Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowalny dla świerka pospolitego i szeregu gatunków roślin
17 kwietnia 2009
Opisujemy zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ z użyciem DIG, który jest szybki i możliwy do zastosowania u szerokiego zakresu gatunków roślin, w tym u świerka pospolitego. Dzięki kilku korektom, obejmującym m.in. zmienioną obróbkę RNazą oraz stężenie proteinazy K, protokół ten może być wykorzystywany w badaniach różnych tkanek i gatunków.
Protokół niepromiennej hybrydyzacji in situ stosowany dla świerku pospolitego oraz szeregu gatunków roślin. Carre Etal. Dzień dobry, nazywam się AM GaN i pracujemy na Uniwersytecie OBS oraz Szwedzkim Uniwersytecie Nauk Rolniczych w obs Szwecja.
Opracowaliśmy protokół wizytacji owadów wewnątrz kwiatów (inset visitation), który można zastosować u kilku różnych gatunków roślin. Dzisiaj zaprezentujemy niektóre z bardziej wymagających etapów. W ramach tego protokołu pokażemy proces zatapiania w medium, wykonywanie przekrojów oraz poszczególne kroki właściwego eksperymentu dotyczącego wizytacji.
Przejdźmy do laboratorium nr 1, do kroków od dziewiątego do jedenastego protokołu utrwalania i zatapiania. Krok dziewiąty: podgrzej wcześniej szalki Petriego oraz formy do 60 °C. Krok dziesiąty: rozgrzej pęsetę i równomiernie rozmieść tkanki w szalce.
Dodać więcej wosku histologicznego, aby tkanki zostały całkowicie przykryte. W kroku 11 pozwolić woskowi stężeć w temperaturze pokojowej. Wykonać kroki od 12 do 19 protokołu.
Włącz płyty grzewcze i przygotuj roztopioną parafinę histologiczną. Wyjmij próbki z chłodni. W kroku 13 za pomocą skalpela ostrożnie wytnij blok tkanki w parafinie.
Uformuj fragment, aby ułatwić krojenie. W kroku 14 podgrzej blok chłodny oraz piętę i złącz je ze sobą. Pozostaw preparat do stwardnienia w temperaturze 4°C.
Krok 15: blok woskowy należy pociąć na skrawki o grubości od sześciu do ośmiu mikrometrów. Przy użyciu mikrotomu skrawki są łączone w jedną długą wstęgę. Odetnij wstęgę i przenieś ją na papier.
Na tym etapie można obejrzeć poszczególne skrawki pod mikroskopem stereoskopowym w celu wybrania interesujących sekcji. Inspekcję taką łatwiej przeprowadzić w przypadku tkanek lub preparatów barwionych eozyną. W kroku 17 nanieś wodę Milli Q wolną od RNA na slajdy.
Potnij taśmę na mniejsze fragmenty i umieść je na szkiełkach przedmiotowych. Przenieś szkiełka na płytkę grzejną. Krok 17: pozwól taśmom rozprostować się na płytce o temperaturze 42°C przez jedną do dwóch minut.
Odessać wodę za pomocą chłonnego papieru. Krok 19: inkubować preparaty w temperaturze 42 °C przez noc, aby tkanki przywarły do szkiełek w procedurze hybrydyzacji in situ 4.1 sekcje in situ. Kroki wstępnego przygotowania od 36 do 48 w protokole.
Krok 36: odparowanie sekcji w warstwie histologicznej. Preparaty są rozmieszczone w równych odstępach i umieszczone w statywie, aby ułatwić przenoszenie między różnymi pojemnikami; odwadnianie sekcji. W serii etanolu dodać bezwodnik octowy, mieszając energicznie.
Krok 45, przygotowanie do obróbki bezwodnikiem octowym 4.2 hybrydyzacja in situ. Kroki od 49 do 52 w protokole. Krok 51, starzenie preparatów ProOne Plus.
Roztwór jest lepki. Należy starać się unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Inkubować preparaty w komorze wilgotnościowej.
