Name: Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Naucz się izolacji protoplastów z 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana. Ta metoda wykorzystuje trawienie enzymatyczne i gradient gęstości sacharozy, zapewniając żywotność komórek przez co najmniej 96 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez grant Hatch NYC-125433 Cornell University Agricultural Experiment Station (CUAES) oraz grant startowy Cornell przyznany O.K.V.

Część 1. Przygotowanie pożywki stałej do hodowli roślin.
Rośliny hodujemy zazwyczaj na skoncentrowanym pożywce Murashige i Skoog (MS) z dodatkiem 1% sacharozy i 0,7% agaru. Zawiera ona wszystkie niezbędne składniki do utrzymania roślin w dobrej kondycji.
Do przygotowania 1L pożywki MS o pH 5,7
<ol>
	<li>Wlać 800 ml wody do butelki autoklawowalnej o pojemności 1,5–2,0 L i dodać 2,15 g proszku MS.</li>
	<li>Włożyć do butelki mieszadło magnetyczne i rozpuścić proszek MS, mieszając pożywkę na mieszalniku magnetycznym.</li>
	<li>Podczas mieszania dodawać kroplami 1N KOH, aby dostosować pH pożywki MS do wartości 5,7.</li>
	<li>Dodać 10 g sacharozy, cały czas mieszając.</li>
	<li>Dodać 7 g agaru *.</li>
	<li>Dopełnić przygotowaną pożywkę do końcowej objętości 1000 ml i wysterylizować w autoklawie.*</li>
	<li>Umieścić wysterylizowaną pożywkę na mieszalniku magnetycznym i schłodzić ją podczas mieszania, aby agar nie osadził się na dnie butelki. Schłodzić pożywkę do temperatury ~ 60 °C.*</li>
	<li>Wylać pożywkę na płytki Petriego o średnicy 100 mm. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
*Wskazówka 1: Nie próbuj rozpuszczać agaru. Rozpuści się on podczas autoklawowania. 
*Wskazówka 2: Pozostaw mieszadełko magnetyczne w butelce podczas autoklawowania, będzie ono potrzebne później. 
*Wskazówka 3: Jeśli możesz trzymać dłonie na autoklawowanej butelce przez 10 s, oznacza to, że pożywka wystarczająco ostygła i można rozpocząć wlewanie na płytki.
Część 2. Materiał roślinny i warunki wzrostu.
<ol>
	<li>Sterylizacja nasion Arabidopsis thaliana
	<ol>
		<li>Umieścić 100 mg nasion w probówkach typu Eppendorf i dodać 1 ml 70% etanolu. Dobrze wymieszać i inkubować przez 2 min. Wirować nasiona, a następnie odessać nadsącz.</li>
		<li>Dodać 1 ml 1,8% roztworu wybielacza* zawierającego 0,1% Tween-20. Mieszać przez 10 min. Wirować nasiona i odessać roztwór wybielacza.</li>
		<li>Ten etap musi być wykonany w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Dodać 1 ml sterylnej wody do nasion i dobrze wymieszać. Wirować nasiona i odessać wodę. Powtórzyć ten krok 5 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozsiać nasiona na płytkach przygotowanych w kroku 1 (100 nasion/płytka).</li>
	<li>Przechowywać wysiane płytki przez 24-48 h w temperaturze 4 °C w ciemności w celu przeprowadzenia stratyfikacji.</li>
	<li>Uprawiać rośliny przez 14 dni w komorze wzrostowej z fotoperiodem 8 h światła/16 h ciemności (przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych 250 μmol m-2s-1), w reżimie temperatury 23/19 °C (światło/ciemność) i przy 75% wilgotności względnej.</li>
</ol>
*Wskazówka 1: Roztwór wybielacza przygotowuje się poprzez rozcieńczenie domowego środka Clorox, zawierającego 6% podchlorynu sodu, i dodanie Tween-20 do stężenia końcowego 0,1%.
Część 3. Izolacja protoplastów z siewek Arabidopsis.
<ol>
	<li>Posiekaj 2 g 14-dniowych siewek za pomocą nowej żyletki w 15 ml filtrowanego i sterylizowanego roztworu TVL. Materiał roślinny siekamy w sterylnych jednorazowych szalkach Petriego.</li>
	<li>Przenieś posiekane tkanki do zlewki o pojemności 200 ml, dodaj 20 ml filtrowanego i sterylizowanego roztworu enzymatycznego, zamieszaj zlewkę, aby tkanki wymieszały się z roztworem enzymatycznym, a następnie przykryj parafilmem i folią aluminiową.</li>
	<li>Wstrząsaj tkankami roślinnymi z prędkością 35 rpm w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 16-18 h.</li>
	<li>Zabierz uwolnione protoplasty do probówki Falcon 50 ml, przeciskając materiał przez 8 warstw gazy, uprzednio zwilżonej roztworem W5.</li>
	<li>Przeciągnij protoplasty z gazy jeszcze raz, przemywając ją 15 ml roztworu W5.</li>
	<li>Ostrożnie nałóż 10 ml roztworu W5 na protoplasty, nie naruszając gradientu cukrowego; wiruj przez 7 min przy 100 g.</li>
	<li>Zbierz 10 ml protoplastów z granicy roztworu enzymatycznego i roztworu W5 (Rys. 1B) i przenieś je do nowej probówki Falcon 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 15 ml roztworu W5, wiruj przez 5 min przy 60 g. Usuń nadsącz.</li>
	<li>Wypłucz protoplasty z roztworu enzymatycznego, resuspendując je w 15 ml roztworu W5, a następnie wiruj przez 5 min przy 60 g.</li>
	<li>Usuń nadsącz, resuspenduj osad protoplastów w 1-3 ml roztworu W5.</li>
	<li>Oceń wydajność izolacji protoplastów, wykonując zliczenie komórek za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
Część 4. Odczynniki:
TVL: 0,3 M sorbitolu; 50 mM CaCl2 Przefiltrować przez sterylizator i przechowywać w temperaturze -20 °C.
Roztwór enzymu: 0,5 M sacharozy, 10 mM MES-KOH [pH 5,7], 20 mM CaCl2, 40 mM KCl, 1% celulazy (Onozuka R-10), 1% macerozymu (R10). Sterylizować przez filtr i używać bezpośrednio po przygotowaniu.
Roztwór W5: 0,1% (w/v) glukozy, 0,08% (w/v) KCl, 0,9% (w/v) NaCl, 1,84% (w/v) CaCl2, 2 mM MES-KOH pH 5,7. Sterylizować przez filtr i przechowywać w temperaturze pokojowej.
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
Zastosowanie warunków hodowli Arabidopsis opisanych w częściach 1 i 2 pozwala uzyskać zdrowe siewki, odpowiednie do izolacji protoplastów (Rys. 1A). Protoplasty są oczyszczane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy i zbierane na granicy roztworów W5 oraz enzymów (Rys. 1B). Stosując procedurę izolacji protoplastów opisaną w części 3, zazwyczaj pozyskujemy 5-10 106 nienaruszonych protoplastów (Rys. 1C) z jednego grama świeżych siewek.
<img alt="Eksperyment ekstrakcji chlorofilu; szalka Petriego, probówki do wirowania, mikroskopowa struktura komórki." src="/files/ftp_upload/1149/1149fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Izolacja protoplastów z siewek Arabidopsis. A, Tkanki z 14-dniowych siewek Arabidopsis zostały pobrane i przekształcone w protoplasty zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą według (Chen and Halkier, 2000). B, Protoplasty zostały oczyszczone metodą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy i zebrane na granicy roztworu enzymu i buforu W5 (białe strzałki). C, Mikroskopia protoplastów w polu jasnym. Mikrofotografie wykonano przy użyciu chłodzonej kamery CCD połączonej z mikroskopem Zeiss Axioscope 2 plus.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

