Name: Protokół nieradioaktywnej hybrydyzacji in situ mający zastosowanie do świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Poznaj zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ DIG dla świerka pospolitego i innych gatunków roślin. Ta metoda umożliwia szybką analizę ekspresji genów w tkankach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy bardzo wdzięczni Andersowi Bovinowi za dostarczenie muzyki do naszego filmu oraz Michaelowi Elliotowi Stocksowi za zgodę na bycie lektorem. Wsparcie zapewniły Fundacja Carla Tryggera, strategiczny program badawczy Agricultural Functional Genomics (AgriFunGen) na Szwedzkim Uniwersytecie Nauk Rolniczych, Szwedzka Rada Badawcza (VR) oraz Szwedzka Rada Badawcza ds. Środowiska, Nauk Rolniczych i Planowania Przestrzennego (FORMAS).

<ol><li>Carr, S. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+homeotic+gene+expression+defines+developmental+arrest+stages+in+Brassica+oleracea+L.+vars.+botrytis+and+italica%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Floral homeotic gene expression defines developmental arrest stages in Brassica oleracea L. vars. botrytis and italica.</a> Planta. 201 (2), 179-188 (1997).</li>
<li>Coen, E. S., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+war+of+the+whorls%3A+genetic+interactions+controlling+flower+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development.</a> Nature. 353 (6339), 31-37 (1991).</li>
<li>Jackson, D. In situ hybridization in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJackson%2C+D+%22Molecular+Plant+Patology%3A+a+practical+approach%22">Molecular Plant Patology: a practical approach</a>. Gurr, S. J., McPherson, M. J., Bowles, D. J. , University Press. Oxford. (1991).</li>
<li>Leitch, A. R., Schwarzacher, T., Jackson, D., Leitch, I. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeitch%2C+AR+%22In+situ+hybridization%3A+a+practical+guide%22">In situ hybridization: a practical guide</a>. , BIOS Scientific Publishers Limited. Oxford. (1994).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li>
<li>Azevedo, H., Lino-Neto, T., Tavares, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+high-quality+RNA+isolation+from+needles+of+adult+maritime+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">An improved method for high-quality RNA isolation from needles of adult maritime pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. , 333-338 (2003).</li>
<li>Sundstrom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MADS-box+genes+active+in+developing+pollen+cones+of+Norway+spruce+%28Picea+abies%29+are+homologous+to+the+B-class+floral+homeotic+genes+in+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genet%22%5BJournal%5D)">MADS-box genes active in developing pollen cones of Norway spruce (Picea abies) are homologous to the B-class floral homeotic genes in angiosperms.</a> Dev Genet. 25 (3), 253-266 (1999).</li>
<li>Tandre, K., Svenson, M., Svensson, M. E., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+gene+structure+and+activity+in+the+regulation+of+reproductive+organ+development+of+conifers+and+angiosperms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Conservation of gene structure and activity in the regulation of reproductive organ development of conifers and angiosperms.</a> Plant J. 15 (5), 615-623 (1998).</li>
<li>Winter, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MADS-box+genes+reveal+that+gnetophytes+are+more+closely+related+to+conifers+than+to+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MADS-box genes reveal that gnetophytes are more closely related to conifers than to flowering plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (13), 7342-7347 (1999).</li>
<li>Savard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+and+nuclear+gene+sequences+indicate+late+Pennsylvanian+time+for+the+last+common+ancestor+of+extant+seed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chloroplast and nuclear gene sequences indicate late Pennsylvanian time for the last common ancestor of extant seed plants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (11), 5163-5167 (1994).</li>
<li>Jack, T., Brockman, L. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeotic+gene+APETALA3+of+Arabidopsis+thaliana+encodes+a+MADS+box+and+is+expressed+in+petals+and+stamens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeotic gene APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens.</a> Cell. 68 (4), 683-697 (1992).</li>
<li>Bowman, J. L., Smyth, D. R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directing+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Genes directing flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 1 (1), 37-52 (1989).</li>
<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399 (6732), 144-148 (1999).</li>
<li>Sundstrom, J., Engstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conifer+reproductive+development+involves+B-type+MADS-box+genes+with+distinct+and+different+activities+in+male+organ+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Conifer reproductive development involves B-type MADS-box genes with distinct and different activities in male organ primordia.</a> Plant J. 31 (2), 161-169 (2002).</li>
<li>Carlsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+altered+expression+of+a+large+number+of+nuclear+genes+in+developing+cytoplasmic+male+sterile+Brassica+napus+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals altered expression of a large number of nuclear genes in developing cytoplasmic male sterile Brassica napus flowers.</a> Plant J. 49 (3), 452-462 (2007).</li>
<li>Teixeira, R. T., Farbos, I., Glimelius, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+levels+of+meristem+identity+and+homeotic+genes+are+modified+by+nuclear-mitochondrial+interactions+in+alloplasmic+male-sterile+lines+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression levels of meristem identity and homeotic genes are modified by nuclear-mitochondrial interactions in alloplasmic male-sterile lines of Brassica napus.</a> Plant J. 42 (5), 731-742 (2005).</li>
<li>Ying, S., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The technique of in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Medicine. 56, 263-283 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