4.3 init. Po hybrydyzacji, kroki od 53 do 72 protokołu. Krok 62, inkubacja szkiełek z blokiem buforowym w plastikowym pojemniku.
Krok 63, dodać wystarczającą ilość roztworu blokującego, aby pokryć preparaty. Przeciwciała nanosi się na preparaty, wykorzystując zjawisko starzenia. Starzenie działa wyłącznie w przypadku szkiełek prob bon plus. W przypadku szkiełek o podobnej konstrukcji, w Kroku 65, pozwolić siłom kapilarnym wciągnąć roztwór przeciwciał anty-dig.
Krok ten jest powtarzany. W kroku 70, podobnie jak poprzednio, należy zastosować technikę „sandwich” i pobrać roztwór Western blue. Zauważmy, że roztwór Western blue jest pobierany dwukrotnie, dokładnie tak, jak zrobiliśmy to w przypadku roztworu przeciwciał anty-dig.
W kroku 65 i kroku 71 inkubuj preparaty w ciemności od jednego do pięciu dni. W temperaturze pokojowej monitorowanie sygnałów hybrydyzacji można przeprowadzić za pomocą stereomikroskopu. Gdy preparaty wciąż znajdują się w kanapce, powinny być widoczne barwy od purpurowej do brązowej.
Tak wyglądają wyniki rzeczywistego eksperymentu w stacji CW. Sygnał jest tutaj widoczny jako fioletowe lub brązowawe zabarwienie.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ z użyciem DIG, który jest wydajny i możliwy do adaptacji dla różnych gatunków roślin, w tym świerka pospolitego. Protokół zawiera specyficzne modyfikacje, takie jak zmiany w traktowaniu RNazą oraz stężenia proteinazy K, w celu zwiększenia jego zastosowalności w różnych tkankach i gatunkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Biologia molekularna
- Techniki hybrydyzacji in situ
Wstęp
- Hybrydyzacja in situ jest cenną techniką badania ekspresji genów w tkankach.
- Tradycyjne metody mogą być czasochłonne i specyficzne dla danego gatunku.
- Modyfikacje istniejących protokołów mogą poprawić ich wydajność i wszechstronność.
- Niniejsze badanie koncentruje się na protokole odpowiednim dla szeregu gatunków roślin.
Cel badania
- Opracowanie szybszego i bardziej elastycznego protokołu hybrydyzacji in situ.
- Wykazanie możliwości zastosowania protokołu u świerka pospolitego oraz innych gatunków roślin.
- Przedstawienie szczegółowych kroków procedury dla badaczy.
Zastosowane metody
- Zatapianie i krojenie tkanek roślinnych.
- Etapy wstępnej obróbki i hybrydyzacji do analizy in situ.
- Zastosowanie specyficznych odczynników i warunków w celu optymalizacji wyników.
- Monitorowanie sygnałów hybrydyzacji pod mikroskopem.
Główne wyniki
- Zmodyfikowany protokół skutecznie umożliwia hybrydyzację in situ u wielu gatunków roślin.
- Korekty w traktowaniu RNazą oraz stężenia proteinazy K poprawiają kompatybilność z tkankami.
- Osiągnięto wyraźną wizualizację sygnałów hybrydyzacji.
- Protokół jest wydajny i powtarzalny w różnych zastosowaniach.
Wnioski
- Zmodyfikowany protokół hybrydyzacji in situ z użyciem DIG jest cennym narzędziem w badaniach nad roślinami.
