Name: Spektroskopia rezonansu magnetycznego żywego Drosophila melanogaster przy użyciu Magic Angle Spinning (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-15T16:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Poznaj spektroskopię HRMAS 1H-MRS do nieinwazyjnej charakteryzacji molekularnej żywych osobników Drosophila melanogaster. Metoda umożliwia badanie metabolitów in vivo przy użyciu konwencjonalnego spektrometru 14,1 T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była częściowo finansowana z grantu National Institutes of Health (NIH) AI063433 przyznanego Laurence G. Rahme, grantu National Institute Institutes of Health (NIH) Center Grant (P50GM021700) przyznanego Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika, dyrektor rdzenia NMR) oraz grantu badawczego Shriner's Hospital for Children (#8893) przyznanego A. Aria Tzika. Dziękujemy dr. Dionyssiosowi Mintzopoulosowi za pomoc w początkowych fazach opracowywania tego protokołu oraz dr. Ovidiu C. Andronesiemu za pomoc w zakresie sekwencji impulsów TOBSY.

Część 1: Przygotowanie Drosophila do pomiarów HRMAS
<ol>
<li>Stosując standardowe procedury laboratoryjne dla muszek 1, zbieraj nowo wyklute osobniki przez 3 dni i przenieś je do probówek z新鮮ną pożywką. Inkubuj zebrane muszki przez 5 dni, aby w momencie rozpoczęcia eksperymentu miały od 5 do 8 dni. Do eksperymentów wykorzystuje się tylko jedną płeć (zazwyczaj samce).</li>
<li>Użyj zdrowych, nienaruszonych muszek typu dzikiego w celu porównania ich z osobnikami poddanymi działaniu czynników zewnętrznych, np. utraumizowanymi lub zmodyfikowanymi genetycznie 1.</li>
<li>Na 24 godziny przed eksperymentem umieść pojedyncze muszki w probówkach o pojemności 2 ml zawierających fragment (~0,2 ml) pożywki. W zakrętce probówek należy wykonać otwór za pomocą rozgrzanej nad ogniem igły insulinowej.</li>
<li>Zważ probówki bezpośrednio przed i po umieszczeniu w nich muszki za pomocą wagi precyzyjnej, a wagę każdej muszki wyznacz poprzez odjęcie pierwszej wartości od drugiej. Pojedynczy samiec waży zazwyczaj 0,7-1 mg.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie rotora HRMAS.
<ol>
<li>Umieść pojedynczą probówkę na lodzie na mniej niż minutę, aby znieczulić znajdującą się w niej muchę.</li>
<li>Połóż muchę na warstwie folii aluminiowej umieszczonej na lodzie i delikatnie wsuń ją do półkolistego wgłębienia wkładki rotora NMR za pomocą miękkiego pędzla, aby zapewnić całkowite wprowadzenie muchy, unikając jednocześnie jej zranienia.</li>
<li>Umieść wkładkę w rotorowej probówce z tlenku cyrkonu (ZrO2) (średnica 4 mm, 50 μl), aby zlokalizować muchy pomiędzy wkładką rotora a dnem rotora (patrz rycina 1).</li>
<li>Zamknij wkładkę za pomocą śruby i zabezpiecz ją parafilmem (patrz rycina 1), aby zapobiec kontaktowi muchy z roztworem wzorca TSP (TSP: kwas trimetylosililopropionowy-2,2,3,3-d4, Mw = 172, δ = 0.00 ppm, 50 mM w wodzie deuterowanej D2O, który służy jako odniesienie zarówno dla przesunięcia chemicznego rezonansu, jak i dla ilościowego oznaczenia).</li>
