Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Witam, nazywam się Francesco Lichi. Jestem badaczem postdoc w laboratorium bioanalitycznym profesora Palkiego na Uniwersytecie Rzymu Tova Gata. Dzisiaj, wraz z moimi współpracownikami, zaprezentuję Państwu przygotowanie elektrochemicznego czujnika do detekcji mikotoksyny TCO w próbkach żywności.

Wśród różnych metod stosowanych w testach immunologicznych komórek, jedna z najpopularniejszych jest metoda enzymatycznego testu immunologicznego. Przeciwciało lub antygen jest znakowane enzymem. Niedawno wykazano, że zastosowanie metod elektrochemicznych do detekcji aktywności enzymatycznej niesie ze sobą szczególne zalety w określonych zastosowaniach.

Elektrochemia jest w rzeczywistości mniej podatna na zakłócenia, nadaje się do miniaturyzacji i do masowych analiz przy niskich kosztach. W tym kontekście zastosowanie elektrod sitodrukowych ma ogromne znaczenie dla zapewnienia niskich kosztów i prostoty procedury. Ponadto zastosowanie podłoży magnetycznych można połączyć z elektrodami sitodrukowymi w celu uzyskania najwyższej czułości metody.

Dzisiaj pokażemy, jak przygotować czujnik elektrochemiczny oparty na wykorzystaniu elektrod sitodrukowanych i nanocząsteczek magnetycznych do wykrywania mikotoksyn T2 i HT2 w próbkach żywności. Mikotoksyny trichotecenowe są powszechnie występujące w zbożach, z tego powodu stanowią poważne zagrożenie dla bezpieczeństwa żywności i pasz opartych na zbożach. Najważniejszymi toksynami z grupy A są toksyny T2 i HT2.

Jak zobaczymy, metodę tę mogą z łatwością przeprowadzić osoby bez specjalistycznego przeszkolenia, a wymagana aparatura jest tania i przenośna. Jest to jeden z głównych celów zintegrowanego projektu bio finansowanego przez wspólnotę europejską, w ramach którego przeprowadzono niniejsze prace. Przejdźmy teraz do omówienia zasady działania tej metody oraz materiałów, których będziemy używać.

Zacznijmy zatem. Jako nośnik dla immunologicznej reakcji łańcuchowej zostaną wykorzystane kulki magnetyczne. Jako element detekcyjny zostanie użyta paskowa elektroda sitodrukowa składająca się z ośmiu elektrod.

Każdy czujnik składa się z grafitowej elektrody roboczej, elektrody przeciwnej oraz srebrnej elektrody odniesienia. Czujniki te mogą być obsługiwane sekwencyjnie i indywidualnie w bardzo krótkim czasie za pomocą przenośnego urządzenia elektrochemicznego marki palmSense. Zasada metody jest prosta i opiera się na konkurencyjnej reakcji immunologicznej.

Skoniugowana toksyna zostaje unieruchomiona na kuleczkach magnetycznych, które następnie poddaje się blokowaniu, aby zapobiec niespecyficznej adsorpcji. Sam pomiar rozpoczyna się od etapu konkurencji. W tej fazie pokryte kuleczki pozostawia się do reakcji z określoną ilością przeciwciała monoklonalnego; toksyna zawarta w próbce oraz ta unieruchomiona na kuleczkach magnetycznych konkurują ze sobą o miejsca wiązania przeciwciał.

Ilość przeciwciał związanych z zakodowanymi kulkami będzie odwrotnie proporcjonalna do ilości toksyny w próbce. Po etapie konkurencji następuje etap znakowania. W tym przypadku kulki magnetyczne pozostawia się do reakcji z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z enzymem znakującym.

Przeciwciało wtórne zwiąże się z przeciwciałem monoklonalnym, zapewniając wydajne znakowanie. Po etapie znakowania następuje etap pomiaru. W tym przypadku kulki magnetyczne są koncentrowane na powierzchni elektrody za pomocą platformy magnetycznej, po czym dodajemy substrat enzymatyczny p-nitrofenylofosforan (pNPP) i mierzymy ilość powstałego p-nitrofenolu (pNP).

Wygenerowana krzywa wiązania wykaże wysokie wartości prądu przy niskich stężeniach toksyny oraz niskie sygnały przy wysokiej zawartości toksyny. Stężenie toksyny zostanie wyznaczone przy użyciu krzywej kalibracyjnej sporządzonej w standardowych roztworach buforowych. Aby przygotować właściwy test, przygotowujemy statyw z czystymi probówkami fendor o grubości dwóch mil – osobną dla każdego roztworu standardowego krzywej kalibracyjnej, a także dla próbek.

