Name: Analiza impulsowa łańcuchów cukrowych sprzężonych z N z glikoprotein w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-27T17:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodę analizy impulsowej N-glikanów w glikoproteinach komórek ssaków z wykorzystaniem chromatografii HPLC. Technika ta umożliwia śledzenie dynamicznych zmian w biosyntezie glikoprotein.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Zehavit Frenkel i Sandrze Tolchinsky za pomoc techniczną. Badania związane z niniejszą pracą są wspierane przez granty z Israel Science Foundation (1229/07) oraz German-Israeli Project Cooperation (DIP-DFG).

Niniejszy protokół przeznaczony jest do analizy łańcuchów cukrowych całkowitych glikoprotein lub konkretnej, interesującej glikoproteiny. Procedura jest w zasadzie taka sama w obu przypadkach, z kilkoma modyfikacjami, o których mowa w całym protokole.
<ol>
 <li> Do etykietowania metabolicznego glikanów wiązanych N potrzebne są podkonfluentne hodowle komórek ssaczych, hodowane przez noc w szalkach o średnicy 90 mm dla każdego próbnika (próbki mogą odpowiadać różnym punktom czasowym lub zabiegom). Protokół ten został zoptymalizowany dla komórek NIH 3T3.</li>
 <li> Osusz komórki z glukozy poprzez inkubację w 5 ml świeżo przygotowanego, podgrzanego (37°C) pożywki bez glukozy, uzupełnionej 10% dializowaną surowicą cielęcą (FCS) oraz 4 mM pirogronianem sodu przez 5–15 minut.</li>
 <li> Zastąp pożywkę osuszającą 1 ml podgrzanej (37°C) pożywki bez glukozy zawierającej 400 μCi [2-3H]-oznaczonej mannozy (niższe stężenie 65 μCi/ml stosuje się do oznaczania całkowitych glikoprotein), a następnie inkubuj komórki w standardowych warunkach hodowli tkankowej przez 1 godzinę.</li>
 <li> Usuń pożywkę do etykietowania z każdej próbki i ostrożnie dodaj 2 ml zimnego (4°C) roztworu buforowego PBS do próbek odpowiadających punktowi „puls” i umieść je na lodzie (nazywane dalej próbkami „puls”), podczas gdy próbki odpowiadające etapowi „pogoń” należy przemyć trzykrotnie 2 ml podgrzanej (37°C) normalnej kompletnej pożywki, a następnie umieścić w inkubatorze CO2 w 37°C z 5 ml podgrzanej standardowej pożywki na pożądane okresy „pogoni”.</li>
 <li> Przemyj próbki „puls” (wcześniej umieszczone na lodzie) trzykrotnie 2 ml zimnego roztworu PBS. Następnie zeskrob komórki ze szalki za pomocą szpatułki do komórek w 2 ml PBS i przenieś je do probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml.</li>
 <li> Krótko odwirować komórki przy 16000Xg (6–10 sekund), odrzucić supernatant i zamrozić osad komórkowy w -80°C.</li>
 <li> Wykonaj kroki 5 i 6 również dla próbek „pogoń” po zakończeniu czasu „pogoni”.</li>
 <li> Wyjmij komórki z zamrażarki i zniszcz je poprzez dodanie 300 μl buforu A, krótkie wiryzowanie i 20-minutową inkubację na lodzie; w przypadku analizy całkowitych glikoprotein – poprzez 20-minutową inkubację na lodzie z buforem B, a następnie sonikację (4 razy, po 10 sekund, przy maksymalnej amplitudzie), a następnie zagotuj próbki przez 5 minut.</li>
 <li> Owiń lizaty przy 16000Xg przez 20 minut w 4°C. Przenieś supernatant do nowej probówki Eppendorfa i odrzuć osad.</li>
 <li> Jeśli analizowane są całkowite glikoproteiny, przejdź do filtracji molekularnej i deglikozylacji (krok 17). W celu immunoprecypitacji glikoproteiny H2a, pokazanej w tym przykładzie, dodaj do supernatantu z kroku 9 po 20 μl/próbka zawiesiny 1:1 kulek agarozowych A (Repligen) oraz po 3 μl/próbka naszego poliklonalnego przeciwciała króliczego anty-H2a skierowanego przeciw pożądanej glikoproteinie (w naszym przykładzie przeciwciało anty-H2a).</li>
 <li> Inkubuj próbki przez 4–16 godzin w 4°C, stale mieszając poprzez powolne obracanie.</li>
 <li> Owiń kulki przy 16000Xg przez 30 sekund i ostrożnie usuń supernatant za pomocą wakuum.</li>
 <li> Przepłucz kulki, dodając 500 μl buforu D i wirując. Owiń jak w kroku 12 i usuń supernatant. Powtórz przemywanie trzykrotnie.</li>
 <li> Dodaj 10 μl buforu denaturującego (dostarczonego w zestawie NEB endo-H) do osadu kulek i zagotuj próbki przez 5 minut (gdy analizowane są całkowite białka, deglikozylacja jest przeprowadzana na filtrze Microcon, krok 17).</li>
