Name: Pomiar blisko błony komórkowej i globalnej wewnątrzkomórkowej dynamiki wapnia w astrocytach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Naucz się mierzyć globalną i blisko błonową dynamikę wapnia w astrocytach przy użyciu mikroskopii TIRF i epifluorescencji. Ta metoda umożliwia badanie sygnalizacji wapniowej w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez japońską fundację Uehara Memorial Foundation (dla ES), a także przez Whitehall Foundation, National Institute of Neurological Disorders and Stroke oraz nagrodę Stein-Oppenheimer Endowment Award (dla BSK).

PROCEDURY EKSPERYMENTALNE
Procedura eksperymentalna składa się z dwóch kluczowych części, które opisano poniżej krok po kroku.
Część 1: PRZYGOTOWANIE KULTUR ASTROCYTÓW HIPOKAMPA
W skrócie, mieszane kultury astrocytów i neuronów hipokampa przygotowano zgodnie z dobrze ugruntowanym protokołem1,2,3. Zoptymalizowaliśmy procedurę w celu uzyskania zdrowych hodowlanych astrocytów. Wszystkie wymienione poniżej czynności powinny być przeprowadzane w środowisku sterylnym, np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
<ul>
	<li>szkiełka nakrywki 22 mm (VWR, 48380-068)</li>
	<li>poly-D-lizyna (PDL, Sigma P0899), alikwoty (1 mg/ml)</li>
	<li>alikwoty lamininy (20 μg/ml): do roztworu lamininy 1 mg/ml (Sigma L2020) dodać 49 ml sterylnej wody, przygotować alikwoty po 1,2 ml i przechowywać w temperaturze -20°C</li>
</ul>
<ol>
	<li>Rozpuścić PDL w wodzie sterylnej (50 μg/ml)</li>
	<li>Autoklawować szkiełka nakładki, przepłukać wodą sterylną i umieścić w PDL (20 ml na 100 szkiełek). Pozostawić w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Zastąpić PDL wodą sterylną (3 dokładne płukania). Następnie osuszyć szkiełka i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Dzień przed wysianiem astrocytów, umieścić poszczególne szkiełka nakładki w sterylnych dołkach płytki 6-dołkowej (Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile od BD Bioscience). Na każde szkiełko nanieść 400 μl lamininy i inkubować przez noc w inkubatorze, aby zapobiec odparowaniu.</li>
</ol>

Disekcja
Podłoża do sekcji:
<ul>
	<li>500 ml zrównoważonego roztworu soli Earle'a (EBSS) (1X), ciecz (Invitrogen, 14155-063)</li>
	<li>5 ml roztworu HEPES (Sigma, H0887)</li>
</ul>

Pożywka hipokampalna:
<ul>
	<li>412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1X), roztwór zawiera sole Earle'a, ale nie zawiera L-glutaminy ani czerwieni fenolowej (Invitrogen, 51200-038)</li>
	<li>10 ml glukozy (Sigma, D-(+)-GLUCOSE ANHYDROUS SIGMA ULTRA G7528) 1 M w MEM</li>
	<li>5 ml Penicyliny-Streptomycyny (Invitrogen, 15140-122)</li>
	<li>5 ml roztworu pirogronianu sodu (Sigma, S8636)</li>
	<li>12,5 ml roztworu HEPES 1 M (Sigma, H0887)</li>
	<li>5 ml suplementu N-2 (100X), roztwór (Invitrogen, 17502-048)</li>
	<li>50 ml surowicy konia, inaktywowanej ciepłem (Invitrogen, 26050-088)</li>
</ul>


Roztwór papainy:
<ul>
	<li>Dodać 5 ml medium do dyssekcji do fiolki Worthington PAPAIN-022 (LK003178; stężenie końcowe 20 U/ml) i inkubować w temperaturze 37°C przez 60 min.</li>
</ul>