W porównaniu z protokołem dla A. thaliana/B. napus zoptymalizowano dwa aspekty protokołu dla P. abies: traktowanie RNazą oraz stężenie proteinazy K. RNaza usuwa sygnały tła, zwiększając tym samym specyficzność sygnału 17. Traktowanie proteinazą K jest konieczne do permeabilizacji tkanek, aby sonda mogła wniknąć i zhybrydyzować z docelową pulą RNA. Sonda antysensowna DAL13 dawała silniejszy sygnał bez traktowania RNazą (Ryc. 3C, E, G) w porównaniu do sekcji traktowanych RNazą przez 30 min (Ryc. 2D, F i H). Ponieważ traktowanie RNazą nie poprawiło sygnału, zostało ono usunięte z protokołu. Traktowanie proteinazą K testowano przy trzech różnych stężeniach: 1, 3 i 5 µg/ml. W przypadku P. abies przy zastosowaniu 1 µg/ml proteinazy K zaobserwowano słaby lub brak sygnału (Ryc. 3C-D). Silny sygnał uzyskano zarówno przy 3 µg/ml (Ryc. 3E-F), jak i 5 µg/ml (Ryc. 3G-H) proteinazy K. Ponieważ nie stwierdzono wyraźnej różnicy w sile sygnału przy użyciu 5 µg/ml proteinazy K w porównaniu do 3 µg/ml, w naszym protokole zdecydowaliśmy się na użycie 3 µg/ml. Prawdopodobnie potrzeba wyższego stężenia proteinazy K w męskich szyszkach P. abies w porównaniu do pąków kwiatowych A. thaliana i B. napus wynika z bardziej zwartej struktury tkanki o wyższej zawartości związków fenolowych i polisacharydów.
Podczas utrwalania i zatapiania widoczne są pewne różnice między protokołem dla A. thaliana/B. napus a protokołem dla P. abies. Badaną tkankę utrwala się w celu zapewnienia retencji RNA; jest to krok krytyczny, ponieważ słabo utrwalone materiały mogą dawać niski lub niewykrywalny sygnał, mimo wysokiej obfitości mRNA. Tkankę odwadża się, klaruje i zatapia w wosku w stopniowych etapach, aby uniknąć uszkodzeń tkanki, a w niektórych protokołach do etanolu stosowanego podczas odwadniania dodaje się 0,85% NaCl, aby dodatkowo zapobiec kurczeniu się i pęcznieniu komórek 3. Etap odwadniania podczas zatapiania można przeprowadzać w lodzie, aby zminimalizować aktywność RNaz. W protokole dla P. abies roztwór utrwalający zawierający 4% paraformaldehydu zawiera również 0,25% glutaraldehydu, co ma zapewnić lepszą retencję RNA 17, choć niektórzy twierdzą, że prawdopodobnie nie ma to znaczenia 3. Po wykonaniu skrawków materiał jest mocowany na szkiełkach i poddawany obróbce wstępnej (tj. odparafinowaniu, rehydratacji, permeabilizacji, traktowaniu w celu zmniejszenia nieswoistego wiązania sondy i na koniec odwadnianiu) przed hybrydyzacją.
W prezentowanym protokole całą procedurę detekcji można przeprowadzić w zwykłych laboratoriach, sygnał rozwija się zazwyczaj w ciągu 1-3 dni, a stosunek sygnału do tła można stale monitorować. Sondy znakowane DIG zazwyczaj dają wyraźniejszy sygnał w porównaniu z sondami znakowanymi radioaktywnie, są bardziej stabilne i mogą być ponownie wykorzystywane w kolejnych eksperymentach. Z drugiej strony, ich czułość jest mniejsza w porównaniu z sondami radioaktywnymi 17. Hybrydyzacja in situ wykrywa ekspresję przy użyciu znakowanej sondy specyficznej dla danego mRNA. Znakowanie radioaktywne jest solidną i czułą metodą znakowania, ale wymaga pracy z materiałami promieniotwórczymi i trwa kilka tygodni, zanim wyniki zostaną wykryte. Sondi znakowane antygenowo są natomiast bardziej stabilne, mniej niebezpieczne i wymagają ekspozycji na medium detekcyjne zaledwie przez kilka dni 17. W związku z tym obecnie dominują metody znakowania antygenowego. Najbardziej krytycznym krokiem, niezależnie od protokołu, jest projektowanie sondy. Należy zadbać o to, aby sonda charakteryzowała się wysoką specyficznością i była znakowana wysokiej jakości UTP. Czasami temperatura hybrydyzacji i/lub czas trwania reakcji muszą zostać dostosowane do konkretnych sond.
Nasz zmodyfikowany protokół oparty na sondach znakowanych DIG ułatwi jednoczesną lokalizację ekspresji mRNA w gatunkach od A. thaliana do P. abies i po niewielkich korektach powinien być możliwy do zastosowania w innych gatunkach roślin. Protokół, poza szyszkami męskimi, został również przetestowany z dobrymi wynikami na różnych stadiach pędów wegetatywnych oraz w embrionach zygotycznych i somatycznych P. abies (wyniki niepublikowane; Karlgren et al.).