 <li> Owiń kulki (16000Xg przez 30 sekund) i przenieś supernatant do nowej probówki Eppendorfa. Następnie dodaj do każdej próbki 0,5 μl enzymu endo H oraz 10 μl buforu reakcyjnego (dostarczonego również w zestawie NEB endo H) i inkubuj próbki przez 3 godziny w 37°C.</li>
 <li> Aby oddzielić uwolnione glikany od białek, próbki rozcieńcz pięciokrotnie wodą dejonizowaną i nałóż na filtr molekularny (Microcon Ultracel YM30) o wartości odcięcia 30 kDa, a następnie odwiń przy 14000Xg przez 3 minuty. Dodaj 50 μl wody dejonizowanej i powtórz odwirowanie. Przemywanie to powtarzaj jeszcze dwukrotnie, zachowując przesącz.</li>
 <li> Jeśli analizowane są całkowite glikoproteiny, nałóż supernatant lizatów (z kroku 9) na filtr Microcon. Przepłucz ekstrakt 100 μl buforu E, trzykrotnie poprzez wielokrotne odwirowanie przy 14000Xg przez 3 minuty. Dodaj 3 μl 10X buforu reakcyjnego endo H oraz 1,5 μl enzymu endo H do retentatu na filtrze Microcon i inkubuj przez 3 godziny w 37°C. Uwalniane glikany eluuje się wodą dejonizowaną przez trzykrotne odwirowanie, jak w kroku 16.</li>
 <li> Jeśli to pożądane, retentaty z kroków 16 i 17, zawierające glikoproteiny oporne na endo H, inkubuje się następnie z 200 mU N-glikozydazy F w 15 μl buforu C, w 37°C przez 16 godzin. Elucja wodą dejonizowaną przeprowadzana jest jak w kroku 16.</li>
 <li> Umieść probówkę zawierającą przesącz z reakcji endo H (kroki 16 i 17) w koncentratorze SpeedVac i całkowicie wysusz próbki (można to robić do temperatury 45°C w celu przyspieszenia procesu).</li>
 <li> Aby przygotować próbki do HPLC, zawieś suche osady w 12 μl rozpuszczalnika HPLC (acetonitryl:woda, 60:40, 1% kwas fosforowy).</li>
 <li> Ustaw urządzenie HPLC (podłączone do kolumny Spherisorb) na stały przepływ rozpuszczalnika (1 ml/min) i stałe ciśnienie (określona wartość pomiędzy 1000 a 2000 psi) oraz umieść kolektor frakcji tak, aby zmieniał probówkę co 1 minutę.</li>
 <li> Wprowadź próbki do urządzenia HPLC i jednocześnie uruchom kolektor frakcji.</li>
 <li> Zebranie 48 frakcji po 1 ml z każdego przebiegu próbki oraz z przebiegu mieszaniny oligosacharydów wzorcowych.</li>
 <li> Przenieś po 500 μl z każdej frakcji do fiolki scyntylacyjnej i wymieszaj zawartość z 3 ml cieczy scyntylacyjnej mieszającej się z wodą.</li>
 <li> Umieść fiolki w liczniku scyntylacyjnym i odczytaj wyniki.</li>
 <li> Wyniki w cpm przedstawia się jako funkcję numeru frakcji.</li>
 <li> Wartości cpm w obrębie szczytu odpowiadają określonym gatunkom glikanów w następujący sposób: frakcje 18–21 odpowiadają M5, frakcje 22–26 – M6, frakcje 27–31 – M7, frakcje 32–35 – M8, frakcje 36–39 – M9, frakcje 40–42 – G1M9, a frakcje 43–45 – G2M9.</li>
 <li>Suma wartości cpm dla frakcji w obrębie każdego szczytu odzwierciedla absolutną ilość określonego gatunku glikanu. Aby skompensować fakt, że gatunki zawierające więcej reszt mannozy przyłączają więcej znacznika, „względną ilość molową” każdego gatunku glikanu oblicza się następująco: absolutną ilość każdego gatunku glikanu dzieli się przez liczbę reszt mannozy, które zawiera. Następnie tę wartość dzieli się przez sumę względnych ilości molowych wszystkich uzyskanych gatunków glikanów, aby uzyskać „procent całkowity” dla każdego konkretnego gatunku glikanu.</li>
</ol> 
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="text-align:center;">Czas chase (h)</td>
 <td style="text-align:center;">0</td>
 <td style="text-align:center;">4</td>
		</tr>
		<tr>
 <td>Uwalniane z endo H (cpm) a</td>
 <td>90000</td>
 <td>16800</td>
		</tr>
		<tr>
 <td>Uwalniane z N-glikozydazy F (cpm) b</td>
 <td>20400</td>
 <td>3900</td>
		</tr>
		<tr>
 <td>Glikoproteiny w retentacie (cpm) c</td>
 <td>371700</td>
 <td>127695</td>
		</tr>
 <tr>
 <td>Dolicholo-oligosacharydy w retentacie (cpm) d</td>
 <td>4350</td>
 <td>540</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dolicholo-oligosacharydy w retentacie (%) e</td>
 <td>1.4 ± 0.7</td>
 <td>0.2 ± 0.2</td>
 </tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Analiza uwalniania łańcuchów cukrowych N-związanych za pomocą deglikozydaz oraz obecności dolicholo-oligosacharydów w próbkach glikoprotein.