<ol>
	<li>Wykonaj dekapitację szczurek w wieku P1 (zazwyczaj 2 osobniki) zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez przepisy krajowe oraz lokalną Komisję ds. Dobrostanu i Opieki nad Zwierzętami (IACUC).</li>
	<li>Usuń skórę oraz czaszkę i umieść mózg w szalce Petri wypełnionej zimnym medium do sekcji.</li>
	<li>Usuń opony mózgowe, wypreparuj obie półkule, a następnie wypreparuj hipokampy.</li>
	<li>Pokrój hipokampy na fragmenty o rozmiarach ~1x1 mm i poddaj trawieniu w roztworze papainy w temperaturze 37°C przez 11-13 min.</li>
	<li>Gdy fragmenty tkanki osiądą, ostrożnie usuń papainę i dodaj 5 ml medium hipokampowego, aby usunąć wszelkie ślady enzymu. Powtórz ten krok, a następnie resuspenduj w medium hipokampowym (2 ml).</li>
	<li>Trituruj komórki około 5 razy, aż do całkowitego usunięcia grudek, używając trzech wypalanych pipet o progresywnie mniejszej średnicy otworu (1000 μm, ~500 μm i ~300 μm).</li>
	<li>Po trituracji przefiltruj komórki przez sitko do komórek (rozmiar oczek 70 μm, BD Bioscience). Policz komórki w 10 μl zawiesiny. Dostosuj objętość medium hipokampowego tak, aby uzyskać stężenie 400000 komórek/ml.</li>
	<li>Odsącz lamininę z szkiełek nakrywkowych i, zanim wyschną, nanieś 200 μl zawiesiny komórkowej na każde szkiełko.</li>
	<li>Pozostaw je na 60 min w inkubatorze w celu przytwierdzenia, a następnie dodaj 2 ml medium hipokampowego na każdą studnię.</li>
	<li>Następnego dnia odciągnij zużyte medium hipokampowe, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia, i dodaj 2 ml uprzednio ogrzanego, świeżego medium hipokampowego.</li>
</ol>

Konserwacja
Pożywka Neurobasal:
<ul>
	<li>500 ml medium Neurobasal (Invitrogen, 12348-017)</li>
	<li>10 ml suplement bezsurowiczy B27 (Invitrogen, 17504-044)</li>
	<li>5 ml penicyliny-streptomycyny (Invitrogen, 15140-122)</li>
	<li>1,25 ml L-glutaminy (Invitrogen, 25030-149)</li>
</ul>
Dokarmiaj hodowle astrocytów i neuronów dwa razy w tygodniu przy użyciu medium neurobasal, zaczynając cztery dni po wysianiu. Inkubuj medium wstępnie przez około 30 min w inkubatorze w wentylowanej kolbie w celu wyrównania temperatury i stężenia CO2.
Część 2: OBRAZOWANIE POZIOMU WAPNIA
Bufor do rejestracji z hipokampa: 110 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES (wszystkie odczynniki firmy Sigma) pH 7.4 (skorygowane za pomocą NaOH).
Wprowadzanie barwnika wskaźnika wapnia do astrocytów
<ol>
	<li>Umieścić kulturę w dołku płytki 6-dołkowej wypełnionej 2 ml buforu do rejestracji hipokampa zawierającego 2,5 μM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14217) i 0,05% 20% roztworu Pluronic® F-127 w DMSO (Invitrogen, P-3000MP) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-30 min.</li>
	<li>Usunąć roztwór Fluo-4 i przemyć szkiełka nakrywkowe 3 razy buforem do rejestracji hipokampa, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywowe w komorze i oczyścić drugą stronę szkiełka płynem do czyszczenia soczewek.</li>
	<li>Nałożyć jedną małą kroplę olejku imersyjnego (Immersion Oil TYPE DF od Cargille) na obiektyw i umieścić komorę (Open chamber for 25 mm round coverslip od Warner Instruments) na stole mikroskopu (Olympus IX71).</li>
	<li>Obejrzeć komórki w świetle przechodzącym, aby ocenić ich wygląd i ustawić ostrość. Następnie oświetlić komórki światłem o długości 488 nm z monochromatora (Polychrome V od TILL Vision) i sprawdzić, czy sygnał fluorescencji Fluo-4 w astrocytach jest jednorodny i wykrywalny.</li>
	<li>Użyć oświetlenia EPI i TIRF do pomiaru poziomu wapnia w astrocytach.</li>
</ol>