<li>Dodaj 8 μl roztworu wzorca TSP na górę wkładki rotora (patrz rycina 1).</li>
<li>Zabezpiecz i dokręć cały zestaw w rotorach za pomocą górnej zakrętki (patrz rycina 1).</li>
</ol>
Część 3: Pozyskiwanie danych HRMAS
<ol>
<li>Wprowadź rotor do sondy HRMAS i ustaw go pod kątem magicznym 54,7° (patrz rycina 1).</li>
<li>Ustaw temperaturę na 4°C za pomocą jednostki BTO-2000 w połączeniu z pneumatyczną jednostką MAS. Muchy są utrzymywane w temperaturze 4°C podczas przebywania w spektrometrze w celu utrzymania anestezji.</li>
<li>Ustaw szybkość wirowania dla HRMAS 1H MRS na 2 kHz MAS.</li>
<li>Stabilizuj częstotliwość rotacji MAS na poziomie 2,0 ± 0,001 kHz za pomocą kontrolera prędkości MAS (Częstotliwość rotacji).</li>
<li>W ramach przygotowania magnesu: przeprowadź strojenie i dopasowanie cewki dla uzyskania optymalnej wydajności oraz shimowanie magnesu w celu uzyskania optymalnej jakości widm.</li>
<li>Nabyj jednowymiarowe widma 1H, stosując zsynchronizowaną z rotorem sekwencję impulsów echa spinowego Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) 2, [90°-(τ-180°- τ)n-akwizycja], która działa jako filtr T2 w celu usunięcia poszerzenia widmowego z jednowymiarowych widm 1H NMR pojedynczych much w celu pozyskania danych jednowymiarowych dla wszystkich próbek. Zsynchronizuj opóźnienie międzyimpulsowe (τ = 500μs) z częstotliwością rotacji MAS (2 kHz). Ustaw liczbę uśrednień na 256 z 32 768 (32k) punktami danych. Czas akwizycji: 9 min.</li>
<li>Nabyj dwuwymiarowe (2D) widma 1H-1H HRMAS NMR pojedynczych much dla wszystkich próbek, stosując sekwencję TOBSY z impulsami adiabatycznymi 3. Parametry akwizycji to: 2k punktów danych w wymiarze bezpośrednim (szerokość widmowa 11 ppm), 1 s presaturacji wody podczas opóźnienia relaksacyjnego, 8 skanów na przyrost, 128 przyrostów, całkowity czas repetycji 2 s, czas mieszania 45 ms oraz całkowity czas akwizycji 29 min.</li>
</ol>
Część 4: Przetwarzanie i analiza danych
<ol>
<li>Przeanalizuj widma MR próbek przy użyciu oprogramowania MestReC (Mestrelab Research, www.mestrec.com)</li>
<li>Zastosuj funkcję apodyzacji poszerzającą linie o 0,5 Hz do wszystkich sygnałów FID 1H HRMAS przed przeprowadzeniem transformaty Fouriera.</li>
<li>Odnieś widma MR do TSP przy δ = 0,0 ppm (standard zewnętrzny).</li>
<li>Wykonaj manualną korekcję fazy widm i zastosuj estymator linii bazowej Whittakera, aby odjąć szerokie komponenty linii bazowej przed obliczeniem pól powierzchni pików.</li>
<li>Oszacuj pola powierzchni pików za pomocą oprogramowania MestReC. Przeskaluj wysokości pików względem TSP dla każdego pozyskanego widma (wysokość piku TSP = 1). Użyj testów t (dwustronnych, p&lt;0,05), aby porównać stosunki wewnątrzgrupowy i międzygrupowe.</li>
<li>Parametry przetwarzania 2D TOBSY to: funkcja okna QSINE = 2 w obu wymiarach, FT z 2k punktami w wymiarze bezpośrednim i dopełnienie zerami do 1k w drugim wymiarze, korekcja fazy w obu wymiarach oraz korekcja linii bazowej w drugim wymiarze.</li>