Zastosowano procedurę typu puls-chase do lizatu z komórek NIH 3T3. Po filtracji za pomocą Microcon, znakowane oligosacharydy N-związane uwalniano głównie za pomocą endo H po etykiecie puls (typ wysokomannozowy) oraz dodatkowo za pomocą N-glikozydazy F po okresie śledzenia (chase), co odpowiadało oligosacharydom typu złożonego (glikanom przetworzonym w aparacie Golgiego), opornym na działanie endo H. Analiza ilościowa wykazała, że dolicholo-oligosacharydy stanowiły pomijalną frakcję znacznika w początkowym retentacie.
Uwagi:
<ol class="lalpha">
<li>Komórki NIH 3T3 oznakowano krótkotrwałe za pomocą [2-3H] mannozy, a następnie poddano śledzeniu w kompletnym ośrodku. Po lizie komórek i filtracji przez Microcon YM30, oligosacharydy N-związane bogate w mannozę wydzielono z pozostałości poprzez inkubację z endo H.</li>
<li>Oporny na endo H materiał z pozostałości Microcon z punktu (a) poddano następnie inkubacji z N-glikozydazą F, a uwolnione oligosacharydy zmierzono za pomocą licznika scyntylacyjnego.</li>
<li>Pozostałości Microcon uzyskane jak w punkcie (a), przed traktowaniem endo H, ekstrahowano czterokrotnie chlorkowęglanem:metyloalkoholem:wodą w stosunku 10:10:3 w celu usunięcia prekursorowych glikolipidów, a materiał nieekstrahowany rozpuszczono w 1 M NaOH i zmierzono w liczniku scyntylacyjnym.</li>
<li>Dolicholo-oligosacharydy oczyszczono z ekstraktów z punktu (c) zgodnie z opisem w punkcie 1 i zmierzono w liczniku scyntylacyjnym.</li>
<li>Średnia z 3 eksperymentów dla procentu dolicholo-oligosacharydów (d) całkowitego cpm w pozostałości (c+d).</li>
</ol>
Przykładowe wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig1.jpg" alt="Wykres eksperymentu typu pulse-chase pokazujący szczyty glikanów w analizie chromatograficznej z oznakowanymi M5-M9." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Analiza typu pulse-chase całkowitych glikoprotein NIH 3T3 w komórkach nieleczonych oraz po inhibicji proteasomu. Po 1-godzinnym etapie pulsowania z [2-3H] uzyskano oczekiwany profil, w którym część prekursorów glukozylowanych pozostała (Glc2Man9GlcNAc2 (G2M9) oraz G1M9), ale większość znacznika występowała w gatunkach M9 i M8, przy czym ten drugi wynikał z usunięcia całej glukozy i jednego reszty mannozy (rycina 1 A). Nie wykryto wolnej mannozy ani innych małych prekursorów, co świadczy o dokładności oczyszczania. Po długim 8-godzinnym etapie chase zaobserwowano bardziej zaawansowane przycinanie do M7-6 oraz niewielką ilość M5, jednak głównymi gatunkami nadal były M9 i M8 (rycina 1 B). Gdy etap chase przeprowadzono w obecności inhibitora proteasomu (30 μM MG-132), zaobserwowano jedynie niewielkie gromadzenie się tych samych przyciętych gatunków (rycina 1 C).
<img src="/files/ftp_upload/1899/1899fig2.jpg" alt="Analiza puli glikoproteinów ASGPR H2a; wykresy porównują czasy inkubacji; zawierają inhibitor proteasomu MG-132." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Ilościowa analiza łańcuchów cukrowych substratu ERAD w porównaniu z całkowitą pulą glikoprotein. (A) W doświadczeniu podobnym do przedstawionego na rycinie 1, obliczono względne stężenia molowe poszczególnych gatunków oligosacharydów na podstawie zawartości mannozy. Przeliczono wartości cpm uzyskane dla każdego gatunku glikanu, a następnie wykreślono procent każdej frakcji względem sumy wszystkich frakcji w funkcji czasu inkubacji, jako średnią z dwóch eksperymentów. (B) Podobnie jak w (A), z tą różnicą, że analizowano glikany wydzielone z substratu ERAD ASGPR H2a po etapie znakowania i inkubacji trwającej do 4 h, w obecności lub w nieobecności inhibitora proteasomu MG-132. (C) Porównanie wartości po 4-godzinnej inkubacji w obecności MG-132 z eksperymentów (A) i (B) dla ASGPR H2a oraz puli glikoprotein. (D) Schemat procesów przycinania łańcuchów N-związanych cukrów w siateczce śródplazmatycznej. Procesy przycinania cukrów prowadzące do powstania form z 6-5 mannozami przyłączonymi do białek (R), które są kierowane do ERAD, w porównaniu z formami 9-8 mannozowymi, które opuszczają siateczkę i kierują się do aparatu Golgiego i dalej. Wyniki wskazują, że proces ERAD wiąże się z przycinaniem mannozy z N-glikanów, prowadzącym do powstania gatunków zawierających 5-6 reszt mannozy.

