Name: Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów. (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 27 s
Description: Poznaj metodę Hi-C do badania trójwymiarowej architektury genomów i długozasięgowych interakcji chromatyny. Technika ta umożliwia identyfikację terytoriów chromosomowych oraz kompartmentalizacji chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy A. Kosmrlj za dyskusje i kod; A. P. Aiden, X. R. Bao, M. Brenner, D. Galas, W. Gosper, A. Jaffer, A. Melnikov, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, A. J. M. Walhout, L. Wood oraz K. Zeldovich za dyskusje; a L. Gaffney i B. Wong za pomoc w wizualizacji. 
Wsparcie finansowe zapewnili: Fannie and John Hertz Foundation (stypendium dla doktorantów), National Defense Science and Engineering (stypendium dla doktorantów), NSF (stypendium dla doktorantów), National Space Biomedical Research Institute oraz National Human Genome Research Institute (NHGRI) w ramach grantu nr T32 HG002295 (E.L.); i2b2 (Informatics for Integrating Biology and the Bedside), finansowany przez NIH Center for Biomedical Computing w Brigham and Women s Hospital (L.A.M.); NHGRI w ramach grantu nr HG003143 oraz Keck Foundation (wyróżnienie dla wybitnych młodych naukowców) (J.D.). Surowe i zmapowane dane z sekwencjonowania Hi-C zostały zdeponowane w bazie danych GEO (<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/">www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</a>), numer dostępu GSE18199. Dodatkowe wizualizacje są dostępne pod adresem <a href="http://hic.umassmed.edu">http://hic.umassmed.edu</a>.

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Kosak, S. T., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+the+genomic+organization+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation.</a> Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (2007).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+in+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation in the Third Dimension.</a> Science. 319, 1793-1794 (2008).</li>
<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).</li>
<li>Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+through+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+and+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulation through nuclear organization.</a> Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).</li>
<li>Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+A+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).</li>
<li>Miele, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Cis-+and+Trans+Chromatin+Interaction+Networks+Using+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).</li>
<li>Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALLPATHS+2%3A+small+genomes+assembled+accurately+and+with+high+continuity+from+short+paired+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+%22%5BJournal%5D)">ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads.</a> Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).</li>
</ol>

Wniosek o patent tymczasowy na metodę Hi-C (nr 61/100,151) jest w trakcie rozpatrywania.

Przedstawiamy metodę badania trójwymiarowej architektury genomu poprzez mapowanie oddziaływań chromatyny w sposób bezstronny i w skali całego genomu. Najbardziej krytycznym krokiem eksperymentalnym – który odróżnia tę technologię od wcześniejszych prac – jest wbudowanie nukleotydów znakowanych biotyną na końcach restrykcyjnych fragmentów po sieciowaniu, przed ligacją końców tępych. Pomyślne wykonanie tego kroku umożliwia głębokie sekwencjonowanie wszystkich miejsc ligacji, co nadaje metodzie Hi-C jej zakres i precyzję. Liczba odczytów ostatecznie determinuje rozdzielczość map interakcji. W tym przypadku przedstawiono mapę interakcji ludzkiego genomu o rozdzielczości 1 Mb, wykorzystując ~30 milionów odczytów możliwych do dopasowania. Aby zwiększyć ogólną rozdzielczość o współczynnik n, liczbę odczytów należy zwiększyć o współczynnik n2. Technikę Hi-C można łatwo łączyć z innymi metodami, takimi jak hybrydyzacyjnay wychwyt po generowaniu biblioteki (w celu ukierunkowania na konkretne fragmenty genomu) oraz immunoprecypitacja chromatyny po ligacji (w celu zbadania środowiska chromatyny w regionach związanych ze specyficznymi białkami).