Wstępny wniosek patentowy opisujący tę procedurę w zastosowaniu do analiz funkcjonalnych genów roślin został złożony w Cornell Center For Technology Enterprise and Commercialization (CCTEC) w czerwcu 2008 r. Numer akt 50341/015001: Vatamaniuk, O.K., oraz Zhai, Z. Metoda szybkiej analizy funkcjonalnej genów roślin.

Aby zapewnić wysoką wydajność uzyskania nienaruszonych protoplastów, bardzo ważne jest rozpoczęcie pracy ze zdrowymi roślinami. Do izolacji protoplastów należy używać roztworów sterylizowanych przez filtr. Należy pamiętać, że protoplasty są delikatne. Dlatego podczas pracy z protoplastami nie wolno ich intensywnie mieszać, pipetować ani wstrząsać na wortexie, ponieważ spowoduje to ich uszkodzenie. Zamiast tego protoplasty należy mieszać poprzez powolne obracanie lub delikatne opukiwanie probówki do wirowania. Opisana pro...

<table><tbody><tr><td>Podstawowa mieszanina soli Murashige i Skoog (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (100x15mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza (OnozukaR&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>Gaza laboratoryjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>Rotator laboratoryjny</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka AllegraX&amp;#8208;15R</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Axioskop 2 Plus</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek arabidopsis thaliana