<ol><li>Parodi, A. J., Behrens, N. H., Leloir, L. F., Carminatti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polyprenol-bound+saccharides+as+intermediates+in+glycoprotein+synthesis+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of polyprenol-bound saccharides as intermediates in glycoprotein synthesis in liver.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3268-3272 (1972).</li>
<li>Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+%28ER%29+mannosidase+I+is+compartmentalized+and+required+for+N-glycan+trimming+to+Man5-6GlcNAc2+in+glycoprotein+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).</li>
<li>Frenkel, Z., Gregory, W., Kornfeld, S., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-associated+degradation+of+mammalian+glycoproteins+involves+sugar+chain+trimming+to+Man6-5GlcNAc2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-associated degradation of mammalian glycoproteins involves sugar chain trimming to Man6-5GlcNAc2.</a> J Biol Chem. 278 (36), 34119-34124 (2003).</li>
<li>Hosokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+endoplasmic+reticulum+%28ER%29+degradation+of+misfolded+Null+Hong+Kong+alpha1-antitrypsin+by+human+ER+mannosidase+I%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of endoplasmic reticulum (ER) degradation of misfolded Null Hong Kong alpha1-antitrypsin by human ER mannosidase I.</a> J Biol Chem. 278 (28), 26287-26294 (2003).</li>
<li>Jakob, C. A., Burda, P., Roth, J., Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+misfolded+endoplasmic+reticulum+glycoproteins+in+Saccharomyces+cerevisiae+is+determined+by+a+specific+oligosaccharide+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Degradation of misfolded endoplasmic reticulum glycoproteins in Saccharomyces cerevisiae is determined by a specific oligosaccharide structure.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1223-1233 (1998).</li>
<li>Tolchinsky, S., Yuk, M. H., Ayalon, M., Lodish, H. F., Lederkremer, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+versus+secreted+forms+of+human+asialoglycoprotein+receptor+subunits.+Role+of+a+juxtamembrane+pentapeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound versus secreted forms of human asialoglycoprotein receptor subunits. Role of a juxtamembrane pentapeptide.</a> J Biol Chem. 271 (24), 14496-14503 (1996).</li>
</ol>

