Name: Otrzymywanie wysoko oczyszczonych oocyst Toxoplasma gondii za pomocą nieciągłego gradientu chlorku cezu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania oocyst Toxoplasma gondii z kału kotów przy użyciu nieciągłego gradientu chlorku cezu. Technika ta zapewnia wysoką czystość próbek niezbędną do badań molekularnych i hodowli tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Nichole Brinkman i Michaelowi Ware za recenzję techniczną manuskryptu, a dr. Abu Sayedowi i Lindzie Ransick za wsparcie techniczne i administracyjne. Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (United States Environmental Protection Agency) poprzez swój Urząd Badań i Rozwoju częściowo sfinansowała i współpracowała przy opisanych tutaj badaniach w ramach kontraktu nr EP-D-06-096 dla firmy Dynamac, Inc. oraz międzyagencyjnej umowy nr DW-12-92289801-0 dla USDA. Praca została poddana recenzji Agencji i zatwierdzona do publikacji. Wymienienie nazw handlowych lub produktów komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do ich stosowania. Aktualny adres MJS: Dynamac, Inc. Cincinnati, OH.

1. Ogólne środki ostrożności podczas pracy z oocystami T. gondii
 <ol>
 <li>Podczas pracy z oocystami T. gondii ważne jest przestrzeganie wszystkich środków ostrożności. U większości zdrowych osób infekcja T. gondii jest łatwo kontrolowana przez układ odpornościowy, jednak prowadzi do infekcji trwającej całe życie. Osoby z niedoborami odporności są szczególnie podatne na toksoplazmozę i nie powinny pracować z oocystami T. gondii. Kobiety w ciąży również nie powinny mieć kontaktu z oocystami T. gondii, ponieważ infekcja może spowodować ciężkie wady wrodzone8. </li>
 <li>Oocysty T. gondii należy obsługiwać wyłącznie w wyznaczonym obszarze i przez przeszkolony personel. Należy wywiesić oznakowania informujące o prowadzonych pracach z oocystami T. gondii, aby ostrzec inne osoby wchodzące na wyznaczony obszar. </li>
 <li>Podczas pracy z oocystami T. gondii należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE), takie jak fartuch laboratoryjny, jednorazowy fartuch ochronny, jednorazowe rękawice oraz odpowiednią ochronę oczu lub osłonę twarzy.</li>
 <li>Zaleca się częstą zmianę rękawic. Nie wolno obsługiwać żadnego sprzętu laboratoryjnego w rękawicach zanieczyszczonych oocystami T. gondii. </li>
 <li>Podczas pracy z oocystami T. gondii należy zawsze używać metalowych tacek autoklawowalnych wyłożonych jednorazowymi wkładkami chłonnymi. Należy upewnić się, że wszystkie używane statywy, probówki itp. są albo jednorazowe, albo autoklawowalne. </li>
 <li>Wszystkie odpady zawierające T. gondii muszą zostać poddane podwójnej autoklawacji przez co najmniej jedną godzinę.</li>
 <li>Wszystkie urządzenia wielorazowe (statywy, tacki itp.) muszą również zostać poddane podwójnej autoklawacji przez co najmniej jedną godzinę.</li>
 <li>Linie próżniowe używane do aspiracji płynów powinny być podłączone do filtra Vacushield™, aby zapobiec zanieczyszczeniu pompy próżniowej.</li>
 <li>Wszystkie wykorzystane blaty laboratoryjne muszą zostać zdezynfekowane po zakończeniu pracy z oocystami T. gondii. Świeżo przygotowany 10% roztwór podchlorynu należy obficie nanieść na obszar roboczy i pozostawić do wyschnięcia. Następnie obszar ten należy dokładnie wypłukać wodą.</li>
 </ol>
2. Przygotowanie buforów i roztworów
 <ol>
 <li>Przygotuj 1 L 2,2 M roztworu sacharozy, rozpuszczając 752,66 g sacharozy w 600 ml ddH2O. Mieszaj i delikatnie podgrzewaj za pomocą mieszadła magnetycznego z podgrzewaniem, aby rozpuścić sacharozę. Po całkowitym rozpuszczeniu uzupełnij objętość do 1 L za pomocą ddH2O. Następnie wysterylizuj roztwór w autoklawie przez co najmniej 20 minut.</li>
 <li>Przygotuj 1 L buforu TE (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA) o pH 7,2, dodając 6,05 g Tris-HCl i 3,7 g EDTA do 700 ml ddH2O, dostosuj pH do 7,2, a następnie uzupełnij objętość do 1 L za pomocą ddH2O.</li>
 <li>W celu przygotowania gradientu CsCl przygotuj roztwór stokowy CsCl o gęstości względnej 1,15 (1,15-CsCl), dodając 21,75 g CsCl do 103,25 ml buforu TE. Aby otrzymać roztwór A, zmieszaj 30 ml TE z 20 ml 1,15-CsCl. Aby otrzymać roztwór B, zmieszaj 20 ml TE z 30 ml 1,15-CsCl i 12,5 μl roztworu czerwieni fenolowej. Aby otrzymać roztwór C, zmieszaj 10 ml TE z 40 ml 1,15-CsCl (Tabela 1).</li>