Mikroskopia TIRF
W skrócie, wykorzystujemy mikroskop Olympus IX71 wyposażony w kamerę EMCCD Andor IXON DV887DCS. Sterowanie wzbudzeniem i akwizycją obrazów odbywa się za pomocą oprogramowania TILLVision. Wiązki laserów argonowych 454/488/515 nm (100 mW) oraz laserów półprzewodnikowych 442 nm (45 mW) są łączone i kontrolowane za pomocą łącznika laserowego TILL Polyline, dwuportowego kondensora TIRF oraz akustyczno-optycznego filtru i kontrolera strojonego (AOTF; wszystkie od TILL Photonics), a następnie wprowadzane do szerokopasmowego włókna Kineflex w celu dostarczenia ich do kondensora TIRF. Do uzyskania efektu TIRF stosujemy obiektyw Olympus 60X 1.45 NA. Wzmocnienie sygnału w kamerze jest dostrajane dla każdego astrocytu, aby uzyskać obrazy o najlepszym stosunku sygnału do szumu. Podstawy i zasady mikroskopii TIRF zostały niedawno opisane w przeglądach literatury4, 5. Większość użytych komponentów optycznych została zakupiona w firmie TILL Photonics, która obecnie jest częścią Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). Głębokość penetracji TIR można obliczyć z poniższych równań.
<img alt="Równanie rozdzielczości optycznej z aperturą numeryczną NA na schemacie formuły mikroskopowej." src="/files/ftp_upload/1142/equation.jpg" style="float:left;" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie">

d = głębokość penetracji
n1 = współczynnik załamania światła szkła
n2 = współczynnik załamania światła komórki
a = kąt padania
NAi = apertura numeryczna padania
 
Aby upewnić się, że laser jest optymalnie ustawiony do TIRF, pomocne jest obserwowanie fluorescencyjnych kulek o średnicy 100 nm (Invitrogen, F8803). Przedstawiamy nieruchome klatki oraz filmy z kulek obrazowanych za pomocą mikroskopii EPI i TIRF. W trybie TIRF obserwuje się gwałtowny wzrost stosunku sygnału do szumu, a kulki wykazują dyfuzję Browna. Regularna obserwacja zachowania kulek 100 nm za pomocą mikroskopii TIRF (około raz w tygodniu) jest przydatna, aby mieć pewność, że zachodzi optymalny efekt TIRF, a nie niepełne oświetlenie skośne, które wystąpiłoby, gdyby kąt krytyczny nie był równy α (patrz Rys. 1).
Zastosowanie agonistów receptorów sprzężonych z białkiem G
Astrocyty wykazują ekspresję różnorodnych receptorów sprzężonych z białkiem Gq6, 7, w tym metabotropowych receptorów glutaminianu oraz receptorów P2Y (agoniści: ATP, ADP). Aktywacja tych receptorów prowadzi do znacznego wzrostu wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia w astrocytach. Przykładowo, można łatwo zaobserwować wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego podczas aplikacji ATP (30 μM) do astrocytów8-10. Wykorzystujemy szybki przełącznik roztworów firmy Warner Instruments, zwany VC-77SP Fast-Step Perfusion System (http://www.warneronline.com/index.cfm). Dzięki tej metodzie roztwory mogą być aplikowane w czasie krótszym niż ~10 ms.
<img alt="Układ spektroskopowy z mikroskopem Olympus IX71 i kamerą Andor iXon EMCCD; obejmuje AOTF i system laserowy." src="/files/ftp_upload/1142/fig1a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 
 
 
 