<li>Wygeneruj widma 2D przy użyciu programu Sparky (T. D. Goddard i D. G. Kneller, SPARKY 3, USCF, <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/">http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</a>)</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne widma z żywych much Drosophila melanogaster
Opisane powyżej procedury pozwalają na gromadzenie powtarzalnych widm z żywych much Drosophila melanogaster. Ryciny 2 i 3 przedstawiają reprezentatywne widma MR uzyskane od much typu dzikiego (wt) Oregon-R. Rycina 2 prezentuje widma 1D 1H HRMAS CPMG. Główne składniki lipidowe [CH3 (0.89 ppm), (CH2)n (1.33 ppm), CH2C-CO (1.58ppm), CH2C=C (2.02 ppm), CH2C=O (2.24 ppm), CH=CH (5.33 ppm)], glicerol (1,3-CH 4.10 ppm i 4.30 ppm; 2-CH2 5.24 ppm) oraz małe metabolity: β-alanina (β-Ala, 2.57 ppm), octan (Ac, 1.97 ppm), fosfocholina (PC, 3.22 ppm) i fosfoetanolamina (PE, 3.23ppm) zostały wykryte i przypisane zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami 4, 5. Sygnały przy 2.02 ppm przypisano protonom metylenowym fragmentu CH2-CH=CH jednonienasyconych kwasów tłuszczowych (np. palmitoleinowego). Kwasy nienasycone zidentyfikowano na podstawie sygnału przy 5.33 ppm generowanego przez protony fragmentu -CH=CH-. Małe metabolity, których nie udało się przypisać lub które nie były widoczne na widmie 1D, wykryto za pomocą 2D 1H-1H TOBSY HRMAS (patrz rycina 3).
<img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig1.jpg" alt="Schemat układu wysokorozdzielczego przeszywania pod kątem magicznym (HRMAS) z znieczuloną muchą w rotorze z cyrkonu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Układ doświadczalny dla in vivo HRMAS 1H MRS do badania żywych Muszka owocówka przy 14,1 T. Zewnętrzny wzorzec kwasu trimetylosililo-propionowego-2,2,3,3-d4 w wodzie deuterowanej (TSP/D2O)2O). W kwadracie: pozycja rotora pod kątem magicznym w sondzie HRMAS.
<img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig2.jpg" alt="Schemat widma NMR, analiza struktury chemicznej, oznaczone piki, skala ppm, identyfikacja cząsteczki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Widma 1D HRMAS 1H CPMG in vivo żywej muchy Drosophila melanogaster wt. Składniki lipidowe: CH3 (0.89 ppm), (CH2)n (1.33 ppm), CH2C-CO (1.58ppm), octan (Ac), CH2C=C (2.02 ppm), CH2C=O (2.24 ppm), β-alanina (β-Ala), fosfocholina (PC) i fosfoetanolamina (PE), glicerol (1,3-CH 4.10, 4.30 ppm; 2-CH2 5.22 ppm), CH=CH (5.33 ppm).
<img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig3.jpg" alt="Spektroskopia NMR 2D, wykres korelacji przesunięcia chemicznego metabolitów z wykorzystaniem analizy NMR protonowego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Widmo In vivo 2D 1H-1H TOBSY HRMAS żywej muchy Drosophila melanogaster wt przy 14,1 T. Zidentyfikowano małe metabolity i komponenty lipidowe. Metabolity: alanina (Ala), β-alanina (β-Ala), arginina (Arg), glutamina (Gln), glutaminian (Glu), fosfocholina (PC), fosfoetanolamina (PE), tauryna (Tau), α-glukoza (α-Glc) i glicerol. Komponenty lipidowe: CH3 (0,89 ppm), (CH2)n (1,33 ppm), CH2C-CO (1,58 ppm), CH2C=C (2,02 ppm), CH2C=O (2,24 ppm), CH=CH (5,33 ppm).

