinek, który zostanie przecięty. Oddziel tętnicę udową od żyły udowej w miejscu dystalnym, blisko kolana.Przełożyć nić chirurgiczną 7-0 pod dystalny koniec tętnicy udowej, proksymalnie względem tętnicy podkolanowej. Zamknąć naczynie, zawiązując podwójne węzły. Zamknąć dystalną część tętnicy udowej drugim zestawem podwójnych węzłów, bezpośrednio proksymalnie od pierwszego zestawu węzłów.Ten drugi zestaw szwów zostanie wykorzystany do chwytania tętnicy podczas procedury przecięcia. Analogicznie, w celu chwycenia, zamknij tętnicę udową proksymalnie za pomocą drugiego zestawu podwójnych węzłów, tuż dystalnie od pierwszego zestawu węzłów. Przetnij odcinek tętnicy udowej między węzłami dystalnym a proksymalnym, używając cienkiego, spiczastego patyczka watnego i nożyczek sprężynowych.Należy zachować ostrożność, aby nie przebić ściany żyły udowej. Usunąć retraktor i zamknąć nacięcie, używając szwów 5-0. Po zamknięciu nacięcia umieścić zwierzę w klatce do rekonwalescencji i monitorować do momentu wybudzenia. Po godzinie rekonwalescencji zwierzęcia przystąpić do pomiaru perfuzji krwi metodą laserowego dopplerowskiego przepływomierza.Krok w celu potwierdzenia indukcji niedokrwienia. Aby rozpocząć etap laserowej dopplerowskiej oceny perfuzji, umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej od 1 do 3% izofluranu w 100% tlenie przy przepływie 1 l/min. Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne.Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i umieść je na stole przedoperacyjnym z podłączonym ciągłym przepływem izofluranu. Następnie usuń owłosienie z kończyny tylnej za pomocą golarki elektrycznej, a w razie potrzeby zastosuj krem do depilacji. Po usunięciu włosów umieść zwierzę na powierzchni podgrzanej do 37 °C przez pięć minut przy ciągłym przepływie izofluranu.Po pięciu minutach umieść zwierzę w pozycji grzbietnej na powierzchni nieodbijającej i pochłaniającej światło, takiej jak zielone tkaniny, podłączonej do ciągłego przepływu izofluranu. Wyprostuj kończyny tylne. Następnie włącz obrazujący laser doppler i oprogramowanie akwizycyjne, a następnie zainicjuj oprogramowanie.Określ wielkość pola widzenia oraz rozdzielczość. Najlepiej zachować spójność pola widzenia i gęstości pikseli pomiędzy zwierzętami. W celu ułatwienia późniejszej analizy otwórz nowy plik.Naciśnij start, aby rozpocząć pozyskiwanie danych obrazowych. Po wyświetleniu prośby określ odległość zwierzęcia od obrazownika. Laser wskaże granice pola widzenia, a następnie rozpocznie się pozyskiwanie danych.Po zakończeniu akwizycji obraz zacznie wyświetlać zakres kolorów wskazujących poziom perfuzji krwi w kończynach dolnych. Kolory można ustawić dla konkretnego zakresu perfuzji. Aby lepiej porównać dane między zwierzętami po zakończeniu akwizycji, należy zapisać plik, a następnie przenieść zwierzę do klatki rekonwalescencyjnej i monitorować je w sposób ciągły aż do przebudzenia.Aby przeanalizować dane, należy użyć funkcji regulacji progu w oprogramowaniu analitycznym w celu odjęcia szumu tła. Wartość progu 0.2 jest zazwyczaj odpowiednia. Wybierz dwa obszary zainteresowania (ROI), które obejmują obszar każdej kończyny tylnej.Do standaryzacji ROI pomiędzy kończynami i zwierzętami można wykorzystać różne punkty orientacyjne, a następnie określić średnią perfuzję oraz zmienność w obrębie ROI. Można wówczas łatwo obliczyć różnicę perfuzji oraz stosunek perfuzji pomiędzy kończyną niedokrwienną a kontrolną. Procedurę tę można powtarzać, aby monitorować zmiany w perfuzji kończyny tylnej.Po upływie określonego czasu, w wybranym punkcie czasowym, zwierzę można poddać eutanazji w celu oceny funkcji tkanek. W porównaniu z danymi obrazowymi z perfuzji, przedstawiono tutaj reprezentatywny schemat kończyny tylnej po wyjałowieniu tętnicy udowej. Szwy zaznaczają miejsca proksymalnego i dystalnego podwiązania.Przy starannym wykonaniu zabiegu krwawienie jest minimalne, a operację można zakończyć w czasie krótszym niż jedna godzina. Oto wyniki analizy obrazu z laserowej dopplerowskiej oceny przepływu. Obraz po lewej stronie przedstawia perfuzję obu kończyn przed indukcją niedokrwienia.Obraz po prawej stronie przedstawia unaczynienie obu kończyn. Lewa kończyna tylna została poddana indukcji niedokrwiennej. Intensywność kolorów na obrazie wskazuje na wielkość przepływu krwi.W porównaniu z kończyną kontrolną, kończyna niedokrwiona wykazuje bardzo słabe zabarwienie, co sugeruje drastyczny spadek przepływu krwi. Na podstawie tych danych oprogramowanie może ilościowo określić średnią perfuzję w kończynie niedokrwionej i kontrolnej, aby wyznaczyć różnicę w perfuzji oraz stosunek perfuzji. Wyniki te potwierdzają zatem indukcję niedokrwienia kończyny tylnej.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób indukowania jednostronniego niedokrwienia kończyny tylnej w modelu mysim oraz potwierdzanie indukcji niedokrwienia za pomocą laserowej dopplerowskiej oceny perfuzji krwi. Model niedokrwienia kończyny tylnej z analizą obrazowania laserem dopplerowskim stanowi doskonały układ do badania patologii naczyniowych oraz oceny potencjalnych kandydatów terapeutycznych. Po tej procedurze można przeprowadzić transplantację i nieinwazyjne śledzenie komórek, co zostało zademonstrowane w innym filmie JoVE autorstwa Huang i wsp.Podczas wykonywania tych procedur należy pamiętać o zachowaniu ostrożności, aby nie przebić ściany żyły udowej podczas wycinania tętnicy udowej nożyczkami chirurgicznymi. Dla zapewnienia spójności modelu ciężkiego niedokrwienia, u wszystkich zwierząt w eksperymencie należy stosować analogiczne miejsce podwiązania. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Model mysiego niedokrwienia kończyny dolnej