Analiza pulse-chase glikanów w żywych komórkach z rozdzielaniem metodą HPLC zapewnia metodę badania dynamiki zmian strukturalnych oligosacharydów w całym cyklu życia glikoproteiny. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że takie zmiany uczestniczą w generowaniu sygnałów dla systemów fałdowania w ER, kontroli jakości oraz transportu wewnątrzkomórkowego 2-5. Metodę tę można zastosować nie tylko w odniesieniu do konkretnej, interesującej badacza glikoproteiny, ale również do analizy dynamiki struktury wszystkich gl...

<table><tbody><tr><td>kontroler systemu dozowania wielu rozpuszczalników 600E</td><td>Waters</td><td>WAT062710</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl LiChrosolv (stopnia gradientowego do chromatografii cieczowej)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.0003</td><td></td></tr><tr><td>Microcon Amicon Ultra 0,5 ml 30K lub Centricon ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC503024 lub 4208</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator 5301, w tym rotor kątowy stały 48 x 1,5 / 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5301 000.016</td><td></td></tr><tr><td>Dializowany F&amp;#8211;płodowe serum cielęce</td><td>Przemysł biotechnologiczny</td><td>04-011-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;zmodyfikowane podłoże Eagle&amp;rsquo;pożywka Medium</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>41965039</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;zmodyfikowane podłoże Eagle&amp;rsquo;podłoże pozbawione glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1084180250</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Endo Hf (1 000 000 jednostek/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>p0703S</td><td></td></tr><tr><td>F&amp;#8211;płodowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>zbieracz frakcji Frac-100</td><td>Amersham</td><td>18-1000-77</td><td></td></tr><tr><td>Systemy do pomiaru z wykorzystaniem migotania w cieczach LS 6500</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>510720</td><td></td></tr><tr><td>Mannoza, D-[2-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]- (aktywność właściwa: 15-30 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET570A</td><td></td></tr><tr><td>N-karbobenzoksylo-leucylo-leucylo-leucinal (MG-132)</td><td>Calbiochem</td><td>474790</td><td></td></tr><tr><td>N-glikozydaza F (1000 jednostek/ml)</td><td>Grupa Roche</td><td>11365177</td><td></td></tr><tr><td>N-oktyloglukozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3757</td><td></td></tr><tr><td>komórki NIH 3T3</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Flour</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6013199</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu fosforowego (49–51%, do HPLC)</td><td>Fluka</td><td>79607</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>kulki Protein A-Sepharose</td><td>Repligen</td><td>IPA300</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-H2 karboksyterminalne &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu (100mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Spherisorb NH2, 5 &amp;mu;m, 4,6 x 250 mm</td><td>Waters</td><td>PSS831115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>procesory ultradźwiękowe Vibra-Cell VCX 750</td><td>Sonics and Materials, Inc.</td><td>690-003</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor A:&lt;/strong&gt; 1% Triton X-100, 0,5% m/v deoksycholan sodu, koktajl inhibitorów proteaz 2% v/v w PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor B:&lt;/strong&gt; 0,5% w/v SDS, koktajl inhibitorów proteaz 2% v/v w PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor C:&lt;/strong&gt; Bufor reakcyjny N-glikozydazy F: 200 mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 8,0, 4 mM EDTA, 1,5% N-octylo-glukozyd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>linie komórkowe NIH 3T3 stabilnie ekspresujące H2a &lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor D:&lt;/strong&gt; 0,5% Triton X-100, 0,25% m/v deoksycholan sodu, 0,5% m/v SDS, koktajl inhibitorów proteaz 2% v/v w PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Bufor E:&lt;/strong&gt; 0,5% m/v SDS, 1% v/v 2-merkaptoetanolu&amp;#8211;etanol, koktajl inhibitorów proteaz 2% v/v w PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza typu pulse-chase łańcuchów cukrowych wiązanych glikozydowo do azotu (n-glikanów) w glikoproteinach komórek ssaków

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Przyłączanie Glc3Man9GlcNAc2prekursor oligosacharydu do nowo powstających polipeptydów w ER jest powszechną modyfikacją białek wydzielniczych. Choć modyfikacja ta była wiązana z kilkoma procesami biologicznymi, wyłaniają się kolejne aspekty jej funkcji, a niedawne dowody wskazują na jej rolę w produkcji sygnałów dla kontroli jakości i transportu glikoprotein. W związku z tym zjawiska związane z glikanami N-zależnymi i ich przetwarzaniem są intensywnie badane. Metody opracowane niedawno do analiz proteomicznych znacznie poprawiły charakterystykę glikanów N-zależnych w glikoproteinach. Niemniej jednak nie dają one wglądu w dynamikę zaangażowanego przetwarzania łańcucha cukrowego. W tym celu stosuje się protokoły znakowania i analizy pulse-chase, które są zazwyczaj złożone i dają bardzo niskie wydajności. Opisujemy tutaj prostą metodę izolacji i analizy metabolicznie znakowanych oligosacharydów N-zależnych. Protokół opiera się na znakowaniu komórek za pomocą [2-3mannozą, denaturującą lizę i enzymatyczne uwalnianie oligosacharydów albo z konkretnie immunoprecypitowanego białka docelowego, albo z ogólnej puli glikoprotein poprzez sekwencyjne traktowanie endo H i N-glikozydazą F, a następnie filtrację molekularną (Amicon). W tej metodzie wyizolowane oligosacharydy służą jako materiał do analizy HPLC, która pozwala na rozróżnienie różnych struktur glikanów w zależności od liczby składających je jednostek monosacharydowych, z rozdzielczością pojedynczego monosacharydu. Stosując tę metodę, byliśmy w stanie zbadać profile N-glikanów bogatych w mannozę w całkowitych glikoproteinach komórkowych po eksperymencie pulse-chase w warunkach normalnych oraz w warunkach inhibicji proteasomów. Profile te porównano z profilami uzyskanymi z immunoprecypitowanego substratu degradacji związanej z ER (ERAD). Nasze wyniki sugerują, że większość glikoprotein komórkowych NIH 3T3 jest stosunkowo stabilna i że większość ich oligosacharydów jest przycinana do Man9-8GlcNAc2W przeciwieństwie do nich, niestabilne substraty ERAD są przycinane do Man6-5GlcNAc2a glikoproteiny zawierające te gatunki kumulują się po zahamowaniu degradacji proteasomalnej.