<table><tbody><tr><td>Inhibitory proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340-5ml</td><td>Krok 1.2</td></tr><tr><td>biotyna-14-dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>19518-018</td><td>Krok 1.6</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td>Kroki 1.6 i 2.2</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaza</td><td>Invitrogen</td><td>15224</td><td>Krok 1.9</td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td>Kroki 1.17 i 2.2</td></tr><tr><td>10x bufor ligacyjny</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td>Kroki 2.2 i 3.4</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>Krok 2.2</td></tr><tr><td>Klenow (exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>Krok 2.3</td></tr><tr><td>Kule Dynabeads MyOne Streptavin C1</td><td>Invitrogen</td><td>650.01</td><td>Krok 3.2</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaza HC</td><td>Enzymatics</td><td>L603-HC-L</td><td>Krok 3.5</td></tr><tr><td>Phusion HF mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>F531</td><td>Krok 3.8</td></tr><tr><td>Kule Ampure</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A2915</td><td>Krok 3.9</td></tr></tbody></table>

hi-c: metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Trójwymiarowe zwijanie się chromosomów prowadzi do kompartymentalizacji genomu i może zbliżać do siebie w przestrzeni odległe elementy funkcjonalne, takie jak promotory i enhancery 2-6. Zrozumienie zależności między organizacją chromosomów a aktywnością genomu pomoże w wyjaśnieniu procesów genomicznych, takich jak transkrypcja i replikacja. Jednak niewiele wiadomo o mechanizmach zwijania się chromosomów. Mikroskopia nie pozwala na jednoczesne rozróżnianie licznych loci lub ich obrazowanie z wysoką rozdzielczością. Do tej pory wykrywanie interakcji chromosomalnych przy użyciu metody uchwycenia konformacji chromosomów (3C) i jej późniejszych modyfikacji wymagało wyboru zestawu docelowych loci, co uniemożliwiało prowadzenie badań w skali całego genomu 7-10.
Opracowaliśmy metodę Hi-C, będącą rozszerzeniem techniki 3C, która umożliwia identyfikację oddziaływań dalekiego zasięgu w sposób nieobciążony w skali całego genomu. W metodzie Hi-C komórki są utrwalane formaldehydem, co powoduje powiązanie oddziałujących loci za pomocą kowalencyjnych mostków białkowo-DNA. Gdy DNA jest następnie fragmentowane za pomocą enzymu restrykcyjnego, loci te pozostają połączone. Podczas wypełniania nawisów 5' wbudowywany jest resztowy pierścień biotyny. Następnie przeprowadzana jest ligacja końców tępych w warunkach rozcieńczenia, które sprzyjają ligacji fragmentów DNA połączonych mostkami białkowymi. W rezultacie powstaje biblioteka produktów ligacji w skali całego genomu, odpowiadająca parom fragmentów, które pierwotnie znajdowały się w bliskim sąsiedztwie w jądrze komórkowym. Każdy produkt ligacji jest znakowany biotyną w miejscu złącza. Biblioteka jest poddawana fragmentacji mechanicznej, a złącza są wyodrębniane przy użyciu kulek z streptawidyną. Oczyszczone złącza mogą być następnie analizowane przy użyciu sekwenatora wysokoprzepustowego, co pozwala na stworzenie katalogu oddziałujących fragmentów.
Bezpośrednia analiza otrzymanej macierzy kontaktów ujawnia liczne cechy organizacji genomowej, takie jak obecność terytoriów chromosomowych oraz preferencyjne powiązania małych, bogatych w geny chromosomów. Analizę korelacyjną można zastosować do macierzy kontaktów, co wykazuje, że genom ludzki jest podzielony na dwa przedziały: przedział o mniejszej gęstości upakowania, zawierający otwartą, dostępną i aktywną chromatynę, oraz przedział o większej gęstości, zawierający zamknięte, niedostępne i nieaktywne regiony chromatyny. Wreszcie, analiza zespołowa macierzy kontaktów, w połączeniu z wyprowadzeniami teoretycznymi i symulacjami komputerowymi, wykazała, że w skali megabazy metoda Hi-C ujawnia cechy zgodne z konformacją fraktalnego globulu.

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Trójwymiarowe zwijanie się chromosomów kompartymentuje genom i może zbliżać do siebie odległe elementy funkcjonalne, takie jak promotory i enhancery, ...