 
<img alt="Układ mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) wraz ze schematem analizy białek." src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" data-altupdatedat="1787630408000">
RYSUNEK 1. Schemat i fotografie układu obrazowania. A. Przedstawia fotografię mikroskopu zamontowanego na stole pneumatycznym, natomiast (B) pokazuje fotografię zestawu laserowego, sterowników i skrzynek wiązki. C. Przedstawia fotografię stolika mikroskopowego z zamontowaną komorą do obrazowania. Po lewej stronie widoczne jest urządzenie do szybkiej perfuzji (wraz z silnikiem krokowym i przewodami theta). Po prawej stronie widoczna jest głowica wzmacniacza Axopatch 200A. Schemat ilustruje drogę światła w układzie oraz sposób uzyskania TIRF. Laser jest ogniskowany na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu 60X 1,45 NA, a jego pozycja jest przesunięta względem centrum, tak aby wchodził do olejku imersyjnego pod kątem krytycznym α. W tym punkcie wiązka ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu i zanika wraz z odległością λ (patrz równanie w tekście głównym) w ośrodku o niższym współczynniku załamania. W tym przypadku jest to bufor rejestracyjny otaczający astrocyt oraz same astrocyty. Wynikiem jest wzbudzenie optyczne (a tym samym obrazowanie) cząsteczek znajdujących się w odległości ~100 nm od błony komórkowej. Na schemacie komórki jest to przedstawione jako zielone „wzbudzone” receptory błonowe, podczas gdy te wewnątrz komórki lub na jej górnej powierzchni nie są wzbudzone. Pełny opis mikroskopii TIRF został przedstawiony przez Steyera i Almersa4.
<img alt="Schemat mikroskopii EPI vs. TIRF; porównanie kontrastu, obrazowanie komórkowe, technika fluorescencyjna." src="/files/ftp_upload/1142/fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2">
RYSUNEK 2. Obrazy 100 nm fluorescencyjnych kulek uzyskane za pomocą mikroskopii EPI oraz TIRF. A. Przedstawia obrazy EPI pola widzenia z kilkudziesięcioma 100 nm fluorescencyjnymi kuleczkami. Czerwone strzałki wskazują kuleczki, które osiądąły na szklanej lamellce, podczas gdy niebieskie groty strzałek wskazują kuleczki dyfundujące w wodzie. B. Przedstawia obraz TIRF tego samego pola widzenia, co na rysunku A. W tym widoku widoczne są tylko przylegające kuleczki wskazane czerwonymi strzałkami. Wynika to z faktu, że osiądąły one na szklanej lamellce i znajdowały się zatem w obrębie pola ewanescentnego o zasięgu ~100 nm. Kuleczki pokazane na rysunku A niebieskimi strzałkami nie znajdują się w tym obszarze, przez co są niewidoczne na obrazach TIRF. Dolne wykresy przedstawiają renderowanie 3D obrazów. Wyraźnie widać, że w przypadku kuleczek w polu ewanescentnym obserwowanych za pomocą mikroskopii TIRF następuje znaczny wzrost stosunku sygnału do szumu. W rzeczywistości dla tych obrazów stosunek sygnału do szumu dla EPI wynosił 7,1 ± 0,6, natomiast dla TIRF wynosił on 20 ± 0,7.
<img alt="Porównanie mikroskopii fluorescencyjnej, EPI vs. TIRF; odpowiedź na ATP, wykres intensywności, pasek skali 10 µm." src="/files/ftp_upload/1142/fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3">
RYSUNEK 3. Obrazy astrocytów obciążonych wskaźnikiem wapnia Fluo-4, uzyskane za pomocą mikroskopii EPI i TIRF. A. Obrazy EPI pola widzenia zawierającego pięć astrocytów. B. Obraz TIRF tego samego pola widzenia przedstawionego w B. Należy zauważyć, że obrazy w A i B znacznie się od siebie różnią. Wynika to z faktu, że przy oświetleniu TIRF obrazowane są tylko regiony błony plazmatycznej znajdujące się w bliskim sąsiedztwie szklanego szkiełka cover slip. Dolne panele przedstawiają wywołane przez ATP przejściowe wzrosty stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego, zobrazowane za pomocą mikroskopii EPI i TIRF.