 <li>Przygotuj 1 L 1 N roztworu wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 40 g NaOH w 800 ml ddH2O. Po rozpuszczeniu uzupełnij objętość do 1 L za pomocą ddH2O.</li>
 <li>Przygotuj 1 L 2% (obj.) roztworu H2SO4, mieszając 20 ml H2SO4 z 980 ml ddH2O.</li>
 </ol>
 3. Flotacja w sacharozie
 <ol>
 <li>Do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 10 ml zawiesiny kałowej oocyst T. gondii w 2% H2SO4. Należy zaznaczyć, że zawiesina kałowa odnosi się do próbek, które zostały wstępnie przetworzone za pomocą procedury flotacji sacharozowej, zgodnie z wcześniejszym opisem8. Po początkowym pobraniu próbek kału od zarażonych kotów są one poddawane flotacji sacharozowej opisanej w odniesieniu 8. Ta dodatkowa flotacja sacharozowa jest niezbędna, aby dodatkowo zminimalizować ilość zanieczyszczeń kałowych przenoszonych do procesu oczyszczania w CsCl i uzyskać możliwie najczystsze oocysty T. gondii.</li>
 <li>Zneutralizować 2% H2SO4, dodając do zawiesiny kałowej 6 ml (3/5 objętości) 1 N NaOH. Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.</li>
 <li>Do zawiesiny kałowej dodać równą objętość (16 ml) sacharozy 2,2 M, aby uzyskać końcowe stężenie 1,1 M, i wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.</li>
 <li>Ostrożnie nałożyć na zawiesinę sacharozy/kału 10 ml ddH2O za pomocą pipety 10 ml. Centryfugować zawiesinę przy 1 200 x g przez 20 min w temperaturze pokojowej, bez hamowania.</li>
 <li>Ostrożnie zebrać górną warstwę wody oraz warstwę miedzyfazową i przenieść do nowej stożkowej probówki wirówkowej 50 ml, pobierając ciecz z granicy powietrze-woda, nieobracając pipetą. Ważne jest, aby zminimalizować przeniesienie sacharozy podczas zbierania warstwy miedzyfazowej.</li>
 <li>Wymieszać pozostały osad sacharozy/kału, wortexując probówkę.</li>
 <li>Powtórzyć kroki 3.4 i 3.5.</li>
 <li>Dopełnić objętość dwóch roztworów miedzyfazowych z oocystami do 50 ml za pomocą ddH2O i centryfugować probówki przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Odssać nadfiltr z każdej probówki, resuspenderć osady w 5 ml buforu TE i połączyć zawiesiny oocyst. Całkowita połączona objętość powinna wynosić 10 ml.</li>
 </ol>
4. Gradient CsCl
<ol>
 <li>Przygotuj nieciągły gradient CsCl w 50 ml poliwęglanowej probówce Oak Ridge, ostrożnie nakładając każdą warstwę za pomocą strzykawki 50 ml z autoklawowalną, stalową igłą tępą o rozmiarze 18 G oraz trójdrożnym kranikiem. Uwaga: Do Roztworu B dodaje się czerwień fenolową, aby łatwo odróżnić warstwy gradientu (Tabela 1).</li>
 <li>Powoli dodaj do probówki następujące roztwory w podanej poniżej kolejności. Należy pamiętać, że szybkość przepływu nie powinna przekraczać 0,5 ml/sec.
<ol>
 <li>10 ml próbki zawiesiny TE/oocysty</li>
 <li>8 ml Roztworu A</li>
 <li>8 ml Roztworu B</li>
 <li>8 ml Roztworu C</li>
</ol>
</li>
 <li>Wiruj probówkę Oak Ridge przy 12 000 x g przez 60 min w temperaturze 4 °C bez hamowania. Dopuszczalne jest użycie rotora kątowego, jednak szybki rotor z ruchomymi gondolami zapewnia lepszą separację oocyst z próbki zawiesiny przy minimalnym powstawaniu smug z resztek fekalnych wzdłuż ścianki probówki. Zakres powstawania smug zależy od składu zawiesiny fekalnej, w związku z czym w przypadku bardzo zanieczyszczonej zawiesiny może być konieczne przeprowadzenie dwóch gradientów CsCl.</li>
 <li>Po wirowaniu zbierz nieprzezroczysty/biały prążek zawierający oocysty znajdujący się między roztworami A i B. Aby zminimalizować zanieczyszczenie resztkami fekalnymi, przejdź bezpośrednio do prążka oocyst, nie zakłócając gradientu, i zbierz interfazę oocyst za pomocą pipety 10 ml. Przenieś interfazę oocyst do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Staraj się zminimalizować ilość odessanego roztworu CsCl podczas zbierania interfazy oocyst, ponieważ może to utrudnić pelletowanie oocyst podczas etapu płukania.</li>
 <li>Przepłucz oocysty 30-40 ml ddH2O. Wiruj probówkę przy 2 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min bez hamowania. Ostrożnie odessaj nadsącz, nie naruszając pelletu oocyst. Powtórz płukanie jeszcze 2 razy.</li>
 <li>Po zakończeniu ostatniego płukania ostrożnie odessaj nadsącz i resuspenduj pellet w 10 ml 2% kwasu siarkowego, a następnie przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Oocysty są teraz gotowe do dalszych manipulacji. Czystość oocyst można sprawdzić mikroskopowo, oceniając brak resztek fekalnych w próbce.</li>
</ol>