Opisujemy metodę analizy zmian w glikanach typu N w początkowej fazie życia glikoprotein po ich biosyntezie w komórkach ssaków. Jest to realizowane poprzez analizę pulse-chase metabolicznie znakowanych glikanów, ich enzymatyczne uwalnianie z glikoprotein oraz badanie za pomocą HPLC.

Analiza typu pulse-chase łańcuchów cukrowych wiązanych glikozydowo do azotu (N-glikanów) w glikoproteinach komórek ssaków

Przyłączenie prekursorowego oligosacharydu Glc3Man9GlcNAc2 do powstających polipeptydów w retikulum endoplazmatycznym (ER) jest powszechną modyfikacją białek wydzielniczych. Chociaż ...

Analiza niepowiązanych łańcuchów cukrowych w glikoproteinach rozpoczyna się od znakowania glikanów i komórek trytylowanym mannozą. Naczynie do inkubacji impulsowej (pulse) jest chłodzone w lodzie, podczas gdy naczynie do inkubacji pogoni (chase) jest inkubowane bez znacznika przez wymagany okres pogoni. Następnie próbki są lizowane, a interesująca glikoproteina jest immunoczyszczona, denaturowana, a jej glikany są uwalniane enzymatycznie.Oligosacharydy są następnie oczyszczane za pomocą filtracji molekularnej, która oddziela je od białek i innych zanieczyszczeń o masie powyżej 30 kilodaltonów. Następnie glikany są rozdzielane metodą HPLC. Ilość każdej formy glikanu określa się poprzez pomiar intensywności sygnału promieniotwórczego w każdej wyeluowanej frakcji.Witam, nazywam się Edward Azo i pochodzę z laboratorium Hi Geraldo Letter Kremer w Katedrze Badań nad Komórką i Immunologii na Uniwersytecie w Tel Awiwie. Reprezentuję również Gerardo Letter Kremer Slab. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i analizy metabolicznie znakowanych i powiązanych oligosacharydów.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania dynamiki przetwarzania łańcuchów cukrowych zarówno dla całkowitych pul glikoprotein komórkowych, jak i dla poszczególnych glikoprotein. Dobrze, zatem zaczynajmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć komórek NIH 3T3 hodowanych przez noc w jednej szalce o średnicy 90 mm.W przypadku każdej próbki hodowla powinna być subkonfluenta, aby doprowadzić do głodzenia komórek z glukozy. Należy przygotować świeże podłoże bez glukozy o stężeniu 2x, uzupełnione o 20% dializowanej FCS i 8 mM pirogronianu sodu. Jedną objętość pożądanej ilości podłoża 2x należy rozcieńczyć jedną objętością wody dejonizowanej. Podłoże należy uprzednio ogrzać, a następnie inkubować każdą próbkę komórek w 5 mL świeżego, ogrzanego podłoża przez 5 do 15 minut. Jeśli wymagany jest czas pogoni dłuższy niż 12 godzin, z komórkami należy obchodzić się w warunkach sterylnych.Po zakończeniu okresu inkubacji oznakuj płytki odpowiadające próbkom z fazy pulse i chase. Aby znakować N-glikany do analizy glikoprotein za pomocą immunoprecypitacji, zastąp pożywkę do głodzenia jednym mililitrem podgrzanej pożywki bezglukozowej uzupełnionej o 400 $\mu\text{Ci/mL}$ mannozy znakowanej tryciem. Do znakowania i analizy całkowitej zawartości glikoprotein zastosuj stężenie 65 $\mu\text{Ci/mL}$.Po wymianie pożywki głodzeniowej inkubować komórki w standardowych warunkach hodowli tkankowej przez jedną godzinę. Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji usunąć pożywkę znakującą ze wszystkich próbek. Ostrożnie dodać dwa mililitry PBS o temperaturze 4 °C do próbek przeznaczonych do impulsu i umieścić je w lodzie. Próbki te określa się mianem impulsów.Użyć 2 mL uprzednio ogrzanego, standardowego, pełnego medium hodowlanego. Przepłukać próbki chase trzy razy. Następnie dodać do komórek 5 mL uprzednio ogrzanego, standardowego medium.Umieść próbki w fazie chase w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C na wybrany czas trwania fazy chase. Podczas inkubacji próbek w fazie chase, wypłucz próbki w fazie pulse, które pozostawiono w lodzie, trzy razy za pomocą 2 mL lodowatego PBS. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki z płytki.Przenieś uwolnione komórki do probówki EOR o pojemności 2 ml zawierającej 2 ml PBS. Wirowarkuj komórki z prędkością 16 000 g przez 6–10 sekund, aby oddzielić nadsącz, a następnie zamroź osad komórkowy w temperaturze -80°C. Po zakończeniu inkubacji próbek chase należy je wypłukać.Wirować i przechowywać w sposób przedstawiony dla próbek impulsowych. Po przygotowaniu do lizy komórek, wyjąć je z zamrażarki. W przypadku analizy IP lizować komórki poprzez dodanie 300 µL buforu.Próbki krótko wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie inkubować przez 20 minut na lodzie. Do analizy próbek całkowitych glikoprotein dodać 300 µL buforu B. Inkubować komórki przez 20 minut na lodzie, a następnie poddać sonikacji czterokrotnie, po 10 sekund każdorazowo przy maksymalnej amplitudzie. Następnie gotować próbki przez pięć minut.Na koniec wszystkie lizaty odwiruj przy 16 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś nadsącz do nowej probówki EOR, a osad odrzuć. Przejdź