<ol><li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li>
<li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIA%3A+listening+and+talking+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li>
<li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

Jest dobrze udokumentowane, że astrocyty wykazują wzrosty stężenia wewnątrzkomórkowego wapnia. Zjawiska te występują spontanicznie lub mogą być wywoływane przez aktywność neuronalną bądź przez aplikację agonistów aktywujących receptory na powierzchni astrocytów11. Ważną i kontrowersyjną kwestią jest to, czy wewnątrzkomórkowe wzrosty stężenia wapnia w astrocytach mogą wywoływać uwalnianie cząsteczek sygnałowych, które aktywują receptory w neuronach11, 12. Kwestia ta pozostaje sporna, ponieważ istniej...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; szkiełka nakrywkowe, okrągłe, nr 1</td><td>Narzędzie</td><td>VWR International</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Hydrobromek poli-D-lizyny</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Laminina z błony podstawnej mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) (1X), ciecz</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) (1X), roztwór. Zawiera Earle&amp;rsquo;solem, ale bez L-glutaminy i czerwieni fenolowej</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>roztwór HEPES 1 M</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X), ciecz</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska, inaktywowana termicznie</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Odczynnik</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;#8482; Pożywka (1X) płynna bez czerwieni fenolowej</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>Suplement bezsurowiczy B-27 (50X), ciecz</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100X), roztwór</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Sita do oddzielania komórek</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne wielodołkowe płytki z płaskim dnem i pokrywkami BD Falcon</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; heksahydrat</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; heksahydrat</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>kwas HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>roztwór Fluo-4, AM o stężeniu 1 mM w DMSO</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&amp;#174; 20% roztwór F-127 w DMSO</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Olejek imersyjny TYPU DF</td><td>Mikroskop</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>Otwarta komora do okrągłych szkiełek nakrywkowych 25 mm, 100 szt. &amp;mu;objętość</td><td>Narzędzie</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Platforma P-2 dla komór serii 20, bez grzałki</td><td>Narzędzie</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>mikrosfery FluoSpheres modyfikowane karboksylowo, 0,1 &amp;mu;m, żółto-zielone fluorescencyjne (505/515) 2% ciało stałe</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Mózg zawiera komórki glejowe. Od dawna wiadomo, że astrocyty, będące rodzajem komórek glejowych, pełnią pasywną rolę wspierającą dla neuronów. Jednak coraz więcej dowodów sugeruje, że astrocyty mogą również aktywnie uczestniczyć w funkcjonowaniu mózgu poprzez funkcjonalne interakcje z neuronami. Niemniej wiele fundamentalnych aspektów biologii astrocytów pozostaje kontrowersyjnych, niejasnych i/lub nieopisanych eksperymentalnie. Ważną kwestią jest dynamika wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia w astrocytach. Ma to istotne znaczenie, ponieważ wapń jest uznany za ważny drugi przekaźnik, a ponadto wysunięto hipotezę, że wzrost stężenia wapnia w astrocytach może wywoływać uwalnianie z nich neurotransmiterów. Brakuje jednak szczegółowego lub satysfakcjonującego opisu sygnalizacji wapniowej w obrębie błony plazmatycznej astrocytów. Mikroskopia fluorescencyjna z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRF) jest potężnym narzędziem do analizy fizjologicznie istotnych zdarzeń sygnalizacyjnych w odległości około 100 nm od błony plazmatycznej żywych komórek. W niniejszej pracy wykorzystujemy mikroskopię TIRF i opisujemy sposób niemal symultanicznego monitorowania dynamiki wapnia w obrębie błony plazmatycznej oraz globalnej dynamiki wewnątrzkomórkowej. Dalsze dopracowanie i systematyczne zastosowanie tego podejścia może dostarczyć precyzyjnych informacji na temat sygnalizacji wapniowej astrocytów. Szczegółowe zrozumienie dynamiki wapnia w astrocytach może stanowić podstawę do wyjaśnienia, czy, w jaki sposób, kiedy i dlaczego astrocyty i neurony wchodzą w zależne od wapnia interakcje funkcjonalne.