- Umożliwia on szybką i skuteczną analizę ekspresji genów w różnych tkankach roślinnych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w celu szerszego zastosowania w biologii roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wysokorozdzielczą analizę przestrzenną ekspresji genów w systemach roślinnych, wspierając walidację celów we wczesnej fazie odkryć poprzez potwierdzenie tkankowo specyficznych wzorów ekspresji. Ogranicza on zależność od radioizotopów oraz rozbudowanej optymalizacji gatunkowej, co poprawia powtarzalność i skalowalność w porównawczych badaniach międzygatunkowych. Metoda ta dostarcza wartości w zakresie redukcji ryzyka mechanistycznego dla przesiewania fenotypowego oraz odkrywania translacyjnych biomarkerów w rurociągach biofarmaceutycznych opartych na roślinach.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Potwierdza tkankowo-specyficzną lokalizację mRNA w celu zbadania hipotez terapeutycznych i wyjaśnienia funkcji genów w szlakach rozwoju rozrodczego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią wizualizację ekspresji genów w organach rozrodczych samców w modelach gymnosperm i angiosperm.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez wykazanie konserwatywnych wzorców ekspresji homologicznych genów (np. homologów AP3) w strukturach kwiatowych Arabidopsis, Brassica oraz świerka pospolitego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zestandaryzowane skrawki tkanek do dalszych analiz hybrydyzacyjnych z jednolitym wykrywaniem sygnału przy użyciu sond znakowanych DIG.
- Powtarzalność: Eliminuje traktowanie RNazą i dostosowuje stężenie proteinazy K w celu zwiększenia siły sygnału oraz zmniejszenia zmienności między gatunkami.
- Skalowalność: Ułatwia wysokoprzepustowe zastosowanie u różnych gatunków roślin przy minimalnych modyfikacjach protokołu, co umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w genomice porównawczej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykazuje możliwość zastosowania wyników od modelowych roślin okrytonasiennych po rośliny nagonasienne, co wspiera ekstrapolację wniosków na wieloletnie systemy zdrewniałe istotne dla produkcji biomasy i biopolimerów.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Zmniejsza niejednoznaczność w przypisywaniu funkcji genów poprzez powiązanie homologii sekwencji z ekspresją przestrzenną w konserwatywnych strukturach rozwojowych.
- Korelacja z biomarkerami: Umożliwia przestrzenną korelację ekspresji genów z cechami fenotypowymi w tkankach rozrodczych, co wspiera odkrywanie biomarkerów w molekularnym rolnictwie roślinnym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w fazę biologii odkrywczej, umożliwiając identyfikację celu opartą na hipotezie przed etapem przesiewania związków wiodących w systemach ekspresyjnych opartych na roślinach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez walidację przestrzennej ekspresji genów kandydujących w konkretnych tkankach i etapach rozwojowych.
- Screening: Generuje ilościowe odczyty przestrzenne, które pomagają w projektowaniu testów do monitorowania efektów związków w tkankach transgenicznych lub poddanych działaniu leków.
- Analityka: Wytwarza wykrywalne sygnały chromogenne (od fioletowego do brązowego), które nadają się do obrazowania i analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wzorce ekspresji genów z fenotypami rozwojowymi w narządach rozrodczych, wspierając decyzje dotyczące postępów w procesach walidacji cech.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany, adaptacyjny schemat analizy ekspresji genów u różnych gatunków, co ogranicza redundantne prace nad optymalizacją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez bezpośrednią, rozdzielczą przestrzennie detekcję mRNA bez zagrożeń radiacyjnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność poprzez usunięcie traktowania RNazą i standaryzację użycia proteinazy K, co zmniejsza częstotliwość niepowodzeń w protokole.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji go/no-go w wyborze celu, dostarczając jednoznacznych danych o ekspresji na wczesnym etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zachowane wzorce ekspresji u różnych gatunków, co poprawia wskaźniki sukcesu w dalszych zastosowaniach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie histologii, zatapiania tkanek i krojenia materiałów roślinnych.
- Zależne od dostępu do mikrotomów, pieców do hybrydyzacji oraz systemów detekcji chromogenicznej.
- Wymaga standaryzacji stężenia proteinazy K w zależności od gęstości tkanki i zawartości związków fenolowych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania czasu i temperatury inkubacji do różnych gatunków oraz długości sond.
- Ograniczone przez autofluorescencję tkanek i penetrację związków w próbkach silnie zdrewniałych lub bogatych w metabolity wtórne.
