Obrazowanie na żywo migracji embrionalnych hemocytów Drosophila melanogaster

Ten film przedstawia procedurę montowania zarodków muszki w celu zobrazowania hemocytów. Ich embrionalne makrofagi. Zarodki są składane przez muchy na płytkach agarowych z sokiem jabłkowym w klatce niosek przez noc.

Następnego dnia wyjmuje się płytkę rolniczą, a zarodki przemywa się z płytki rolniczej do sitka do komórek, po czym następuje dodatkowe mycie w celu usunięcia zanieczyszczeń. Sitko do komórek zawierające zarodki zanurza się w wybielaczu w celu pokrycia zarodków. Po zmyciu wybielacza zarodki przenosi się do kropli wody.

Kropla wody jest następnie odsysana, a zarodki są pokrywane olejkiem węglowym hello. Odpowiednio rozwinięte zarodki z widocznymi cytami He są przenoszone do błony Petriego między dwoma przymocowanymi szkiełkami nakrywkowymi i starannie wyrównywane w oleju. Trzecie szkiełko nakrywkowe jest następnie nakładane na zarodki i przyklejane lakierem do paznokci.

Ruchliwość hemocytów w zarodku można teraz zobrazować za pomocą najwyższego szkiełka nakrywkowego pod mikroskopem. Cześć, nazywam się Jennifer Zaed i pracuję w laboratorium Briana Strma na wydziale wynajmu w Seulu oraz na Wydziale Biofizyki Molekularnej w Kings College London. Nazywam się Ian Evans i pracuję w Laboratorium Drewna na Wydziale Biologii i Biochemii Uniwersytetu w Bath.

Dzisiaj pokażemy Wam procedurę montażu Josephs bryo do obrazu na żywo, miejsca hemo, makrofagów embrionalnych tego organizmu. Używamy tej procedury do badania dyspersji rozwojowej i odpowiedzi wiatru na te ważne komórki odpornościowe oraz maszynerię cytoszkieletu, którą wykorzystują do przeprowadzania tych procesów. Więc zacznijmy.

Rozpocznij tę procedurę od uzyskania odpowiednich linii TROs OAL zawierających specyficzne dla hemocytów gal cztery sterowniki i genetycznie kodowane reportery fluorescencyjne pod kontrolą UAS. W tym przypadku wężowa gala czwarta jest używana do napędzania ekspresji fluorescencyjnego czerwonego markera jądrowego z UAS Red Stinger. W celu omówienia zakresu zalecanych czterech kierowców GAL i konstrukcji UAS, zapoznaj się z dołączonym pisemnym protokołem umieszczania 20 muszki każdej płci w klatce niosek.

Klatka do składania wniosków składa się z 55-mililitrowej płytki rolniczej z sokiem jabłkowym umieszczonej na dnie plastikowej rurki z gazą zakrywającą drugi koniec, aby umożliwić przepływ powietrza. Alternatywnie można użyć prostego plastikowego peakera z otworami. Perforując podstawę, pozwól muchom zaaklimatyzować się w klatce niosek przez co najmniej dwa dni po aklimatyzacji much, zmień się na nowy, wstępnie ciepły ruszt na sok jabłkowy i pozwól muchom leżeć przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Informacje na temat pobierania zarodków w bardziej dyskretnym stadium można znaleźć w dołączonym pisemnym protokole. Gdy muchy będą inkubować przez odpowiednią ilość czasu do zniesienia, użyj butelki do mycia, aby nałożyć około trzech mililitrów wody na płytkę. Następnie za pomocą pędzla z miękką końcówką usuń zarodki z soku jabłkowego, a usunięte zarodki można łatwo zobaczyć gołym okiem, trzymając sitko do komórek nad zlewką.

Wlej wodę z soku jabłkowego do sitka do komórek, aby zebrać zarodki. Następnie dodaj więcej wody do soku jabłkowego. Aate. Powtarzaj proces odcedzania, aż zostanie zebrana żądana liczba zarodków.

Następnie, za pomocą butelki do mycia, umyj zarodki w sitku do komórek, używając około 10 mililitrów wody. Po umyciu zarodków umieść sitko do komórek w pokrywce soku jabłkowego Aerate. Dodaj schludny wybielacz na tyle, aby zawiesić zarodki w sitku do komórek, aby pokryć zarodki.

Przenieś sitko do komórek i pokrywkę szalki Petriego do mikroskopu preparacyjnego, aby śledzić dekorację zarodków. W świetle jasnego pola dekoracja jest zakończona, gdy rozpuszczone wyrostki grzbietowe rozpuszczą się, co powinno nastąpić w ciągu dwóch minut. Po zakończeniu dekoracji wyjmij sitko zawierające zarodki z wybielacza, ponownie trzymając sitko nad zlewką.