<table><tbody><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6404-200ml</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>Akrylamid, liniowy</td><td>Ambion</td><td>9520</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała anty-DIG</td><td>Grupa Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odczyn blokujący</td><td>Grupa Roche</td><td>11 175 041 910 lub 11 096 176 001</td><td></td></tr><tr><td>Seryjna albumina bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50g</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór Denhardta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532-5ml</td><td></td></tr><tr><td>DEPC, węglan dwuetylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania RNA digoksygeniną (SP6/T7)</td><td>Grupa Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (25%)</td><td>Histolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Ambion</td><td>9510G</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear II</td><td>Histolab</td><td></td><td>Podczas zatapiania tkanki można użyć Tissue-clear, Histoclear II, ksylenu lub innego podobnego preparatu.</td></tr><tr><td>Histowax</td><td>Histolab</td><td></td><td>Do zatapiania można użyć preparatów Histowax lub Paraplast.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1kg</td><td>Do zatopienia próbek można użyć Histowax lub Paraplast.</td></tr><tr><td>Phusion&amp;#8482; Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>Finnzymes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laminki Probe-on Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230-900</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5mg</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Przejrzystość tkanek</td><td>Sakura Finetek</td><td></td><td>Podczas zatapiania tkanek można stosować Tissue-clear, Histoclear II, ksylen lub podobny preparat.</td></tr><tr><td>Trietanoloamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1377-100ml</td><td>minimum 98%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>użyj standardowego produktu w laboratorium</td><td></td><td>Należy użyć Tritonu X-100, Tween-20 lub obu tych substancji.</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83853-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>użyj swojego standardowego produktu w laboratorium</td><td></td><td>Należy użyć Tritonu X-100 i/lub Tween-20.</td></tr><tr><td>Western Blue</td><td>Promega Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowalny dla świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin

Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species

Dostępne obecnie technologie wysokoprzepustowej analizy ekspresji dostarczają naukowcom ogromnej ilości profili ekspresji, jednak ich rozdzielczość w zakresie ekspresji specyficznej dla tkanek jest ograniczona ze względu na problemy z preparatyką poszczególnych tkanek. Dane o ekspresji muszą być potwierdzone i uzupełnione o wzorce ekspresji przy użyciu np. hybrydyzacji in situ, techniki stosowanej do lokalizacji specyficznej dla komórek ekspresji mRNA. Metoda hybrydyzacji in situ jest żmudna, czasochłonna i często wymaga rozległej optymalizacji w zależności od gatunku i tkanki. Eksperymenty in situ są stosunkowo trudniejsze do przeprowadzenia u gatunków drzewiastych, takich jak iglasty świerk pospolity (Picea abies). Przedstawiamy tutaj zmodyfikowany protokół hybrydyzacji DIG in situ, który jest szybki i możliwy do zastosowania u szerokiego zakresu gatunków roślin, w tym P. abies. Dzięki zaledwie kilku korektom, w tym zmienionej obróbce RNazą i stężeniu proteinazy K, mogliśmy zastosować ten protokół do badania ekspresji specyficznej dla tkanek homologicznych genów w męskich organach rozrodczych jednego gatunku gymnospermy i dwóch gatunków angiosperm: P. abies, Arabidopsis thaliana oraz Brassica napus. Protokół działał równie skutecznie dla wszystkich badanych gatunków i genów. AtAP3 oraz BnAP3 zaobserwowano w organach kwiatowych drugiego i trzeciego kręgu u A. thaliana i B. napus, a DAL13 w mikrosporofylach męskich szyszek P. abies. W przypadku P. abies stężenie proteinazy K, stosowanej do permeabilizacji tkanek, musiało zostać zwiększone do 3 g/ml zamiast 1 g/ml, prawdopodobnie ze względu na bardziej zwarte tkanki oraz wyższe poziomy związków fenolowych i polisacharydów. Dla wszystkich gatunków zrezygnowano z obróbki RNazą z powodu zmniejszenia natężenia sygnału bez odpowiadniego wzrostu specyficzności. Porównując wzorce ekspresji specyficznej dla tkanek homologicznych genów zarówno roślin kwiatowych, jak i drzewa iglastego, wykazujemy, że przedstawiony tutaj protokół DIG in situ, przy jedynie niewielkich korektach, może być stosowany u szerokiego zakresu gatunków roślin. Tym samym protokół pozwala uniknąć zarówno rozległej optymalizacji specyficznej dla gatunku, jak i żmudnego wykorzystania sond znakowanych radioaktywnie na rzecz sond znakowanych DIG. W naszym filmie zdecydowaliśmy się zilustrować technicznie wymagające kroki protokołu.
Anna Karlgren i Jenny Carlsson wniosły równy wkład w to badanie.
Autorzy korespondenccyjni: Anna Karlgren pod adresem Anna.Karlgren@ebc.uu.se oraz Jens F. Sundström pod adresem Jens.Sundstrom@vbsg.slu.se

Opisujemy zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ z użyciem DIG, który jest szybki i możliwy do zastosowania u szerokiego zakresu gatunków roślin, w tym u świerka pospolitego. Dzięki kilku korektom, obejmującym m.in. zmienioną obróbkę RNazą oraz stężenie proteinazy K, protokół ten może być wykorzystywany w badaniach różnych tkanek i gatunków.

Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowalny dla świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin

Dostępne obecnie technologie wysokoprzepustowej analizy ekspresji dostarczają naukowcom nadmiaru profili ekspresji, jednak ich rozdzielczość w zakresie...

Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowany dla świerku pospolitego oraz szeregu gatunków roślin. Carre Etal. Dzień dobry, nazywam się AM GaN i pracujemy na Uniwersytecie OBS oraz Szwedzkim Uniwersytecie Nauk Rolniczych w obs Szwecja.Opracowaliśmy protokół wizytacji owadów wewnątrz kwiatów (inset visitation), który można zastosować u kilku różnych gatunków roślin. Dzisiaj zaprezentujemy niektóre z bardziej wymagających etapów. W ramach tego protokołu pokażemy proces zatapiania w medium, wykonywanie przekrojów oraz poszczególne kroki właściwego eksperymentu dotyczącego wizytacji.Przejdźmy do laboratorium nr 1, do kroków od dziewiątego do jedenastego protokołu utrwalania i zatapiania. Krok dziewiąty: podgrzej wcześniej szalki Petriego oraz formy do 60 °C. Krok dziesiąty: rozgrzej pęsetę i równomiernie rozmieść tkanki w szalce.Dodać więcej wosku histologicznego, aby tkanki zostały całkowicie przykryte. W kroku 11 pozwolić woskowi stężeć w temperaturze pokojowej. Wykonać kroki od 12 do 19 protokołu.Włącz płyty grzewcze i przygotuj roztopioną parafinę histologiczną. Wyjmij próbki z chłodni. W kroku 13 za pomocą skalpela ostrożnie wytnij blok tkanki w parafinie.Uformuj fragment, aby ułatwić krojenie. W kroku 14 podgrzej blok chłodny oraz piętę i złącz je ze sobą. Pozostaw preparat do stwardnienia w temperaturze 4°C.Krok 15: blok woskowy należy pociąć na skrawki o grubości od sześciu do ośmiu mikrometrów. Przy użyciu mikrotomu skrawki są łączone w jedną długą wstęgę. Odetnij wstęgę i przenieś ją na papier.Na tym etapie można obejrzeć poszczególne skrawki pod mikroskopem stereoskopowym w celu wybrania interesujących sekcji. Inspekcję taką łatwiej przeprowadzić w przypadku tkanek lub preparatów barwionych eozyną. W kroku 17 nanieś wodę Milli Q wolną od RNA na slajdy.Potnij taśmę na mniejsze fragmenty i umieść je na szkiełkach przedmiotowych. Przenieś szkiełka na płytkę grzejną. Krok 17: pozwól taśmom rozprostować się na płytce o temperaturze 42°C przez jedną do dwóch minut.Odessać wodę za pomocą chłonnego papieru. Krok 19: inkubować preparaty w temperaturze 42 °C przez noc, aby tkanki przywarły do szkiełek w procedurze hybrydyzacji in situ 4.1 sekcje in situ. Kroki wstępnego przygotowania od 36 do 48 w protokole.Krok 36: odparowanie sekcji w warstwie histologicznej. Preparaty są rozmieszczone w równych odstępach i umieszczone w statywie, aby ułatwić przenoszenie między różnymi pojemnikami; odwadnianie sekcji. W serii etanolu dodać bezwodnik octowy, mieszając energicznie.Krok 45, przygotowanie do obróbki bezwodnikiem octowym 4.2 hybrydyzacja in situ. Kroki od 49 do 52 w protokole. Krok 51, starzenie preparatów ProOne Plus.Roztwór jest lepki. Należy starać się unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Inkubować preparaty w komorze wilgotnościowej.4.3 init. Po hybrydyzacji, kroki od 53 do 72 protokołu. Krok 62, inkubacja szkiełek z blokiem buforowym w plastikowym pojemniku.Krok 63, dodać wystarczającą ilość roztworu blokującego, aby pokryć preparaty. Przeciwciała nanosi się na preparaty, wykorzystując zjawisko starzenia. Starzenie działa wyłącznie w przypadku szkiełek prob bon plus. W przypadku szkiełek o podobnej konstrukcji, w Kroku 65, pozwolić siłom kapilarnym wciągnąć roztwór przeciwciał anty-dig.Krok ten jest powtarzany. W kroku 70, podobnie jak poprzednio, należy zastosować technikę „sandwich” i pobrać roztwór Western blue. Zauważmy, że roztwór Western blue jest pobierany dwukrotnie, dokładnie tak, jak zrobiliśmy to w przypadku roztworu przeciwciał anty-dig.W kroku 65 i kroku 71 inkubuj preparaty w ciemności od jednego do pięciu dni. W temperaturze pokojowej monitorowanie sygnałów hybrydyzacji można przeprowadzić za pomocą stereomikroskopu. Gdy preparaty wciąż znajdują się w kanapce, powinny być widoczne barwy od purpurowej do brązowej.Tak wyglądają wyniki rzeczywistego eksperymentu w stacji CW. Sygnał jest tutaj widoczny jako fioletowe lub brązowawe zabarwienie.

non-radioactive-situ-hybridization-protocol-applicable-for-norway

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nieradioaktywny protokół hybrydyzacji in situ zastosowany do świerka pospolitego i szerokiego zakresu gatunków roślin

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Niniejszy protokół jest z powodzeniem stosowany do ilościowego wykrywania poziomów i wzorców przestrzennych ekspresji mRNA w wielu typach tkanek u różnych gatunków kręgowców. Metoda ta umożliwia wykrywanie transkryptów o niskiej zawartości oraz jednoczesne przetwarzanie setek preparatów. Przedstawiamy ten protokół na przykładzie profilowania ekspresji podczas formowania się embrionalnego mózgu ptaków.

Radioaktywna hybrydyzacja in situ w celu wykrywania różnorodnych wzorców ekspresji genów w tkance

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku.  Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Ten protokół opisuje prostą metodę cięcia tkanek metodą Hybrid-Cut, która jest przydatna dla opornych tkanek roślinnych. Dobrej jakości skrawki tkanek umożliwiają badania anatomiczne i inne badania biologiczne, w tym hybrydyzację in situ (ISH).

Hybrid-Cut: ulepszona metoda cięcia opornych próbek tkanek roślinnych

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Poznaj zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ DIG dla świerka pospolitego i innych gatunków roślin. Ta metoda umożliwia szybką analizę ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowalny dla świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin

Przeglądaj więcej filmów