Hi.C jest metodą identyfikacji dalekosiężnych oddziaływań chromatyny w sposób bezstronny w całej skali genomu. Najpierw komórki utrwala się formaldehydem, następnie poddaje lizie, a DNA fragmentuje za pomocą enzymu restrykcyjnego. Następnie, podczas wypełniania nawisów 5', wbudowywana jest reszta biotynowana, a ligację przeprowadza się w warunkach rozcieńczenia, które sprzyjają zdarzeniom ligacji pomiędzy fragmentami DNA powiązanymi sieciowaniem.Bibliotekę poddaje się fragmentacji, a miejsca złączeń wyodrębnia się za pomocą kulek strep-havein. Oczyszczone złączenia mogą być następnie analizowane przy użyciu sekwenatora wysokoprzepustowego, co pozwala na stworzenie katalogu oddziałujących fragmentów. Wyniki te dostarczają nam wiedzy na temat fałdowania chromatyny, ujawniając obecność terytoriów chromosomowych, kompartymentację genomu na chromatynę otwartą i zamkniętą oraz dowody na organizację typu Fractal Globule w skali megabazy.Cześć, jestem Nka Van Bergham z Laboratorium Field Decker w programie funkcji i ekspresji genów na University of Massachusetts Medical School. Cześć, jestem Ez Lieberman Aiden z laboratorium Erica Landera w Broad Institute Uniwersytetu Harvarda i Massachusetts Institute of Technology. Jestem Louis Williams z grupy badawczo-rozwojowej biologii molekularnej w Broad Institute, a to jest Maxima Mackay z laboratorium Len Muni z Massachusetts Institute of Technology.Dzisiaj przedstawimy procedurę potwierdzania uchwytu chromosomowego w całym genomie, zwaną High-C. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do eksperymentalnego badania architektury ludzkiego genomu. Pierwsza część procedury, którą Państwu zaprezentujemy, zostanie przeprowadzona w UMass Medical School, natomiast druga część zostanie wykonana w Instytucie Prude. Pokażemy również, w jaki sposób wykorzystaliśmy wyniki eksperymentu High-C do symulacji dynamiki genomu w MIT.Zacznijmy zatem. Hi-C rozpoczyna się od sieciowania komórek, co jest powszechną metodą w technikach uchwytywania konformacji chromosomów.Aby rozpocząć, należy hodować od 2 × 10⁷ do 2,5 × 10⁷ komórek ssaków,y przyczepionych do podłoża lub w zawiesinie, a następnie poddać komórki sieciowaniu. Poddać komórki lizie w 550 µL buforu do lizy, używając homogenizatora. Odwirować chromatynę przy 5 000 RPM i dwukrotnie przemyć osad 500 µL buforu NEB 2. Przenieść próbki do pięciu ponumerowanych probówek i dodać bufor NEB 2 do uzyskania końcowej objętości 362 µL.Ostrożnie dodaj 38 µL mieszaniny 1% SDS i inkubuj w temperaturze 65 °C przez 10 minut. Natychmiast umieść probówki z powrotem w lodzie i zneutralizuj SDS, dodając 44 µL Triton X 100 zmieszanego dokładnie z 400 jednostkami HindIII, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc w rotacji. Kolejne etapy są specyficzne dla metody Hi-C i obejmują znakowanie końców DNA biotyną oraz ligację tępych końców fragmentów sprzężonych.Krok ten pozwoli na późniejsze oczyszczenie złączy ligacyjnych w probówce. Próbka ta nie powinna przejść etapu elucji biotyny i powinna zamiast tego służyć jako kontrola 3'C, aby upewnić się, że warunki trawienia i ligacji były optymalne do wypełnienia nawisów fragmentów restrykcyjnych i znakowania końców DNA biotyną w pozostałych czterech probówkach. Do probówek od drugiej do piątej należy dodać dATP, dGTP i dTTP.Należy również dodać biotynowany DCTP oraz Klino. Wymieszać ostrożnie i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji umieścić probówki na lodzie, a następnie dodać do wszystkich probówek 86 µL 10% SDS w celu inaktywacji enzymów.Inkubuj probówki w temperaturze 65 °C przez dokładnie 30 minut, a następnie bezzwłocznie umieść je w lodzie. Aby sprzyjać ligacji między fragmentami powiązanymi krzyżowo, proces ligacji przeprowadza się w warunkach ekstremalnego rozcieńczenia. Pracując w lodzie, dodaj 7,61 ml mieszaniny ligacyjnej do każdej z pięciu probówek o pojemności 15 ml.Następnie przenieś każdą mieszaninę trawionej chromatyny do odpowiedniej probówki. Do probówki pierwszej dodaj 10 µL ligazy DNA T4, aby przeprowadzić standardową ligację 3C. Następnie do probówek od drugiej do piątej dodaj 50 µL ligazy DNA T4 w celu przeprowadzenia ligacji High-C końców tępych.Wymieszać zawartość probówek poprzez ich odwracanie i inkubować przez cztery godziny w temperaturze 16 °C. Po inkubacji przeprowadzić degradację białek oraz odwrócenie sieciowania CNA, dodając do każdej probówki 50 µL