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

uzyskiwanie wysoko oczyszczonych oocyst toxoplasma gondii za pomocą nieciągłego gradientu chlorku cezu

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondiijest obligatoryjnym wewnątrzkomórkowym pierwotniakiem chorobotwórczym, który powszechnie zakaża ludzi. Jest to dobrze scharakteryzowany przedstawiciel Apicomplexa, wiązany z wywoływaniem ognisk chorób przenoszonych przez żywność i wodę. Gospodarzem ostatecznym są kotowate, u których zachodzi replikacja płciowa, prowadząca do powstania wysoce zakaźnych i odpornych na czynniki środowiskowe oocyst. Zakażenie następuje poprzez spożycie cyst tkankowych z zanieczyszczonego mięsa lub oocyst z gleby lub wody. U zdrowych osobników zakażenie przebiega zazwyczaj bezobjawowo, ale prowadzi do lifelong latentnej infekcji, która może ulec reaktywacji, powodując zapalenie mózgu toksoplazmatyczne i śmierć w przypadku upośledzenia odporności organizmu. Mięso zanieczyszczoneT. gondiicysty były głównym źródłem zakażeń w Europie i Stanach Zjednoczonych, jednak niedawne zmiany w zarządzaniu zwierzętami i praktykach hodowlanych oraz usprawnione procedury obchodzenia się z żywnością i jej przetwarzania znacząco zmniejszyły rozpowszechnienieT. gondiiTorbiele w mięsie1, 2Niemniej jednak seroprewalencja u ludzi pozostaje stosunkowo wysoka, co sugeruje, że ekspozycja na zanieczyszczoną oocystami glebę lub wodę jest prawdopodobna. Rzeczywiście, na całym świecie zgłaszano ogniska toksoplazmozy przenoszonej drogą wodną, co potwierdza teorię, że ekspozycja na środowiskową formę oocyst stanowi istotne ryzyko dla zdrowia3-5Do chwili obecnej badania nad zrozumieniem rozpowszechnieniaT. gondiiliczba oocyst w wodzie i środowisku jest ograniczona ze względu na brak narzędzi do wykrywania oocyst w środowisku5, 6Wynika to przede wszystkim z braku wydajnych protokołów oczyszczania pozwalających na uzyskanie dużej liczby wysoko oczyszczonychT. gondiioocysty od zakażonych kotów do celów badawczych. Niniejsze badanie opisuje opracowanie zmodyfikowanej metody z użyciem CsCl, która pozwala na łatwe oczyszczenieT. gondiioocysty z kału zakażonych kotów, odpowiednie do manipulacji biologii molekularnej i kultur tkankowych7empty