Opisujemy sposób pomiaru dynamiki wapnia wewnątrzkomórkowego w pobliżu błony oraz w całej objętości komórki w hodowlach astrocytów, wykorzystując mikroskopię całkowitego wewnętrznego odbicia oraz epifluorescencyjną.

Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów

Mózg zawiera komórki glejowe. Astrocytom, rodzajowi komórek glejowych, od dawna przypisuje się pasywną rolę wspierającą neurony. Jednakże...

W pierwszej części tego filmu zaprezentujemy sposób przygotowania kokultury astrocytów i neuronów. W tym celu kilka struktur hipokampa od szczurów P1 zbiera się do probówki, poddaje trawieniu trypsyną, dysocjacji poprzez triturację, a następnie wysiewa na szkiełka podstawowe. Druga sekcja pokaże, jak mierzyć dynamikę wapnia wewnątrzkomórkowego w astrocytach, co obejmuje wprowadzanie barwnika wskaźnikowego wapnia Fluo-4 do astrocytów oraz pomiar globalnej dynamiki wapnia za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej i pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony za pomocą mikroskopii TIRF.Dzięki automatycznej i szybkiej zmianie oświetlenia można niemal jednocześnie obserwować poziom wapnia zarówno w całej komórce, jak i w pobliżu błony. Cześć, jestem Aji omi, badacz postdoktorski z Budget COS lab w Katedrze Fizjologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania wapnia w astrocytach.W badaniach laboratoryjnych stosujemy tę procedurę do analizy dynamiki wapnia w pobliżu błony oraz dynamiki globalnej w astrocycie. Dzięki automatycznej i szybkiej zmianie eliminacji możemy rozróżnić wapń globalny i wapń przybłonowy. Prawie jednocześnie pokażę, jak stosujemy TP, aby wywołać wzrost poziomu wapnia w astrocycie.Na koniec podsumuję i omówię kwestię bariery w kontekście metody badania astrocytów. Przejdźmy zatem do części praktycznej. Aby rozpocząć hodowlę astrocytów, należy usunąć skórę i czaszkę z głowy od decapitate szczura noworodka.Umieścić mózg w szalce Petri wypełnionej zimnym medium do sekcji, przeprowadzić sekcję obu półkul i usunąć oponami mózgowo-rdzeniowe. Następnie wypreparować hipokampy. Posiekać hipokampy na kawałki o wielkości około 1x1 mm.Trawić w roztworze Pappa w temperaturze 37°C przez 11 do 13 minut. Wyjąć wypreparowaną tkankę z inkubatora. Następnie, gdy fragmenty tkanki opadną, ostrożnie usunąć je z roztworu trawiennego i dodać pięć mililitrów medium do hipokampa, aby wypłukać posiekanymi fragmenty hipokampa.Powtórz ten krok, a następnie na koniec przesuś zawiesinę w medium hipokampalnym. Przeprowadź pipetowanie komórek około pięciu razy, używając trzech kolejno mniejszych pipet polerowanych w płomieniu. Następnie przepuść komórki przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm i dodaj do sitka cztery ml medium.Należy policzyć komórki w 10 µL zawiesiny. Następnie należy dostosować objętość medium hipokampalnego tak, aby uzyskać stężenie 400 000 komórek na mL. Teraz należy przygotować szkiełka nakrywkowe do wysiewu zawiesiny komórkowej, odsysając lamininę ze szkiełek, które były namaczane w roztworze lamininy przez noc.Zanim szkiełka zakrywadryingu wyschną, nanieś 200 µL zawiesiny komórkowej na każde szkiełko nakrywkowe. Pozostaw je na 60 minut w inkubatorze w celu adhezji. Po inkubacji dodaj 2 mL pożywki hipokampowej do każdej studni.Następnego dnia odessać stare pożywienie hipokampowe, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia, a następnie dodać dwa mililitry uprzednio ogrzanego świeżego pożywienia hipokampowego. Utrzymywanie kokultur astrocytów i neuronów należy rozpocząć cztery dni po wysianiu, dodając jeden mililitr świeżego pożywienia neurobasal dwa razy w tygodniu. Należy pamiętać o inkubacji pożywek przez około 30 minut w inkubatorze w wentylowanej kolbie w celu wyrównania temperatury i stężenia dwutlenku węgla.Przed badaniem astrocytów warto wykorzystać nanokulki fluorescencyjne w celu optymalizacji kąta lasera dla mikroskopii TURF. W tym celu na szalkę Petriego należy nanieść 200 µL wody, dodać 1 µL nanokulek fluorescencyjnych o średnicy 100 