Następnie do każdej probówki pipetuje się 10 µL zawiesiny kulek. Roztwór ten zawiera kulki magnetyczne uprzednio pokryte toksyną sprzężoną. Przed przystąpieniem do analizy należy jednak usunąć płyn do przechowywania, ponieważ azotek sodu stosowany jako konserwant wpłynąłby na aktywność enzymatyczną znacznika.

W tym celu dodaje się bufor P-B-S-B-S-A. Probówki są wstrząsane, następnie ponownie wstawia się magnes i odpipetowuje bufor piorący. Pierwszy właściwy etap analizy nazywany jest etapem blokowania.

Podczas tego etapu do każdej z probówek dodaje się 1 ml roztworu blokującego. Następnie są one umieszczane w rotacyjnym mieszadle do próbek i inkubowane przez pół godziny w odpowiedniej temperaturze. Następnie usuwa się roztwór blokujący, aby przejść do kolejnego kluczowego etapu, czyli etapu konkurencji, podczas którego do każdej probówki dodaje się roztwory specyficznego przeciwciała monoklonalnego oraz toksyny.

W tym celu wstrzykuje się 200 µL przeciwciała monoklonalnego w zoptymalizowanym stężeniu. Następnie do każdej probówki dodaje się 200 µL każdego roztworu wzorcowego lub próbki. Odczynniki inkubuje się przez 30 minut.

Aby zoptymalizować kontakt między odczynnikami unieruchomionymi na powierzchni cząstek magnetycznych a cząsteczkami w roztworze w celu rozpoczęcia tego procesu, probówki ponownie umieszcza się w rotacyjnym mieszalniku do próbek, aby przejść do etapu znakowania. Konieczne jest usunięcie roztworu z poprzedniego etapu. Następnie do każdej probówki dodaje się 400 µL znakowanego przeciwciała wtórnego, a następnie przenosi się je z powrotem do rotacyjnego mieszalnika do próbek i inkubuje przez 30 minut.

Następnie, po usunięciu cieczy znakującej, przeprowadzono procedury płukania przy użyciu różnych buforów, aby uniknąć zakłóceń spowodowanych przez niezwiązane odczynniki enzymatyczne. Na koniec, w celu przygotowania do właściwych pomiarów, kuleczki magnetyczne zawieszono ponownie w 100 µL buforu DEA, który jest odpowiedni do optymalizacji aktywności enzymatycznej znacznika. Pomiar jest wykonywany za pomocą tego przenośnego potencjostatu, który widnieje jako podłączony do ośmioelektrodowego paska poniżej.

Zastosowano specjalny uchwyt, w którym osiem silnych magnesów jest przymocowanych dokładnie pod powierzchnią każdej elektrody roboczej. Magnes służy do zagęszczania kulek na powierzchni elektrody roboczej. Z każdego EOR pipetujemy 20 µL aliquoty reaktywnej dyspersji magnetycznych kulek i nanosimy ją na powierzchnię odpowiadającej jej elektrody roboczej.

Aby przeprowadzić właściwy pomiar, należy dodać substrat enzymatyczny, przy czym kolejność kroków musi być ściśle kontrolowana. Do powierzchni pierwszej elektrody dodajemy ad mikrolitrów roztworu substratu enzymatycznego. Następnie uruchamiamy dwuminutowe odliczanie.

Po 14 sekundach dodajemy roztwór substratu na drugą elektrodę. Po kolejnych 14 sekundach dodajemy roztwór substratu na trzecią elektrodę. Postępujemy w ten sam sposób, zachowując ten sam odstęp czasu, aż do ostatniej elektrody.

W rzeczywistości odstęp 14 sekund jest obliczany jako czas wymagany do przeprowadzenia pomiaru przez potencjostat. Po dwuminutowym odliczaniu od pierwszego dodania roztworu substratu enzymatycznego, uruchamiany jest protokół pomiaru elektrochemicznego. Właściwy pomiar powstałego produktu jest wykonywany przy użyciu różnicowej telemetrii potencjałowej.

Na ekranie zaczynają pojawiać się krzywe dla kolejnych elektrod, ponieważ jest to test konkurencyjny. Natężenie prądu uzyskanego sygnału będzie odwrotnie proporcjonalne do stężenia toksyny, która znajdowała się w probówce w etapie konkurencji. Sygnał prądowy roztworów wzorcowych zostanie przedstawiony w formie krzywej sigmoidalnej, a zawartość toksyny w próbkach o nieznanym stężeniu zostanie wyznaczona poprzez ekstrapolację wartości stężenia z zarejestrowanego sygnału.

Mam nadzieję, że ta prezentacja była przejrzysta i pomogła zrozumieć zalety elektrochemicznych immunosensorów. Dziękuję za uwagę i życzę powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.