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasty to komórki roślinne, z których ściany komórkowe zostały usunięte enzymatycznie. Izolacja protoplastów z różnych tkanek roślinnych została po raz pierwszy opisana ponad 40 lat temu1i od tego czasu była adaptowana do badania różnych procesów komórkowych, takich jak lokalizacja subkomórkowa białek, izolacja nienaruszonych organelli oraz ukierunkowana inaktywacja genów poprzez interferencję RNA (RNAi) za pomocą dwuniciowego RNA2-5Większość protokołów izolacji protoplastów wykorzystuje tkanki liściowe dojrzałych roślin Arabidopsis (np. roślin w wieku 35 dni)2-4Zmodyfikowaliśmy istniejące protokoły, wykorzystując 14-dniowe siewki *Arabidopsis*. W tej procedurze jeden gram 14-dniowych siewek dostarczył 5 106-107protoplasty, które pozostają nienaruszone przez co najmniej 96 godzin. Wydajność uzyskiwania protoplastów z siewek jest porównywalna z preparatami z liści dojrzałych roślin Arabidopsis, jednak izolacja protoplastów zostaje zakończona w ciągu 15 dni, a nie 35-36 dni. Pozwala to na skrócenie czasu oraz zmniejszenie zapotrzebowania na przestrzeń w komorze wzrostowej, wymaganych do izolacji protoplastów z dojrzałych roślin, i przyspiesza dalsze badania wymagające nienaruszonych protoplastów.

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Protoplasty to komórki roślinne, z których ścian komórkowych usunięto enzymatycznie. Izolację protoplastów z różnych tkanek roślinnych po raz pierwszy...

Procedura ta rozpoczyna się od wysiania nasion arabidopsis na pożywkę Ms.Agar w 14. dniu. Po wykiełkowaniu nasion siewki są zbierane i krojone. Następnie materiał roślinny jest trawiony w roztworze enzymatycznym rozkładającym ścianę komórkową.Otrzymaną mieszaninę przecedza się przez gazę, aby oddzielić protoplasty od pozostałego materiału roślinnego. Zebrane protoplasty poddaje się dalszemu oczyszczaniu w gradiencie gęstości sacharozy, nakładając je na roztwór W five. Protoplasty koncentrują się na granicy fazy roztworu enzymatycznego i roztworu W five.Przed rozpoczęciem eksperymentu zostają one zebrane i opłukane. Witajcie, nazywam się Jang Ja i pracuję w laboratorium Liny Wauk w Katedrze Nauk o Uprawach i Glebie na Uniwersytecie Cornell. Dzisiaj przedstawimy procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z 14-dniowych tkankowych kultur ara Arabidopsis thaliana.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania subkomórkowej lokalizacji białek, izolacji nienaruszonych organelli oraz analizy funkcjonalnej genów z wykorzystaniem dwuniciowej interferencji RNA. Zacznijmy zatem. Procedurę rozpoczynamy od przygotowania płytek z pożywką 0,5-krotną MS, uzupełnioną o 1% sacharozy i 0,

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Zegar okołodobowy reguluje około jednej trzeciej transkryptomu Arabidopsis, ale procent genów, które wracają do pomiaru czasu, pozostaje nieznany. Tutaj wizualizujemy metodę szybkiej oceny fenotypów okołodobowych w dowolnej zmutowanej linii Arabidopsis przy użyciu obrazowania luminescencyjnego reportera okołodobowego przejściowo ulegającego ekspresji w protoplastach.

Szybka analiza fenotypów okołodobowych w protoplastach Arabidopsis transfekowanych zegarem luminescencyjnym

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Ponieważ mitochondria stanowią tylko niewielki procent komórki roślinnej, muszą zostać oczyszczone do szeregu badań. Mitochondria można wyizolować z różnych organów roślinnych poprzez homogenizację, a następnie wirowanie w gradiacji różnicowej i gęstości w celu uzyskania wysoce oczyszczonej frakcji mitochondrialnej.

Izolacja i pomiary oddechowe mitochondriów Arabidopsis thaliana

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Ten protokół opisuje przygotowanie nienaruszonych próbek warstwy komórek bielma w nasionach Arabidopsis thaliana. Metoda wymaga jedynie powszechnego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak igła do wstrzykiwań i precyzyjne kleszcze, i umożliwia obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek bielma w wysokiej rozdzielczości zarówno w rozwijających się, jak i dojrzałych nasionach.

Przygotowanie nienaruszonej tkanki do analizy mikroskopowej warstwy komórek bielma w rozwijających się i dojrzałych nasionach Arabidopsis

Niniejszy artykuł przedstawia metodę floral-dip w transformacji Arabidopsis thaliana za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens. Poprzez wprowadzenie do Arabidopsis promotora-reportera regulowanego cyklem komórkowym, pTSO2::β-glucuronidase (GUS), obrazujemy sposób wykrywania ekspresji reportera GUS w siewkach transgenicznych.

Transformacja Arabidopsis thaliana metodą floral-dip w celu zbadania ekspresji genu reporterowego pTSO2::β-glucuronidase

Naucz się izolacji protoplastów z 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana. Ta metoda wykorzystuje trawienie enzymatyczne i gradient gęstości sacharozy, zapewniając żywotność komórek przez co najmniej 96 godzin.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Przeglądaj więcej filmów