Name: Mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-01-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek chromochłonnych z nadnerczy myszy. Protokół obejmuje preparację gruczołów, usunięcie kory oraz enzymatyczną trawienie tkanki rdzenia, umożliwiając badania sprzężenia pobudzenie-wydzielanie in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Skróty: ACCs – komórki chromafinne nadnerczy, E.Soln – roztwór enzymatyczny, E.DMEM – wzbogacone podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
<ol>
<li>Przygotowanie<ol>
<li>Dodać papainę do pożądanej ilości roztworu E. Soln (40 jednostek papainy / 1ml E. Soln.).</li>
<li>Aktywować papainę karbogenem przez około 15 minut w temperaturze 0°C (na lodzie).&nbsp;W temperaturze 0°C (na lodzie) należy również napowietrzyć bufor Locke'a. </li>
</ol></li>
<li>Disekcja<ol>
<li>Użyć myszy w wieku 8-10 tygodni.</li>
<li>Przed trawieniem usunąć napowietrzony bufor Locke'a i umieścić go na lodzie.</li>
<li>Procedurę disekcji przedstawiono w materiale wideo.</li>
<li>Po wycięciu umieścić gruczoły w napowietrzonym buforze Locke'a. </li>
</ol></li>
<li>Przygotowanie gruczołu<ol>
<li>Usunąć tłuszcz z gruczołu.</li>
<li>Zdjąć korę z gruczołu. </li>
</ol></li>
<li>Trawienie enzymatyczne<ol>
<li>Przefiltrować sterylnie napowietrzoną papainę.</li>
<li>Przygotować cztery porcje napowietrzonej papainy na szalce Petriego.<ol>
<li>3 porcje powinny wynosić około 100µl.</li>
<li>1 z porcji powinna wynosić około 400µl.</li>
</ol></li>
<li>Przemyć rdzenie nadzwyczajne przechodząc przez kolejne porcje<ol>
<li>Najpierw przez 3 porcje po 100µl.</li>
<li>Następnie przez porcję 400µl</li>
<li>Przenieść pipetą 300µl E.Soln wraz z fragmentami rdzenia z porcji 400µl do probówki do wirówki.</li>
<li>Owiniąć probówkę parafilmem i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 20 min.</li>
<li>Należy pamiętać o dalszym napowietrzaniu pozostałego roztworu E.Soln zawierającego papainę.</li>
<li>Po 20 minutach przefiltrować sterylnie kolejną porcję E.Soln.</li>
<li>Zastąpić stary roztwór E.Soln kąpiący rdzenie nowo przefiltrowanym roztworem E.Soln. </li>
</ol></li>
</ol></li>
<li>Trituracje<ol>
<li>Odssać i usunąć E.Soln.</li>
<li>Przemyć rdzenie nadzwyczajne w 1ml E.DMEM.</li>
<li>Odssać i usunąć E.DMEM.</li>
<li>Dodać 300µl E.DMEM i przeprowadzić triturację 20 razy przy użyciu końcówki 1ml.</li>
<li>Odciąć końcówkę 200µl sterylnym ostrzem żyletki.</li>
<li>Przeprowadzić triturację 5-10 razy przy użyciu odciętej końcówki 200µl.</li>
<li>Usunąć E.DMEM kąpiący fragmenty rdzenia.&nbsp;Pożywka będzie zawierać debris.</li>
<li>Dodać 300µl świeżego E.DMEM do fragmentów rdzenia.</li>
<li>Przeprowadzić triturację końcówką 200µl 20 razy</li>
<li>Przenieść pipetą E.DMEM do probówki do wirówki, pozostawiając fragmenty rdzenia.&nbsp;Pożywka będzie zawierać wolne ACC.</li>
<li>Dodać 300µl świeżego E.DMEM do fragmentów rdzenia.</li>
<li>Przeprowadzić triturację rdzeni igłą strzykawki o rozmiarze 23.5 gauge 20 razy.</li>
<li>Połączyć E.DMEM z obu etapów trituracji.&nbsp;Fragmenty rdzenia nie powinny być obecne i powinny mieć teraz wygląd pierzasty. </li>
</ol></li>
<li>Wysiewanie<ol>
<li>Wirować E.DMEM z dwóch ostatnich etapów trituracji przez 2,5 minuty przy 3,7g.</li>
<li>Resuspendować osad w 50µl-200µl E.DMEM, w zależności od dalszych eksperymentów.</li>
<li>Nanieść 10-30µl na szklaną lamellkę.</li>
<li>Odczekać 15 minut do czasu przytwierdzenia komórek.</li>
<li>Dodać 750µl E.DMEM. &nbsp;</li>
</ol></li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych

Mouse Adrenal Chromaffin Cell Isolation

Układy kultur komórek chromafinnych rdzenia nadnerczy są niezwykle użyteczne do badania sprzężenia pobudzenia z sekrecją w warunkach in vitro. Niniejszy protokół przedstawia metodę wypreparowania nadnerczy, a następnie izolacji obszaru rdzenia poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie zaprezentowano proces trawienia rdzenia w celu uzyskania pojedynczych komórek chromafinnych.