do etapu IP, aby zbadać białko docelowe pod kątem immunoprecypitacji glikoproteiny H2A przedstawionej w niniejszej procedurze.Do supernatantu z lizowanych komórek dodać 20 µL na próbkę białka A agarose oraz 3 µL na próbkę króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-H2A. Inkubować próbki od 4 do 16 godzin w temperaturze 4 °C, stale mieszając poprzez powolną rotację. Po zakończeniu inkubacji odwirować kuleczki i ostrożnie usunąć supernatat za pomocą odsysacza, a następnie przepłukać kuleczki czterokrotnie, dodając 500 µL buforu TEA.Odwiruj kulki i usuń nadsącz, aby uwolnić związane białka z kulek. Do osadu z kulek dodaj 10 µL buforu denaturującego z zestawu endo H i gotuj próbki przez pięć minut. Odwiruj kulki i przenieś nadsącz do nowej probówki EOR.Białka ellu są teraz gotowe do deglikozylacji. Glikany są uwalniane zarówno z próbek IP, jak i z próbek białka całkowitego przy użyciu enzymu endo H. W przypadku próbek IP do każdej próbki należy dodać 0,5 µL enzymu endo H oraz 10 µL dwukrotnego buforu reakcyjnego endo H. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez trzy godziny.W celu wyizolowania całkowitych glikoprotein, nanieś nadsącz z lizatów komórkowych na filtr MicroCon z granicą odcięcia 30 kilodalton. Przemyj całkowity ekstrakt białkowy trzykrotnie 100 µL buforu E poprzez powtarzanie wirowania przy 14 000 G przez trzy minuty. Następnie do filtra MicroCon, w którym pozostały przemyte białka, dodaj 3 µL 10 x buforu do reakcji endo H oraz 1,5 µL enzymu endo H i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 37 °C razem z próbkami IP.Po zakończeniu trzystannej inkubacji próbkę IP rozcieńczyć pięciokrotnie wodą dejonizowaną, nanieść na nowy filtr MicroCon i wirować przy 14 000 Gs przez trzy minuty. Następnie wypłukać zarówno próbki IP, jak i białka całkowitego, dodając 50 µL wody dejonizowanej i wirować próbki; powtórzyć tę procedurę jeszcze dwa razy. Jeśli jest to wymagane, zachować filtraty zawierające odszczepione glikany w probówkach z endo H. Glikoproteiny oporne na działanie endo H inkubować następnie z 200 mU N-glikosydazy F w 15 µL buforu C w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.Elucję wodą dejonizowaną przeprowadza się w sposób przedstawiony na nagraniu. Próbki należy całkowicie wysuszyć za pomocą koncentratora próżniowego z podgrzewaniem do 45 °C w celu przyspieszenia procesu. Wysuszone osady należy zawiesić ponownie w 12 µL rozpuszczalnika HPLC, a następnie nanieść próbki na kolumnę SPHE lub amino zainstalowaną w urządzeniu HPLC.Próbki należy poddać analizie zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Dla każdego przebiegu próbki należy zebrać 48 frakcji. Do pomiaru wartości CPM zebranych frakcji należy użyć licznika scyntylacyjnego, a następnie przedstawić odczyty CPM w funkcji numeru frakcji.Oblicz procent pozostałości mannozy dla wszystkich rodzajów glikanów zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy łańcuchów cukrowych całkowitych glikoprotein z próbki poddanej jednogodzinnemu znakowaniu impulsowemu. Odczyt CPM frakcji HPLC przedstawiono jako funkcję numeru frakcji na wynikowym profilu.Każdy szczyt reprezentuje konkretny gatunek glikanu zidentyfikowany za pomocą analizy HPLC ze znanymi standardami glikanów. Dla każdego gatunku glikanu wykreślono jego procent molowy w stosunku do całkowitej puli glikanów jako funkcję czasu pogoni (chase time). Przedstawiona tutaj analiza dotyczy konkretnego błędnie sfałdowanego glikoproteiny wyizolowanej metodą immunoprecypitacji z próbki traktowanej inhibitorem proteasomów MG 1 32.Przycięte formy glikanów M₅₆ kumulują się podczas okresu pogoni (chase period), co prowadzi do wniosku, że oligosacharydy znajdujące się na błędnie sfałdowanych białkach ulegają intensywnemu przycinaniu mannozy przed degradacją. Stoi to w sprzeczności z oligosacharydami w całkowitej puli glikoprotein z próbek traktowanych w ten sam sposób. W tym przypadku M₉₈ pozostają głównymi formami glikanów podczas pogoni, przy jedynie niewielkim wzroście ilości M₅₆. Prowadzi to do wniosku, że tylko niewielka frakcja całkowitej puli glikoprotein jest kierowana do ERAD (degradacji białek związanej z retikulum endoplazmatycznym).Skrócony rad. Jak szczegółowo wyjaśniono w towarzyszącym protokole pisemnym, zaprezentowaliśmy właśnie sposób wykorzystania połączenia pulsowania w żywych komórkach i analizy HPLC w celu śledzenia dynamiki składu niepołączonych oligosacharydów podczas cyklu życia glikoproteiny. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o unikaniu zanieczyszczenia próbek z fazy chase śladami monomerów radioaktywnych, co doprowadziłoby do niepożądanego znakowania glikanów podczas okresów chase w trakcie rozdziału według wielkości.Ważne jest również dostosowanie układu HPLC do stałego ciśnienia, aby zapewnić spójność frakcjonowania glikanów. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