proteinazy K i inkubując probówki przez noc w temperaturze 65 °C. Następnego dnia dodać kolejne 50 µL proteinazy K do każdej probówki i kontynuować inkubację w temperaturze 65 °C przez kolejne dwie godziny.Zmieszaj roztwory reakcyjne i przenieś je do pięciu stożkowatych probówek o pojemności 50 ml. Oczyść DNA w tych probówkach, przeprowadzając ekstrakcję fenolem. Dodaj 10 ml fenolu i mieszaj w wibratorze typu vortex przez dwie minuty.Wiruj próbówki przez 10 minut przy 3 500 RPM i ostrożnie przenieś jak największą część fazy wodnej do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Powtórz ekstrakcję przy użyciu fenolu i chloroformu, a następnie wytrącaj DNA za pomocą etanolu. Po odwirowaniu wytrąconego w etanolu DNA, każdy osad DNA rozpuść w 450 µL buforu 1X TE i przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Kolejną rundę oczyszczania przeprowadź, wykonując dwie ekstrakcje fenolowo-chloroformowe z użyciem 500 µL fenolu i chloroformu; mieszaj na wortexie przez jedną minutę, wiruj próbówki przez pięć minut przy 14 000 RPM, a po drugiej ekstrakcji przenieś fazę wodną do nowej probówki.DNA poddaje się precypitacji etanolem; po odwirowaniu osadu DNA, każdą pelletkę DNA przemywa się raz 70% etanolem, a następnie resuspenduje w 25 µl buforu one XT. Wszelkie obecne RNA należy zdegradować, dodając 1 µl RNazy po jednej probówce i inkubując je przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Zawartość probówek od drugiej do piątej należy poddać obróbce wysokotemperaturowej, zachowując probówkę pierwszą oddzielnie jako kontrolę niskotemperaturową.Jest to odpowiedni moment na sprawdzenie ilości i jakości bibliotek poprzez przeprowadzenie elektroforezy próbki w żelu 0,8% AASE. Wydajność ligacji w procedurze Hi-C należy ocenić za pomocą testu trawienia PCR. Tworzenie końców tępych oraz ligacja przeprowadzona w procedurze Hi-C wytworzą miejsca restrykcyjne dla endonukleazy w HE1; fragmenty amplifikowane z bibliotek 3C i Hi-C mogą zostać poddane trawieniu za pomocą HindIII i NHE1, aby określić stopień wytworzenia końców tępych oraz zidentyfikować fragmenty, które nie zostały poddane ligacji. Usuń biotynę z tych niezlignowanych końców, wykorzystując aktywność egzonukleazy polimerazy DNA T4, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Ponownie oczyść DNA, stosując ekstrakcję fenolowo-chloroformową oraz wytrącanie etanolem, a następnie zawieś osady DNA w całkowitej objętości 100 µL wody. Jeśli próbka przeszła testy kontroli jakości, protokół kontynuuje etap bio timple down i sekwencjonowania. Dziękujemy.Aby dostosować BIOTYNYLOWANE DNA do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, DNA musi zostać ścięte do rozmiaru od 300 do 500 par zasad za pomocą urządzenia CAVAS S two. Uszkodzone DNA naprawia się poprzez dodanie 10 x buforu lation, dNTPs, polimerazy T four, kinazy POLYNUCLEOTIDE, polimerazy clear now oraz wody. Próbki inkubuje się przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji należy wykorzystać kolumnę Kaya Gym MinLu do oczyszczenia DNA zgodnie z zaleceniami producenta. Po nałożeniu DNA na kolumnę i przemyciu kolumny, eluj DNA dwukrotnie, używając 50 µL buforu one XTLE, a następnie przyłącz dATP do końców naprawionego DNA, dodając 10 XNEB buforu, dATP, wodę oraz egzonukleazowo niedoborowy cile fragment.Inkubować reakcję przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu inaktywacji fragmentu cile. Inkubować reakcje przez 20 minut w temperaturze 65 °C, a następnie schłodzić reakcje na lodzie przy użyciu wirówki SpeedVac, redukując objętość reakcji do 20 µL. Następnie nanieść DNA na żel agarozowy 1,5% z buforem 1× TAE i prowadzić elektroforezę przez 3,5 godziny przy napięciu od 80 do 90 V.Wycinamy fragmenty DNA o długości od 300 do 500 par zasad i oczyszczamy je za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu Qiagen, wykorzystując od dwóch do czterech kolumnek w zależności od masy żelu. Łączymy eluaty z kolumnek i uzupełniamy końcową objętość do 300 µL za pomocą buforu 1x TE. Na koniec oznaczamy stężenie DNA metodą QU assay przy użyciu urządzenia Qubit i obliczamy całkowitą ilość DNA w tej części protokołu.Miejsca ligacji są oczyszczane z puli DNA, co umożliwia wydajną identyfikację oddziałujących fragmentów chromatyny za pomocą sekwencjonowania par końcowych. Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w probówkach DNA low bind. Przygotować kuleczki do wiązania biotyny.Przeprowadź etap pull-down, płucząc 150 µL resuspenderowanych kulek magnetycznych z tyminą streptawidyny A dwukrotnie 400 µL buforu Tween 1x. Kolejne etapy płukania składają się z pięciu kroków: dodania buforu do kulek, przeniesienia mieszaniny do nowej probówki, rotowania próbki przez trzy minuty w temperaturze pokojowej oraz odzyskania kulek za pomocą koncentratora cząstek magnetycznych.Usuwam supernatant. PrzesuspendTime kuleczki w 300 µL buforu 2x no tween i połącz je z 300 µL cDNA o wysokim powinowactwie. Pozostaw biotynilowane cDNA o wysokim powinowactwie, aby związało się z kuleczkami strep din, inkubując mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut przy jednoczesnym rotowaniu.Odzyskaj DNA związane ze strp A w kuleczkach za pomocą magnetycznego koncentratora cząstek i usuń nadsącz. Przepłucz kuleczki 400 µL buforu 1x no tween, a następnie 100 µL buforu do ligacji 1x. Resuspenduj kuleczki w 50 µL buforu do ligacji 1x i przenieś mieszaninę do nowej probówki.Aby przygotować DNA do sekwencjonowania par końców Illumina, należy wziąć całkowitą ilość DNA wprowadzoną przez użytkownika do procesu wyciągania streptawidyną (biotin pull down), obliczoną wcześniej za pomocą testu ilościowego, i podzielić ją przez 20, aby oszacować ilość cDNA o wysokim stopniu oczyszczenia, która została wyciągnięta i jest dostępna do ligacji. Należy dodać sześć pM adapterów Illumina paired-end na mikrogram cDNA dostępnego do ligacji. Do ligacji adapterów z DNA należy użyć 1 200 jednostek ligazy T4 DNA.Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Usunąć nieprzyligowane adaptery końców parzystych poprzez odzyskanie kulek związanych z wysoką ilością cDNA i dwukrotne przemycie kulek 400 µL buforu one x tween. Przemyć kulki 200 µL buforu one x, no tween, a następnie 200 µL i 50 µL buforu one XNEB.Dwie po ostatnim przemyciu. Resuspender kuleczki w 50 µL buforu NEB buffer two i przenieść do nowej probówki. W celu określenia liczby cykli niezbędnych do wygenerowania wystarczającej ilości produktu PCR do sekwencjonowania.Przygotuj cztery testowe reakcje PCR z 6, 9, 12 lub 15 cyklami. Wyznacz optymalną liczbę cykli, przeprowadzając reakcje PCR w 5% żelu poliakrylamidowym i barwiąc go barwnikiem Cyber Green, aby upewnić się, że nie występują pasma niespecyficzne, a pomiędzy 400 a 600 parami zasad widoczny jest smear, co odpowiada długości wspólnych produktów po ligacji z adapterami. Amplifikuj pozostałą część biblioteki high C (round stripped), znajdującą się w kuleczkach, w wielkoskalowej reakcji PCR z optymalną liczbą cykli. Wyjmij produkty PCR z oddzielnych studzienek i odzyskaj kuleczki.Należy zachować 1% produktów PCR z reakcji w dużej skali w oddzielnej probówce do analizy w elektroforezie żelowej, a pozostałą część produktu PCR oczyścić za pomocą kulek Purebeads w objętości 1,8 razy większej niż objętość próbki, zgodnie z zaleceniami producenta. DNA należy eluować w 50 µL buforu XTLE, a następnie porównać 1% produktu PCR oczyszczonego kuleczkami PU z 1% aliquotem oryginalnego produktu PCR na 5% żelu poliakrylamidowym. Po potwierdzeniu skutecznego usunięcia sekwencji starterów PCR, bibliotekę Hi-C poddano sekwencjonowaniu par końcowych Illumina, dopasowując każdy koniec niezależnie przy użyciu MAC w celu zidentyfikowania oddziałujących fragmentów chromatyny.Poniższe wyniki są oczekiwane przy poprawnym technicznie wykonaniu protokołu high C i mogą być uznane za standardy kontroli jakości. Kroki kontroli jakości powinny wykazać, że biblioteki three C oraz high C migrują jako dość wąskie prążki o wielkości powyżej 10 kilo bases. Rozmaz DNA świadczy o niskiej wydajności ligacji.Zazwyczaj wydajność ligacji jest nieco niższa w bibliotece High-C w porównaniu do matrycy 3C. Stopień znakowania High-C oraz wydajność ligacji można oszacować poprzez trawienie produktu PCR 3C. Połączenia 3C są cięte przez Hindi III, a nie przez NHE I.Odwrotna sytuacja ma miejsce w przypadku złączy o wysokiej zawartości C. Ten test trawienia PCR wykazuje, że 70% amplikonów o wysokiej zawartości C jest ciętych przez NHE one, a nie przez HI Hindi.Trzy. Potwierdzenie wydajnego znakowania złączy ligacji w analizie sekwencyjnej odczytów powinno wykazać, że odczyty z interakcji wewnątrzchromosomalnych i międzychromosomalnych, wskazane przez niebieskie i czerwone linie, wyrównują się znacznie bliżej miejsc restrykcyjnych Hindi trzy w porównaniu do losowo generowanych odczytów pokazanych na zielono.W udanym eksperymencie 55% dopasowanych par odczytów reprezentuje oddziaływania międzychromosomalne. 