Niniejsze badanie opisuje opracowanie zmodyfikowanej metody z użyciem CsCl, która umożliwia łatwe oczyszczanie oocyst T. gondii z kału zarażonych kotów, tak aby nadawały się one do manipulacji w ramach biologii molekularnej i hodowli tkankowych

Uzyskiwanie wysoko oczyszczonych oocyst Toxoplasma gondii za pomocą nieciągłego gradientu chlorku cezu

Toxoplasma gondii to bezwzględny wewnątrzkomórkowy pierwotniak chorobotwórczy, który powszechnie zakaża ludzi. Jest to dobrze scharakteryzowany przedstawiciel Apicomplexa związany z ...

Oocysty *Toxoplasma gondii* pozyskuje się zazwyczaj z odchodów zakażonych kotów i izoluje za pomocą procedury flotacyjnej, w wyniku której otrzymuje się częściowo oczyszczoną zawiesinę do badań molekularnych i hodowli tkankowych. Eksperymenty na tym pasożycie wymagają jednak wysokiego stopnia czystości oocyst. Oocysty poddaje się dalszemu oczyszczaniu za pomocą etapu flotacji w sacharozie, podczas którego oocysty są resuspenderowane, a warstwa sacharozy zostaje przykryta wodą, po czym całość poddawano wirowaniu w celu oddzielenia oocyst od większości zanieczyszczeń fekalnych.Warstwa osis jest następnie przenoszona do nowej probówki z podkładem z chlorku cezu i poddawana wirowaniu. Powstały wyraźny prążek OSIS jest następnie zbierany i płukany, aby był gotowy do użycia w eksperymentach wymagających wysokiej czystości teon io assist. Dzień dobry, jestem dr Sarah Staggs, pracownik firmy Dynam, kontrahenta Narodowego Laboratorium Badań nad Ekspozycją Agencji Ochrony Środowiska USA.Dzisiaj przedstawimy procedurę oczyszczania oocyst Toxoplasma gondii z kału zainfekowanych kotów laboratoryjnych z wykorzystaniem nieciągłego gradientu chlorku cezu. Procedura ta jest rutynowo stosowana w naszym laboratorium do izolacji oocyst, co umożliwia prowadzenie eksperymentów z zakresu biologii molekularnej oraz hodowli tkankowych. Zacznijmy zatem.Przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac z TG O Osis należy wziąć pod uwagę ważne kwestie dotyczące bezpieczeństwa. Osoby z obniżoną odpornością, kobiety w ciąży lub starające się zajść w ciążę nie powinny pracować z tym patogenem ze względu na ryzyko zarażenia toksoplazmozą, która może powodować chorobę i ciężkie wady wrodzone. Aby zmniejszyć ryzyko zakażenia, należy wydzielić specjalną przestrzeń do przeprowadzenia tej procedury i wywiesić znaki ostrzegawcze dla osób wchodzących do pomieszczenia.Pamiętaj o noszeniu fartucha laboratoryjnego, jednorazowego fartucha ochronnego, jednorazowych rękawiczek oraz odpowiednich okularów ochronnych lub osłony twarzy podczas pracy z cystami T-One IO. Należy często zmieniać rękawiczki i unikać dotykania jakiegokolwiek sprzętu w rękawiczkach, które mogą być zanieczyszczone. Ważne jest również, aby pracować na metalowych tackach autoklawowalnych wyłożonych jednorazowymi wkładami chłonnymi.W związku z tym należy poświęcić chwilę na upewnienie się, że wszystkie statywy, probówki i inne planowane do użycia akcesoria są jednorazowe lub nadają się do autoklawowania. W przypadku korzystania z przedmiotów wielorazowych należy je poddać autoklawowaniu po użyciu w dwóch cyklach jednogodzinnych. Należy również