pulse-chase-analysis-n-linked-sugar-chains-from-glycoproteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza puls-chase łańcuchów cukrów N-połączonych z glikoproteinami w komórkach ssaków

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Opisujemy zmodyfikowaną metodę izolacji frakcji błonowej z komórek ludzkich i przygotowania próbki do wykrywania N-glikozylacji SCAP i białka całkowitego za pomocą western blot. Ponadto wprowadzamy metodę znakowania GFP w celu monitorowania transportu SCAP za pomocą mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być stosowany w zwykłych laboratoriach biologicznych.

Analiza N-glikozylacji SCAP i handlu w komórkach ludzkich

Kwas sjalowy to typowa jednostka monosacharydowa występująca w glikokoniugatach. Bierze udział w wielu interakcjach molekularnych i komórkowych. W artykule przedstawiono metodę modyfikacji ekspresji kwasu sjalowego na powierzchni komórki za pomocą glikoinżynierii metabolicznej z pochodnymi N-acetylmannosaminy.

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Tutaj opisujemy protokół dla ogólnej metody pościgu za impulsami, która pozwala na analizę kinetyczną fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach.

Analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Poznaj metodę analizy impulsowej N-glikanów w glikoproteinach komórek ssaków z wykorzystaniem chromatografii HPLC. Technika ta umożliwia śledzenie dynamicznych zmian w biosyntezie glikoprotein.

Analiza typu pulse-chase łańcuchów cukrowych wiązanych glikozydowo do azotu (N-glikanów) w glikoproteinach komórek ssaków

Przeglądaj więcej filmów