<ol><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+host+for+studying+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time.</a> Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).</li>
<li>Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+adiabatic+TOBSY+sequences+provide+enhanced+sensitivity+for+multidimensional+high-resolution+magic-angle-spinning+1H+MR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy.</a> J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).</li>
<li>Astrakas, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+spectroscopy+shows+lipids+accumulate+in+skeletal+muscle+in+response+to+burn+trauma-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis.</a> Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).</li>
<li>Fan, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+by+one-+and+two+dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nuc+Magn+Reson+Spec%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).</li>
<li>Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+Drosophila+at+18.8+Tesla%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla.</a> PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).</li>
<li>Zektzer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+signal+to+noise+in+high-resolution+magic+angle+spinning+total+correlation+spectroscopy+studies+of+prostate+tissues+using+rotor-synchronized+adiabatic+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses.</a> Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustalonymi przez Institutional Animal Research Review Board Committee Massachusetts General Hospital.

Z wyjątkiem niedawnego doniesienia o możliwości przeprowadzenia obrazowania MRI in vivo u muszek owocowych 6, badania MRS in vivo u Drosophila nie zostały jeszcze opisane. W niniejszym protokole opisujemy wdrożenie nowej metody in vivo HRMAS 1H-MRS do wykrywania biologicznie istotnych cząsteczek. W szczególności wykryliśmy lipidy i małe metabolity u żywych muszek Drosophila przy polu 14,1 T w czasie około 45 min, co zapewnia odpowiedni czas akwizycji, prz...

<table><tbody><tr><td>Tlenek deuteru</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetylosilyl)propionian-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; kwas</td><td>Odczynniki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24493-21-8</td><td></td></tr><tr><td>agar, sacharoza, drożdże, mąka kukurydziana</td><td>Pożywka</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flystuff.com/&quot;&gt;http://www.flystuff.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Muchy szczepów Oregon RS lub Canton-S</td><td>Linie dorosłych much</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://flystocks.bio.indiana.edu/&quot;&gt;http://flystocks.bio.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td>(rozmiar 0)</td></tr><tr><td>probówki 2 ml</td><td>Sprzęt</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatory dla much</td><td>Wyposażenie</td><td></td><td></td><td>wysoka wilgotność względna (60–75%), regulowana temperatura oraz 12-godzinny cykl światła i ciemności (12 h:12 h).</td></tr><tr><td>Spektrometr NMR Bruker Bio-Spin Avance (600,13 MHz) z sondą 4 mm do potrójnego rezonansu (&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H, &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C, &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H) sonda HRMAS </td><td>Sprzęt</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>urządzenie BTO-2000 w połączeniu z pneumatyczną jednostką MAS</td><td>Sprzęt</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor z tlenku cyrkonu 4 mm (pojemność 50 µl)</td><td>Sprzęt</td><td>Bruker Corporation</td><td>B3829 (sklep Bruker)</td><td></td></tr><tr><td>MestReC (Mestrelab Research) </td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>Analiza jednowymiarowych widm NMR&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://mestrelab.com/&quot;&gt;http://mestrelab.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SPARKY 3, USCF</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td>Analiza widm 2D NMR&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&quot;&gt;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

spektroskopia rezonansu magnetycznego żywych much drosophila melanogaster z wykorzystaniem wiru pod magicznym kątem

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Spektroskopia rezonansu magnetycznego protonów z wysoką rozdzielczością i magicznym kątem wirowania (HRMAS) (1(H-MRS) jest nową nieinwazyjną techniką, która poprawia szerokość linii widmowych i umożliwia uzyskanie widm o wysokiej rozdzielczości z ekstraktów, nienaruszonych komórek, kultur komórkowych, a co najważniejsze, z nienaruszonej tkanki, w celu badania zależności między metabolitami a procesami komórkowymi.In vivoHRMAS1Badania z wykorzystaniem H-MRS nie zostały jeszcze zgłoszone w przypadku żywej muszki owocówkiDrosophila melanogaster. Drosophila,jako prostszy organizm genetyczny, pozwala na badanie wielu funkcji biologicznych i różnych ewolucyjnie zachowanych szlaków sygnalizacyjnych na poziomie całego organizmu, stanowiąc przydatny model do badań nad genetyką i fizjologią. W tym celu opracowaliśmy i wdrożyliśmyin vivoHRMAS1Metoda H-MRS do badania żywych tkanekDrosophila przy 14,1 T. W niniejszej pracy przedstawiamy HRMAS1Protokół H-MRS do charakterystyki molekularnejDrosophilaza pomocą konwencjonalnego spektrometru MR wyposażonego w sondę HRMAS. Ta technika jest nowatorską,in vivo,nieniszczącyDrosophilapodejście do pomiaru metabolitów, które umożliwia identyfikację biomarkerów chorób, a tym samym może przyczynić się do opracowania nowych metod terapeutycznych.