Użyj butelki do mycia, aby delikatnie, ale dokładnie zmyć resztki wybielacza. Nałóż niebieskie chusteczki laboratoryjne na spód sitka do komórek, aby usunąć pozostałą wodę. Jeśli niebieski kolor zmieni się na biały lub różowy resztki wybielacza, kontynuuj pranie, upewniając się, że wszystkie ślady wybielacza zostały usunięte przed przejściem do następnego kroku.

Usunięcie nadmiaru wody z sitka do komórek ułatwia zbieranie zarodków pędzlem w kolejnym kroku. Gdy cały wybielacz zostanie usunięty z zarodków, umieść kroplę wody w pokrywce szalki Petriego za pomocą cienkiego pędzla. Zebrać wszystkie powleczone zarodki z sitka i ponownie zawiesić je w kropli.

Następnie nałóż chusteczkę chemiczną na zewnętrzną stronę sitka do komórek, aby wysuszyć zarodki. Po wysuszeniu zarodków dodaj kroplę olejku węglowego halo, 700, aby pokryć wszystkie zarodki. Następnie umieść drugą małą kroplę oleju obok kropli zawierającej zarodki.

Zbadaj zarodki pod fluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj odpowiednio zaawansowane zarodki o pożądanym genotypie, aby zobrazować boczną migrację cytów. Na brzusznej linii środkowej.

Wybierz zarodki w stadium od 13 do 14. W tym przykładzie cyty są identyfikowane przez jądra fluorescencyjne i są widoczne w głowie oraz wzdłuż brzusznego rdzenia nerwowego i rozwijającego się naczynia grzbietowego, aby zobrazować ruchliwość hemos po rozproszeniu po zarodku, wybierz zarodki etapu 15. Na tym etapie hemos rozproszy się po całym zarodku.

Jednak trzy równoległe linie hemos powinny być widoczne po brzusznej stronie zarodka po migracji bocznej od linii środkowej. Po wybraniu zarodków użyj pary zakrzywionych kleszczy zegarmistrzowskich numer pięć, aby zebrać wybrane zarodki. Uważając, aby nie przebić błon fiolki.

Następnie umieść zarodki w drugiej kropli oleju na spodzie 50-milimetrowej naczynia Petri perm lumax. Umieść dwie małe krople oleju Halo Caron 700 w odległości około jednego centymetra od siebie. Nałóż szkiełko nakrywkowe na każdą kroplę w świetle jasnego pola pod mikroskopem preparacyjnym.

Ostrożnie przenieś do 15 zarodków za pomocą zakrzywionych kleszczy. Wyrównanie zarodków brzuszną stroną do góry i równolegle do krawędzi okładki. Ślizga się, gdy zarodki są wyrównane przy małej kropli oleju i pozwalają mu się rozprzestrzenić, tworząc jednorodną warstwę między dwoma szkiełkami nakrywkowymi.

Po rozprowadzeniu oleju może to potrwać kilka minut. Sprawdź, czy zarodki są nadal brzuszne. Stroną do góry, jeśli zarodki lekko się przetoczyły.

Ponownie ustaw je za pomocą kleszczy. Na koniec za pomocą pęsety numer trzy. Umieść trzeci szkiełko nakrywkowe na zarodkach.

Mostkowanie dwóch wcześniej przylegających szkiełek nakrywkowych. Przyklej ten szkiełko nakrywkowe do okładki. Wsuń podpory za pomocą lakieru do paznokci.

Zarodki są teraz gotowe do obrazowania. Ten zarodek SRP gal four UAS Red Stinger został zamontowany brzusznie do góry, a zdjęcia poklatkowe uzyskano za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego Leica M 2 0 5. Cyty He są wizualizowane przez ich czerwono oznaczone jądra.

Film rozpoczyna się w fazie od 12 do 13 rozwoju, kiedy cyty opuszczają głowę i migrują w dół brzusznej linii środkowej. Po około godzinie cyty zaczynają migrować poza linię środkową, aby rozproszyć się na pozycje boczne wzdłuż powierzchni brzusznej. Przez pozostałą część rozwoju.

Hemocyty są bardzo aktywne, migrując w całym zarodku. Musimy pokazać, jak monitorować zarodek Josepha, aby śledzić ruch lub stronę hemo na żywo in vivo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ostrożnie obchodzić się z zarodkami, zwłaszcza na szalce do trwałej ondulacji, aby uniknąć uszkodzenia, gdy zarodki są w oleju, są one stosunkowo odporne na odwodnienie, ale należy uważać, aby nie wybielać zarodków zbyt długo podczas usuwania corionu.

Wreszcie, montując kilka zarodków, dasz sobie najlepszą możliwą szansę na uzyskanie zarodka w idealnej orientacji do obrazowania na żywo. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.