podłączyć wszystkie linie próżniowe do filtra ochronnego próżni, aby zapobiec zanieczyszczeniu pompy próżniowej.Po zakończeniu izolacji cyst należy nałożyć świeży 10% roztwór podchlorynu na powierzchnię roboczą. Pozostawić do wyschnięcia, a następnie kilkukrotnie opłukać ten obszar wodą. Po zastosowaniu odpowiednich środków ostrożności można przystąpić do eksperymentów.Przed przeprowadzeniem procesu zbierania T Guni OYS należy najpierw przygotować wszystkie niezbędne roztwory do gradientu sacharozy, frakcjonowania i chlorku cezu. Etapy wirowania. Wymagane roztwory obejmują: 2,2 M roztwór sacharozy wysterylizowany w autoklawie w cyklu 20-minutowym, jeden litr buforu TE o pH 7,2, 1 N roztwór wodorotlenku sodu, 2% roztwór kwasu siarkowego oraz roztwór zapasowy chlorku cezu o gęstości względnej 1,15.Roztwór zapasowy chlorku cezu o stężeniu 1,15 zostanie wykorzystany do przygotowania roztworów A, B i C, z których następnie zostanie sporządzony gradient chlorku cezu. Roztwór A przygotowuje się poprzez zmieszanie 30 ml TE z 20 ml roztworu zapasowego chlorku cezu 1,15. Roztwór B przygotowuje się poprzez zmieszanie 20 ml TE z 30 ml roztworu zapasowego chlorku cezu 1,15, a następnie dodanie 12,5 µL roztworu czerwieni fenolowej. Na koniec przygotowuje się roztwór C, mieszając 10 ml TE z 40 ml roztworu chlorku cezu 1,15.Przygotowanie flotacji sacharozowej rozpoczniemy od pobrania 10 mililitrów zawiesiny kałowej T osis w 2% kwasie siarkowym i przeniesienia jej do 50-mililitrowej stożkowej probówki do wirówki. Materiał kałowy pochodzi z odchodów zakażonych kotów, które zostały już poddane procedurze flotacji sacharozowej opisanej wcześniej w podręczniku autorstwa dr. JP Duby pt. Toxoplasmosis of Animals and Humans. Ten dodatkowy krok pozwala na dalszą redukcję ilości zanieczyszczeń kałowych w procesie oczyszczania chlorkiem cezu i pomaga uzyskać najwyższą czystość cyst T goi.Następnie neutralizujemy kwas siarkowy, dodając do zawiesiny kałowej objętość równą trzem piątym objętości roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 1 N. Dobrze wymieszaj zawiesinę za pomocą wibratora vortex. Następnie dodaj równą objętość sacharozy i ponownie dobrze wymieszaj zawiesinę za pomocą wibratora vortex.Używając pipety 10 ml, ostrożnie nałóż 10 ml wody dwukrotnie destylowanej na zawiesinę kałową w sacharozie. Po ostrożnym wykonaniu tej czynności umieść probówki w wirówce i wiruj je z prędkością 1200 ×g przez 20 minut w temperaturze pokojowej, bez przerwy po wirowaniu. Uważając, aby nie wzbić osadu, delikatnie pobierz pipetą z granicy faz powietrze-woda górną warstwę wody oraz warstwę graniczną.Niezwykle ważne jest, aby dążyć do zminimalizowania ilości przeniesionej warstwy sacharozy podczas pobierania warstwy interfejsu. Przenieś te warstwy do nowej 50 mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Wymieszaj zawartość probówki za pomocą wstrząsarki vortex, aby wymieszać pozostały roztwór osadu kałowego w sacharozie.Powtórz poprzednią procedurę nakładania warstwy wody w krokach wirowania jeszcze raz. Po wirowaniu pobierz górną warstwę wody oraz warstwę przejściową i przenieś je do nowej probówki. Użyj wody dwukrotnie