nm i wymieszać, a następnie poddać kulki obserwacji za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Następnie kulki należy obejrzeć przy użyciu mikroskopii TURF.W celu obrazowania wapnia umieść hodowlę w dołku płytki sześciodołkowej wypełnionej dwiema mililitrami buforu do rejestracji hipokampa zawierającego 2,5 µM Fluo-4 AM i 0,05% Pluronic F-127 (roztwór 20% w DMSO), a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 do 30 minut; pamiętaj o przykryciu płytki, aby uniknąć blaknięcia Fluo-4. Usuń roztwór Fluo-4 i przemyj szkiełka podstawowe trzy razy buforem do rejestracji hipokampa. Inkubuj przemyte szkiełka podstawowe w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze, oczyść drugą stronę szkiełka płynem do czyszczenia soczewek i dodaj 200 µL buforu hipokampowego. Nanieś jedną małą kroplę oleju immersyjnego na obiektyw i umieść komorę na stole mikroskopu. Obserwuj komórki w świetle przechodzącym, aby ustawić ostrość i ocenić ich wygląd.Następnie naświetl komórki światłem o długości 488 nanometrów z monochromatora i określ, czy sygnał fluorescencyjny flu oh four jest jednorodny i wykrywalny. W astrocytach zastosuj oświetlenie epi i turf, aby zmierzyć poziom wapnia w astrocytach. Tutaj kuleczki fluorescencyjne są obserwowane przy użyciu oświetlenia epi.Oprócz generowania fluorescencji tła, wykazują one również znaczący ruchy Browna w zależności od kąta oświetlenia. Gdy laser zbliża się do kąta krytycznego, wiązka laserowa ulega całkowitemu odbiciu od granicy szkło-woda. To całkowite wewnętrzne odbicie generuje pole elektromagnetyczne zwane polem ewanescentnym.Warstwa ta ma głębokość około 100 nanometrów wewnątrz komórki o niższym współczynniku załamania światła. Można wzbudzić fluorofory w tej cienkiej warstwie na powierzchni preparatu. Oto kulki fluorescencyjne obserwowane przy oświetleniu typu turf w porównaniu z oświetleniem epi.Stosunek sygnału do szumu oświetlenia znacznie wzrasta przy zmniejszeniu kąta. Wiązka lasera nie odbija się od powierzchni i przechodzi przez szkiełko nakrywkowe, uderzając bezpośrednio w kulki fluorescencyjne. Można zaobserwować silną fluorescencję tła.Teraz zwiększamy kąt. Ponownie szum tła znacząco maleje i można dostrzec fluorescencyjne koraliki w pobliżu powierzchni szkiełka nakrywkowego. Obrazy te przedstawiają astrocyty i neurony obciążone flu oh four.Astrocyty są płaskimi komórkami z cienkimi wypustkami, podczas gdy neurony mają okrągłe ciała komórkowe oraz grube i długie dendryty. Zarówno astrocyty, jak i neurony wyglądają na zdrowe i prawidłowo wypełnione barwnikiem fluorescencyjnym.Obserwacja astrocytów za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej jest użyteczna, aby sprawdzić, czy astrocyty są zdrowe i czy wskaźniki wapnia zostały prawidłowo wprowadzone do astrocytów. W obszarach astrocytów znajdujących się najbliżej szkiełka podstawowego, zwanych stopą (footprint), obserwuje się, że TP powoduje wzrost poziomu wapnia w pobliżu błony plazmatycznej. Znane jest, że astrocyty hipokampa wykazują ekspresję receptorów anergicznych, a podanie TP do kąpieli może spowodować globalne uwolnienie wapnia.Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować kulturę osteocytów hipokampa oraz jak mierzyć poziom wapnia w osteocytach zarówno globalnie, jak i w pobliżu błony plazmatycznej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o optymalizacji kąta lasera; najlepszym sposobem na zapewnienie tego na mikroskopie jest obserwacja zachowania przy prędkościach przepływu 100 millimeter. Jednoczesny pomiar globalnego poziomu wapnia oraz poziomu wapnia w pobliżu błony dostarczy nam nie tylko szczegółowego opisu sygnału wapniowego, ale także nowego wglądu w mechanizm regulacji wapnia w astrocytach.Doszliśmy również do wniosku, że opisane tutaj podejście jest użyteczne do pomiaru stężenia wapnia w pobliżu błony oraz globalnego stężenia wewnątrzkomórkowego w innych, nieznanych obszarach pobudliwych. To wszystko na dziś. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