Brak mechanistycznego zrozumienia uszkodzenia niedokrwienia rdzenia kręgowego i reperfuzji utrudnił dalsze działania wspomagające zapobieganie paraplegii po operacjach aorty wysokiego ryzyka. W związku z tym konieczny jest rozwój modeli zwierzęcych. Manuskrypt ten przedstawia powtarzalne porażenie kończyn dolnych po niedrożności aorty piersiowej w modelu mysim.

Odtwarzalna paraplegia przez niedrożność aorty piersiowej w mysim modelu niedokrwienia rdzenia kręgowego

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Opisujemy zabieg chirurgiczny stosowany do wywołania niedokrwienia obwodowego u królików z hiperlipidemią i cukrzycą. Operacja ta działa jako model przedkliniczny dla stanów doświadczanych w chorobie tętnic obwodowych u pacjentów. Angiografia jest również opisywana jako sposób pomiaru stopnia wprowadzonego niedokrwienia i odzyskania perfuzji.

Przedkliniczny model niedokrwienia kończyn tylnych u królików z cukrzycą

Tutaj prezentowany jest krytyczny eksperymentalny model niedokrwienia kończyn tylnych, a następnie przeprowadzany jest zestaw testów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu oceny skuteczności terapii angiogennych.

Ocena angiogenezy terapeutycznej w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych

Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.

Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej

Ten artykuł demonstruje skuteczne podejście chirurgiczne do ustalenia ostrego niedokrwienia u myszy z małym nacięciem. Takie podejście może być stosowane przez większość grup badawczych bez konieczności modernizacji laboratoriów.

Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

Tutaj opisujemy prostą i powtarzalną metodę, która może wywołać zawał mięśnia sercowego lub uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego u myszy poprzez precyzyjne podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej za pomocą mikromanipulacji.

Indukcja zawału mięśnia sercowego i uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego u myszy

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

Opisujemy, jak wygenerować powszechnie stosowany model chirurgiczny uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego jelit (IRI) u gryzoni. Zabieg polega na zamknięciu tętnicy krezkowej górnej, a następnie przywróceniu przepływu krwi. Model ten jest przydatny w badaniach nad okluzyjnymi przyczynami jelitowego IRI zarówno w medycynie weterynaryjnej, jak i ludzkiej.

Model gryzoni uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego jelit poprzez niedrożność tętnicy krezkowej górnej

Poznaj technikę chirurgiczną indukcji niedokrwienia kończyn tylnych u myszy poprzez podwiązanie tętnicy udowej. Metoda ta umożliwia badanie chorób naczyniowych i regeneracji naczyń krwionośnych.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

Przeglądaj więcej filmów