Technika ta umożliwia zastosowanie wysokorozdzielczej spektroskopii protonowej MR z rotacją pod kątem magicznym (HRMAS 1H-MRS) do charakterystyki molekularnej żywych Drosophila melanogaster przy użyciu konwencjonalnego spektrometru o indukcji 14,1 tesla wyposażonego w sondę HRMAS.

Spektroskopia rezonansu magnetycznego żywych much Drosophila melanogaster z wykorzystaniem wiru pod magicznym kątem

Spektroskopia rezonansu magnetycznego protonów (1H-MRS) z zastosowaniem wysokiej rozdzielczości i wirowania pod kątem magicznym (HRMAS) to nowatorska, nieniszcząca technika, która poprawia rozdzielczość widmową...

Na 24 godziny przed eksperymentem samca muchy umieszcza się w probówce o pojemności dwóch mililitrów. Po krótkim znieczuleniu lodem, muchę wpycha się do wkładu rotora NMR, a następnie umieszcza w probówce rotora. Na wkład rotora dodaje się roztwór wzorcowy TSP, po czym rotory zamyka się górną zatyczką.Rotor zostaje wprowadzony do sondy H-R-M-A-S i ustawiony pod kątem magicznym 54,7 stopnia. Spektrometr zostaje skonfigurowany do przeprowadzenia eksperymentów jednowymiarowych i dwuwymiarowych. Na koniec przeprowadzana jest analiza widm Mr.Spectra próbek.Jestem Valeria Rigi z Laboratorium Chirurgii NMR w Katedrze Chirurgii w Massachusetts General Hospital i Harvard Medical School. Cześć, jestem Y AB z Laboratorium Chirurgii Molekularnej w Katedrze Chirurgii w Massachusetts General Hospital i Harvard Medical School. Witam, jestem Lawrence Achman, dyrektor Laboratorium Chirurgii Molekularnej oraz Katedry Chirurgii w Massachusetts General Hospital i Harvard Medical School.Jestem Mario Zika, dyrektorem Laboratorium Chirurgicznego NMR w Massachusetts Journal Hospital oraz współpracownikiem Aula Martin Center w Harvard Medical School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę molekularnej charakterystyki dużych Melanogaster przy użyciu spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania metabolitów in vivo w celu identyfikacji biomarkerów chorobowych, które przyczyniają się do opracowania nowych metod terapeutycznych. Zatem zacznijmy.Przygotowania należy rozpocząć od zbierania nowo wyklutych much przez trzy dni, a następnie przenieść je do probówek z świeżą pożywką dla much. Zebrane muchy należy inkubować przez pięć dni, tak aby w momencie rozpoczęcia eksperymentu miały od pięciu do ośmiu dni. W naszych eksperymentach wykorzystujemy wyłącznie samce much.Przygotuj eksperymentalne probówki o pojemności dwóch mililitrów dla much, wykonując otwór w pokrywce probówki za pomocą rozgrzanej nad płomieniem igły insulinowej. Następnie umieść pojedyncze muchy w probówkach zawierających porcję pożywki dla much na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Użyj wagi precyzyjnej, aby zważyć probówki bezpośrednio przed i po umieszczeniu w nich muchy, a następnie wyznacz masę każdej muchy poprzez odjęcie tych dwóch wartości.Pojedyncza samica muchy zazwyczaj waży od 0,7 do jednego miligrama po przygotowaniu. Przejdźmy do przygotowania rotora do wysokorozdzielczego wirowania pod kątem magicznym (H-R-M-A-S). Aby zacząć.Umieść pojedynczą probówkę w lodzie na mniej niż minutę. Aby znieczulić muchę, połóż ją na warstwie folii aluminiowej umieszczonej na lodzie i za pomocą miękkiego pędzla delikatnie wepchnij ją do półkulistej wnęki wkładki NMR. Upewnij się, że mucha została całkowicie wprowadzona do środka, unikając przy tym jakichkolwiek obrażeń.Umieść wkład w rurce rotora z tlenku cyrkonu, aby zlokalizować muchy pomiędzy wkładem rotora a dnem rotora. Następnie zamknij wkład za pomocą