destylowanej, aby doprowadzić objętość obu roztworów warstwy przejściowej z oocystami do 50 mililitrów.Następnie odwiruj probówki przy 2000 ×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec odessaj supernatant S z każdej probówki. Resuspenduj osady w pięciu mililitrach buforu TEA i poddaj zawiesiny osadów procesowi osmozy.Próbki są teraz gotowe do etapu gradientu chlorku cezu. Rozpoczniemy od przygotowania nieciągłego gradientu chlorku cezu w 50 mililitrowej poliwęglanowej probówce Oak ridge. Do probówki poliwęglanowej dodaj 10 mililitrów zawiesiny zawierającej TE i osis, używając 50 mililitrowej strzykawki z autoklawowalną stalową igłą o grubości 18 gauge z tępym końcem.Używając dwudrożnego kurka, powoli dodaj następujące roztwory bezpośrednio na dno probówki: 8 ml roztworu A, 8 ml roztworu B oraz 8 ml roztworu C. Upewnij się, że szybkość przepływu nie przekracza 0,5 ml/s. Należy również zauważyć, że czerwony fenol w roztworze B pomaga rozróżnić warstwy gradientu.Teraz można przystąpić do wirowania probówki Oak ridge z prędkością 12 000 ×g przez 60 minut w temperaturze 4°C bez przerwy, używając rotora wysokoprędkościowego o stałym kącie. Po zakończeniu wirowania zbieramy nieprzezroczysty biały prążek znajdujący się pomiędzy roztworami A i B. Prążek ten zawiera oocyty. Używając pipety 10 µL, należy pobrać oocyty bezpośrednio z prążka, nie zakłócając gradientu.Staraj się zminimalizować ilość odsysanego roztworu chlorku cezu podczas zbierania cyst, ponieważ nadmiar chlorku cezu może utrudnić wirowanie cyst w osad w trakcie płukania. W kolejnym kroku przenieś OSIS do nowej 50 mililitrowej stożkowej probówki do wirowania. Następnie przemyj cysty O 30 do 40 mililitrami wody dwukrotnie destylowanej, a potem wiruj probówkę z prędkością 2000 ×g w temperaturze pokojowej przez 10 minut bez przerwy, ostrożnie odsysając nadnadkład, uważając, aby nie zburzyć osadu cyst O.Powtórz płukanie jeszcze dwa razy. Po zakończeniu ostatniego płukania ostrożnie odessaj nadnadfiltr i resuspenduj osad w 10 mililitrach 2% kwasu siarkowego. Sprawdź OSIS pod mikroskopem, aby upewnić się, że z próbki usunięto wszystkie zanieczyszczenia kałowe.Ocysty są teraz gotowe do dalszych manipulacji lub można je przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia. Oto obraz nieoczyszczonych ocyst widzianych pod mikroskopem kontrastowym (DIC) przy powiększeniu 400x. Zauważmy obecność dużych ilości zanieczyszczeń fekalnych w polu widzenia, co znacznie utrudnia identyfikację ocyst.Tak wyglądają OISS przy powiększeniu 400 x po zastosowaniu protokołu oczyszczania w gradiencie chlorku cezu. Zwróć uwagę na brak zanieczyszczeń kałowych. Przedstawiliśmy właśnie sposób oczyszczania Toxoplasma gondii z kału zainfekowanych kotów laboratoryjnych przy użyciu nieciągłego gradientu chlorku cezu.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o przestrzeganiu wszystkich wytycznych dotyczących bezpieczeństwa oraz zachowanie szczególnej ostrożności podczas nakładania gradientu chlorku cezu poprzez bardzo powolne dodawanie każdej warstwy i dbanie o to, aby nie zakłócić ani nie zmieszać gradientu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