measuring-near-plasma-membrane-global-intracellular-calcium-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena bliska błonie plazmatycznej i globalna dynamika wapnia wewnątrzkomórkowego w astrocytach

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Źródło: Bannai, H., et al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film demonstruje obrazowanie fluorescencyjne w celu obserwacji specyficznej dla przedziałów spontanicznej dynamiki wapnia w astrocytach poprzez sekwencyjne monitorowanie wrażliwych na wapń białek zlokalizowanych na błonie plazmatycznej i retikulum endoplazmatycznym.

Spontaniczne obrazowanie wapnia dla dynamiki specyficznej dla przedziałów w astrocytach

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Właściwości i funkcje wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ astrocytów w prążkowiu pozostają niew pełni zbadane. Opisujemy metody ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w astrocytach prążkowia przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami serotypu 2/5 (AAV2/5), a także procedury wiarygodnego obrazowania sygnałów Ca2 + w astrocytach prążkowia in situ.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Opisany tutaj protokół AWESAM jest optymalny do hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych w szybki, prosty i tani sposób. Astrocyty AWESAM wykazują spontaniczną sygnalizację Ca2 +, morfologię i profile ekspresji genów podobne do astrocytów in vivo.

Hodowla mysich astrocytów podobnych do vivo przy użyciu szybkiego, prostego i niedrogiego protokołu AWESAM

Pokazane są tutaj protokoły (1) świeżo izolowania nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu oraz (2) jednoczesnych pomiarów śródbłonka wapnia i potencjału błonowego podczas hiperpolaryzacji pochodzącej ze śródbłonka. Co więcej, metody te pozwalają na farmakologiczne dostrojenie wapnia w komórkach śródbłonka i sygnalizacji elektrycznej jako indywidualnych lub interaktywnych zmiennych eksperymentalnych.

Jednoczesne pomiary wewnątrzkomórkowego potencjału wapnia i błony w świeżo wyizolowanym i nienaruszonym śródbłonku mózgowym myszy

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Tutaj opisujemy metodę obrazowania na żywo in vitro, która umożliwia wizualizację wewnątrzkomórkowego transportu organelli i transportu białek błony komórkowej w mysich astrocytach. W protokole tym przedstawiono również metodologię analizy obrazu w celu wyznaczenia tras transportu i kinetyki transportu ładunków.

Wizualizacja i analiza transportu wewnątrzkomórkowego organelli i innych ładunków w astrocytach

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Naucz się mierzyć globalną i blisko błonową dynamikę wapnia w astrocytach przy użyciu mikroskopii TIRF i epifluorescencji. Ta metoda umożliwia badanie sygnalizacji wapniowej w układzie nerwowym.

Pomiar dynamiki wapnia w pobliżu błony plazmatycznej oraz w całej przestrzeni wewnątrzkomórkowej astrocytów

Przeglądaj więcej filmów