śruby i zabezpiecz go parafilmem, aby zapobiec kontaktowi muchy z roztworem standardowym TSP, który służy jako odniesienie zarówno dla chemicznego przesunięcia rezonansowego, jak i dla ilościowego oznaczenia. Na górną część wkładu rotora dodaj 8 µL roztworu standardowego TSB, a następnie zabezpiecz i mocno dokręć cały układ rotora za pomocą górnej zaślepki. Zobaczmy teraz, jak pozyskać dane H-R-M-A-S.Wprowadź rotor do sondy H-R-M-A-S i ustaw go pod kątem magicznym, wynoszącym 54.7 stopni. Następnie ustaw szybkość wirowania H-R-M-A-S-H one MRS na 2 kHz MAS i użyj kontrolera prędkości MAS w celu jej stabilizacji. Ustaw temperaturę na 4 °C za pomocą jednostki BTO 2000.W połączeniu z jednostką pneumatyczną MAS. Muchy są utrzymywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza podczas przebywania w spektrometrze, aby utrzymać anestezję w celu przygotowania magnesu, dostrojenia i dopasowania cewki dla uzyskania optymalnej wydajności oraz shimowania magnesu dla zapewnienia optymalnej jakości widm. Po zakończeniu shimowania należy zsynchronizować opóźnienie INTERPULSE z częstotliwością obrotu MAS.Ustaw liczbę przejściowych sygnałów (transients) na 256 z 32 768 punktami danych. Pozyskaj jednowymiarowe widmo single fly, używając synchronizowanego z rotorem impulsu Purcell MEO kill lub sekwencji impulsów spin echo CPMG. Sekwencja ta działa jako filtr T2 w celu usunięcia poszerzenia widma.Następnie uzyskaj dwuwymiarowe widmo pojedynczej próbki dla wszystkich próbek, stosując sekwencję topsy z impulsami atic. Otwórz rotor i wyjmij próbkę. Przejdźmy teraz do analizy danych.Do analizy widm MR naszych próbek wykorzystujemy oprogramowanie mare. W pierwszej kolejności należy zastosować funkcję poszerzenia linii o wartości 0,5 Hz dla wszystkich danych HRM A SH one fis przed przeprowadzeniem transformacji Fouriera. Widma MR należy odnieść do TSP przy wartości delta równej 0,0 ppm.Przeprowadź manualną korekcję fazy widma i zastosuj estymator linii bazowej Whitakera, aby odjąć szerokie komponenty linii bazowej przed obliczeniem pól powierzchni pików. Wyznacz pola powierzchni pików za pomocą oprogramowania mastre. Skaluj wysokości pików względem TSP dla każdego pozyskanego widma.Przejdźmy teraz do analizy reprezentatywnych wyników MRS; tutaj przedstawiono reprezentatywne widmo DH one H-R-M-A-S-C-P-M-G uzyskane w próbkach z płytek typu well Oregon R flies. Wykryto i przypisano główne komponenty lipidowe, takie jak glicerol, oraz małe metabolity, m.in. beta-alaninę, octan, fosfocholinę i fosfoetanolaminę, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami. Sygnały przy 2,02 ppm przypisano protonom metylenowym grupy propanowej jednonienasyconych kwasów tłuszczowych. Kwasy nienasycone zidentyfikowano na podstawie sygnału przy 5,33 ppm generowanego przez protony grupy alkenowej.Małe metabolity, których nie można było przypisać lub które nie były widoczne w widmie 1D, zostały wykryte przy użyciu dwóch DH jeden H jeden top Z-H-R-M-A-S. W ten sposób pokazaliśmy Państwu po raz pierwszy, jak badać profil biochemiczny żywych Drosophila za pomocą wysokorozdzielczej spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego z rotacją magicznym kątem (HR-MAS). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest użycie miękkiego pincety do wprowadzania much, aby ich nie zranić.Należy uważać, aby nie dokręcić śruby zbyt mocno, aby uniknąć uszkodzenia owada; nie należy również pozyskiwać widm przez więcej niż godzinę, ponieważ muchy mogą nie przeżyć. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