15% stanowi oddziaływania wewnątrzchromosomalne między fragmentami oddalonymi od siebie o mniej niż 20 kilobases, a 30% to pary odczytów wewnątrzchromosomalnych oddalonych o więcej niż 20 kilobases. Rozkład ten można przeanalizować przed sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym jako formę kontroli jakości.Klonowanie i sekwencjonowanie metodą Sangera około 100 klonów jest zazwyczaj wystarczające. Interakcje chromatyny można zwizualizować w formie mapy ciepła, w której osie X i Y reprezentują liniowy porządek genomiczny, a każdy piksel oznacza liczbę zaobserwowanych interakcji między nimi. Zazwyczaj fragmenty DNA, które znajdują się bardzo blisko siebie w liniowym genomie, wykazują tendencję do częstych interakcji ze sobą.Jest to widoczne na mapach wewnątrzchromosomalnych lub mapach ciepła jako wyraźna przekątna. Poniższe wyniki przedstawiają różne sposoby analizy danych w celu ujawnienia różnych poziomów organizacji genomu. Wykres prawdopodobieństwa kontaktu w funkcji odległości genomowej pokazuje, że prawdopodobieństwo kontaktu maleje wraz z odległością genomową, osiągając w końcu plateau dla każdej odległości.Interakcje wewnątrzchromosomalne, przedstawione linią ciągłą, są wzbogacone w stosunku do interakcji międzychromosomalnych, reprezentowanych przez linie przerywane. Bezpośrednio wskazuje to na obecność terytoriów chromosomalnych; obliczenie obserwowanej w stosunku do oczekiwanej liczby kontaktów międzychromosomalnych dla wszystkich par chromosomów ujawnia preferencyjne powiązania między określonymi parami chromosomów. Małe chromosomy bogate w geny wchodzą w preferencyjne interakcje ze sobą, co zaznaczono jasnoczerwonym kolorem.Można również analizować poszczególne chromosomy. Surową mapę ciepła można skorygować przy użyciu oczekiwanej mapy ciepła, aby uwzględnić odległość genomiczną między parami loci, co pozwala na uzyskanie mapy ciepła stosunku wartości obserwowanych do oczekiwanych. Następnie, poprzez korelację wierszy i kolumn map ciepła stosunku wartości obserwowanych do oczekiwanych, można stworzyć macierz korelacji.Za pomocą analizy korelacji wykazano, że genom ludzki dzieli się na dwa przedziały. Jest to zilustrowane wzorem szachownicą. Dzięki mapom ciepła korelacji z wykorzystaniem danych o wysokim C uzyskano nową wiedzę na temat zwijania się chromatyny w skali megabaz.Zwyczajny model polimerowy upakowania chromatyny sugerowałby, że chromatyna upakowuje się w formę równowagowego GLO. Wykres prawdopodobieństwa kontaktu w funkcji odległości pokazuje, że prawdopodobieństwo kontaktu skaluje się zgodnie z prawem potęgowym względem odległości genomowej, którego nachylenie wynosi w przybliżeniu minus jeden. Nie jest to zgodne z zachowaniem równowagowego Glo, ale odpowiada oczekiwaniom dla alternatywnej struktury znanej jako fraktalny glo. Przedstawiono tutaj dwie struktury globularne.Kolorystyka odpowiada odległości od jednego końca, przechodząc z niebieskiego przez cyjan, zielony, żółty i pomarańczowy aż do czerwonego. Podobnie jak globularne struktury równowagowe, globularne struktury fraktalne są pozbawione splotów w obrębie fraktalnego Glo. Lokacje położone blisko siebie wzdłuż konturu mają tendencję do bycia blisko siebie w przestrzeni 3D, co prowadzi do powstawania bloków monochromatycznych.Takich bloków nie stwierdzono w równowagowym Glo. Brak zaplątań można również udowodnić, usuwając siłę ograniczającą globule; pozwalając globule na ekspansję, fraktalny glo szybko ulega dekondensacji. Natomiast równowagowy Glo nie ulega temu procesowi, ponieważ jest zbyt mocno splątany.Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować bibliotekę wysokiego C dla analizatora. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zastosowaniu odpowiednich kontroli, aby zapewnić efektywną ligację wysokiego C oraz oczyszczanie. Liczba odczytów ostatecznie zdeterminuje rozdzielczość map oddziaływań.Wykorzystaliśmy około 30 milionów odczytów do wygenerowania map interakcji ludzkiego genomu z rozdzielczością około jednego megabazy. Aby zwiększyć rozdzielczość o czynnik N, liczba odczytów musi zostać zwiększona o czynnik n do kwadratu. Mam nadzieję, że nauka o strukturze ludzkiego genomu okaże się dla Państwa interesująca.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