Systemy hodowli komórek chromafinowych rdzenia nadnerczy są niezwykle użyteczne do badania sprzężenia pobudzenia z wydzielaniem w warunkach in vitro. Niniejszy protokół przedstawia metodę wykorzystywaną do wycięcia nadnerczy, a następnie izolacji obszaru rdzenia poprzez usunięcie kory nadnerczy. Następnie zaprezentowano proces trawienia rdzenia w celu uzyskania pojedynczych komórek chromafinowych.

Mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych

Systemy hodowli komórek chromafinnych rdzenia nadnerczy są niezwykle użyteczne w badaniu sprzężenia pobudzenia z sekrecją w warunkach in vitro. To...

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje bezenzymatyczny protokół izolacji makrofagów z ganglionu korzenia grzbietowego myszy (DRG) za pomocą techniki mechanicznej dysocjacji. Po homogenizacji świeżo pobranej tkanki DRG, przeciwciała przeciwko receptorom na powierzchni komórki na makrofagach są używane do fluorescencyjnego znakowania komórek, a następnie wykonuje się cytometrię przepływową w celu potwierdzenia obecności makrofagów w próbce.

Izolacja makrofagów z ganglionu korzenia grzbietowego myszy za pomocą dysocjacji mechanicznej

Ten film demonstruje metodę płukania otrzewnowej do izolowania dojrzałych komórek tucznych typu tkanki łącznej z jamy otrzewnowej dorosłych myszy. Po wyizolowaniu mieszaniny pierwotnych komórek odpornościowych z jamy otrzewnej przeprowadza się selektywną proliferację komórek tucznych w odpowiednich warunkach hodowli.

Technika izolowania pierwotnych komórek tucznych z mysiej jamy otrzewnowej

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Po egzocytozie, zrośnięta błona plazmatyczna jest odzyskiwana w procesie znanym jako endocytoza. Mechanizm ten reformuje nowe pęcherzyki synaptyczne do następnej rundy uwalniania. Poszczególne zdarzenia endocytarne są wychwytywane i analizowane za pomocą zapisów pojemności przyłączonych do komórek w chromochłonnych komórkach nadnerczy myszy.

Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Stres osmotyczny wpływa na egzocytozę i ilość neuroprzekaźników uwalnianych podczas tego procesu. Pokazujemy, w jaki sposób połączenie metod elektrochemicznych z transmisyjną mikroskopią elektronową może być wykorzystane do badania wpływu zewnątrzkomórkowego ciśnienia osmotycznego na aktywność egzocytozy, wielkość ilościową pęcherzyków i ilość neuroprzekaźnika uwalnianego podczas egzocytozy.

Monitorowanie wpływu stresu osmotycznego na pęcherzyki wydzielnicze i egzocytozę

Tutaj prezentujemy metodę izolowania nadnerczy od myszy, naprawiania tkanek, dzielenia ich na sekcje i przeprowadzania barwienia immunofluorescencyjnego.

Izolacja, fiksacja i obrazowanie immunofluorescencyjne nadnerczy myszy

Hormon wydzielany przez korę nadnerczy jest niezbędny dla zwierząt w walce ze stresem i chorobami. Tutaj przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek nadnerczy szczura. Może to być dobra platforma in vitro do badania mechanizmów działania odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w steroidogenezie nadnerczy i biosyntezie lipidów.

Pierwotna hodowla komórek kory nadnerczy szczura i oznaczanie funkcji steroidogennych

Ten protokół opisuje technikę obrazowania konfokalnego do wykrywania trzech trybów fuzji w komórkach chromochłonnych nadnerczy bydlęcych. Te tryby fuzji obejmują: 1) fuzję bliską (zwaną również pocałunkiem i ucieczką), polegającą na otwieraniu i zamykaniu porów fuzyjnych, 2) fuzję pozostawaną, polegającą na otwieraniu porów fuzyjnych i utrzymywaniu otwartych porów, oraz 3) fuzję termokurczliwą, polegającą na kurczeniu się stopionych pęcherzyków.

Mikroskopia konfokalna do pomiaru trzech trybów dynamiki porów fuzyjnych w komórkach chromochłonnych nadnerczy

To badanie opracowało zoptymalizowany protokół izolacji mysich komórek mezangialnych (MC) i ich hodowli komórkowej ex vivo. Komórki te mogą być wielokrotnie pasażowane, zamrażane, ożywiane i hodowane bez uszczerbku dla wzrostu komórek lub ekspresji białek.

Optymalizacja izolacji i oczyszczania mysich komórek mezangialnych kłębuszków nerkowych

Opracowano trwały i możliwy do powtórzenia sposób utworzenia 2D pierwotnych kultur komórek wzbogaconych o strefę kłębuszkową i strefę prążkową kory nadnerczy u myszy. System ten zachowuje kluczowe cechy molekularne i funkcjonalne każdej strefy, umożliwiając skupioną analizę szlaków sygnałowych, produkcji hormonów oraz zachowania komórek kory nadnerczy ex vivo.

Ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy

Poznaj metodę izolacji komórek chromochłonnych z nadnerczy myszy. Protokół obejmuje preparację gruczołów, usunięcie kory oraz enzymatyczną trawienie tkanki rdzenia, umożliwiając badania sprzężenia pobudzenie-wydzielanie in vitro.

Mysz nadnerczy izolacji komórek chromochłonnych

Przeglądaj więcej filmów