magnetic-resonance-spectroscopy-live-drosophila-melanogaster-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Spektroskopia Rezonansu Magnetycznego żywych Drosophila melanogaster z wykorzystaniem Magic Angle Spinning

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje metodę trójwymiarowego obrazowania stężenia tlenu w skali mikronowej w bezpośrednim otoczeniu żywych komórek z wykorzystaniem mikroskopii rezonansu spinowego elektronów.

Mikroobrazowanie za pomocą rezonansu spin-elektronowego żywych organizmów do mapowania tlenu

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Prezentowany tutaj jest protokół kriogenicznego transferu zamrożonych próbek do sondy dynamicznego rezonansu magnetycznego (NMR) dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) z magicznym kątem wirowania (MAS). Protokół zawiera wskazówki dotyczące przechowywania wirnika przed eksperymentem oraz wskazówki dotyczące pomiarów żywotności przed i po eksperymencie.

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

Struktury molekularne i dynamika ciał stałych, cieczy, gazów i mieszanin są niezwykle interesujące dla różnych dziedzin nauki. Wysokotemperaturowy, wysokociśnieniowy MAS NMR in situ umożliwia detekcję środowiska chemicznego składników w układach fazy mieszanej w ściśle kontrolowanym środowisku chemicznym.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego in situ z magicznym kątem wirowania

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) stało się coraz popularniejszym narzędziem do badania fenotypu myszy z modyfikacjami genetycznymi. Niniejszy artykuł przedstawia metody niezbędne do przeprowadzenia wysokoprzepustowego fenotypowania myszy z modyfikacjami genetycznymi przy użyciu MRI dla wielu osobników jednocześnie.<br...

Neuroanatomiczny obrazowanie magnetycznemu rezonansem dla wielu myszy

Genetycznie kodowane narzędzia optogenetyczne umożliwiają nieinwazyjną manipulację specyficznymi neuronami w mózgu Drosophila. Takie narzędzia mogą identyfikować neurony, których aktywacja jest wystarczająca do wywołania lub stłumienia określonych zachowań. W tym miejscu przedstawiamy metodę aktywacji rodopsyny kanałowej2, która ulega ekspresji w docelowych neuronach u swobodnie chodzących muszek.

Optogenetyczna stymulacja zachowań ucieczkowych u Drosophila melanogaster

Poznaj spektroskopię HRMAS 1H-MRS do nieinwazyjnej charakteryzacji molekularnej żywych osobników Drosophila melanogaster. Metoda umożliwia badanie metabolitów in vivo przy użyciu konwencjonalnego spektrometru 14,1 T.

Spektroskopia rezonansu magnetycznego żywych much Drosophila melanogaster z wykorzystaniem wiru pod magicznym kątem

Przeglądaj więcej filmów