hi-c-a-method-to-study-the-three-dimensional-architecture-of-genomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pakiet oprogramowania 3DNA jest popularnym i wszechstronnym narzędziem bioinformatycznym umożliwiającym analizę, konstrukcję i wizualizację trójwymiarowych struktur kwasów nukleinowych. Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły dla wybranych nowych i popularnych funkcji dostępnych w 3DNA, które można zastosować zarówno do pojedynczych struktur, jak i zespołów struktur powiązanych.

Analiza i budowanie struktur kwasów nukleinowych przy użyciu programu 3DNA

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

3D wielokolorowe DNA FISH reprezentuje narzędzie do wizualizacji wielu loci genomowych w zachowanych jądrach 3D, jednoznacznie definiując ich wzajemne oddziaływania i lokalizację w przestrzeni jądrowej na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisano protokół krok po kroku dla szerokiego spektrum ludzkich komórek pierwotnych.

Wielokolorowe narzędzie 3D DNA FISH do badania architektury jądrowej w ludzkich komórkach pierwotnych

Genom jest zorganizowany w przestrzeni jądrowej w różne struktury, które mogą być ujawnione za pomocą technologii przechwytywania konformacji chromosomów. Metoda Hi-C w jądrze zapewnia zbiór interakcji chromatyny w całym genomie w liniach komórkowych Drosophila, który generuje mapy kontaktów, które można badać w rozdzielczości megabazowej na poziomie fragmentu restrykcyjnego.

W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający wychwycenie interakcji chromatyny DNA z RNA w celu mapowania trójwymiarowej organizacji genomu powiązanej z RNA.

Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Poznaj metodę Hi-C do badania trójwymiarowej architektury genomów i długozasięgowych interakcji chromatyny. Technika ta umożliwia identyfikację terytoriów chromosomowych oraz kompartmentalizacji chromatyny.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Przeglądaj więcej filmów