obtaining-highly-purified-toxoplasma-gondii-oocysts-discontinuous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Uzyskanie wysoce wyczyszczonych Toxoplasma gondii oocyst za pomocą nieciągłego gradientu chlorku cezu

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu zagęszczania próbek z wykorzystaniem ultrafiltracji stycznoprzepływowej z pustymi włóknami oraz dysocjacji termicznej jako alternatywnych kroków w wykrywaniu gatunków Cryptosporidium i Giardia przenoszonych przez wodę zgodnie z metodą EPA 1623.

Zmodyfikowana metoda EPA 1623 wykorzystująca ultrafiltrację przezroświećną z przepływem stycznym oraz etapy dysocjacji termicznej do wykrywania wodnych Cryptosporidium i Giardia spp.

Ten film demonstruje technikę chromatografii kationowymiennej do izolowania rekombinowanego białka z lizatu białka komórki owada.

Chromatografia kationowymienna: technika izolowania docelowego białka rekombinowanego z lizatu komórek owadów na podstawie ładunku powierzchniowego netto

W tym filmie demonstrujemy metodę in vitro do oczyszczania sporozoitów z grubościennych oocyst patogennego pasożyta Cryptosporidium parvum. Wyizolowane sporozoity mogą być wykorzystane do badań nad infekcjami.

Izolacja sporozoitu in vitro z oocyst Cryptosporidium parvum

Ten film demonstruje technikę mikroiniekcji w celu opracowania modelu infekcji organoidów jelitowych u ludzi. Zakaźne stadium sporozoitowe pasożyta Cryptosporidium parvum jest mikrowstrzykiwane do światła organoidu. Po inwazji na komórki nabłonkowe organoidu przechodzi rozmnażanie bezpłciowe i płciowe, aby zakończyć swój cykl życiowy i rozprzestrzeniać infekcję.

Technika rozwoju infekcji pasożytniczej w organoidach jelitowych za pomocą mikroiniekcji

Pomiar funkcji przeciwciał jest kluczem do zrozumienia odporności na malarię Plasmodium falciparum. Metoda ta opisuje oczyszczanie żywotnych merozoitów i pomiar fagocytozy zależnej od opsonizacji za pomocą cytometrii przepływowej.

Wysokowydajne oczyszczanie merozoitów Plasmodium falciparum do stosowania w testach przeciwciał opsonizujących

Ta metoda oddzielania trypanosomów od krwi zależy od tego, czy ich ładunek powierzchniowy jest mniej ujemny niż u komórek krwi ssaków. Zakażoną krew umieszcza się i poddaje działaniu środka ciężkości na kolumnie wymieniacza anionowego. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, dostarcza oczyszczonych pasożytów do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół przygotowania wspólnej hodowli komórek kryptokokowych i ameb, która jest badana przy użyciu nieruchomych, fluorescencyjnych obrazów i obrazów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego o wysokiej rozdzielczości. Zilustrowano tutaj, w jaki sposób dane ilościowe mogą uzupełniać takie informacje jakościowe.

Komplementarne zastosowanie technik mikroskopowych i odczytu fluorescencji w badaniu interakcji kryptokokus z amebą

Opisujemy protokoły przygotowania oocyst i oczyszczania sporozoitów do badania infekcji organoidów ludzkich jelit i dróg oddechowych przez Cryptosporidium parvum. Przedstawiono procedury mikroiniekcji pasożytów do światła organoidów jelitowych oraz barwienia immunologicznego organoidów. Na koniec opisujemy izolację wygenerowanych oocyst od organoidów.

Badanie zakażenia Cryptosporidium w 3D systemach hodowli organoidów ludzkich pochodzących z tkanek za pomocą mikroiniekcji

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Poznaj metodę oczyszczania oocyst Toxoplasma gondii z kału kotów przy użyciu nieciągłego gradientu chlorku cezu. Technika ta zapewnia wysoką czystość próbek niezbędną do badań molekularnych i hodowli tkanek.

Uzyskiwanie wysoko oczyszczonych oocyst Toxoplasma gondii za pomocą nieciągłego gradientu chlorku cezu

Przeglądaj więcej filmów