Analiza typu pulse-chase łańcuchów cukrowych wiązanych glikozydowo do azotu (N-glikanów) w glikoproteinach komórek ssaków

Analiza niepowiązanych łańcuchów cukrowych w glikoproteinach rozpoczyna się od znakowania glikanów i komórek trytylowanym mannozą. Naczynie do inkubacji impulsowej (pulse) jest chłodzone w lodzie, podczas gdy naczynie do inkubacji pogoni (chase) jest inkubowane bez znacznika przez wymagany okres pogoni. Następnie próbki są lizowane, a interesująca glikoproteina jest immunoczyszczona, denaturowana, a jej glikany są uwalniane enzymatycznie.

Oligosacharydy są następnie oczyszczane za pomocą filtracji molekularnej, która oddziela je od białek i innych zanieczyszczeń o masie powyżej 30 kilodaltonów. Następnie glikany są rozdzielane metodą HPLC. Ilość każdej formy glikanu określa się poprzez pomiar intensywności sygnału promieniotwórczego w każdej wyeluowanej frakcji.

Witam, nazywam się Edward Azo i pochodzę z laboratorium Hi Geraldo Letter Kremer w Katedrze Badań nad Komórką i Immunologii na Uniwersytecie w Tel Awiwie. Reprezentuję również Gerardo Letter Kremer Slab. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i analizy metabolicznie znakowanych i powiązanych oligosacharydów.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania dynamiki przetwarzania łańcuchów cukrowych zarówno dla całkowitych pul glikoprotein komórkowych, jak i dla poszczególnych glikoprotein. Dobrze, zatem zaczynajmy. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć komórek NIH 3T3 hodowanych przez noc w jednej szalce o średnicy 90 mm.

W przypadku każdej próbki hodowla powinna być subkonfluenta, aby doprowadzić do głodzenia komórek z glukozy. Należy przygotować świeże podłoże bez glukozy o stężeniu 2x, uzupełnione o 20% dializowanej FCS i 8 mM pirogronianu sodu. Jedną objętość pożądanej ilości podłoża 2x należy rozcieńczyć jedną objętością wody dejonizowanej. Podłoże należy uprzednio ogrzać, a następnie inkubować każdą próbkę komórek w 5 mL świeżego, ogrzanego podłoża przez 5 do 15 minut. Jeśli wymagany jest czas pogoni dłuższy niż 12 godzin, z komórkami należy obchodzić się w warunkach sterylnych.

Po zakończeniu okresu inkubacji oznakuj płytki odpowiadające próbkom z fazy pulse i chase. Aby znakować N-glikany do analizy glikoprotein za pomocą immunoprecypitacji, zastąp pożywkę do głodzenia jednym mililitrem podgrzanej pożywki bezglukozowej uzupełnionej o 400 $\mu\text{Ci/mL}$ mannozy znakowanej tryciem. Do znakowania i analizy całkowitej zawartości glikoprotein zastosuj stężenie 65 $\mu\text{Ci/mL}$.

Po wymianie pożywki głodzeniowej inkubować komórki w standardowych warunkach hodowli tkankowej przez jedną godzinę. Po zakończeniu jednogodzinnej inkubacji usunąć pożywkę znakującą ze wszystkich próbek. Ostrożnie dodać dwa mililitry PBS o temperaturze 4 °C do próbek przeznaczonych do impulsu i umieścić je w lodzie. Próbki te określa się mianem impulsów.

Użyć 2 mL uprzednio ogrzanego, standardowego, pełnego medium hodowlanego. Przepłukać próbki chase trzy razy. Następnie dodać do komórek 5 mL uprzednio ogrzanego, standardowego medium.

Umieść próbki w fazie chase w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C na wybrany czas trwania fazy chase. Podczas inkubacji próbek w fazie chase, wypłucz próbki w fazie pulse, które pozostawiono w lodzie, trzy razy za pomocą 2 mL lodowatego PBS. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki z płytki.

Przenieś uwolnione komórki do probówki EOR o pojemności 2 ml zawierającej 2 ml PBS. Wirowarkuj komórki z prędkością 16 000 g przez 6–10 sekund, aby oddzielić nadsącz, a następnie zamroź osad komórkowy w temperaturze -80°C. Po zakończeniu inkubacji próbek chase należy je wypłukać.

Wirować i przechowywać w sposób przedstawiony dla próbek impulsowych. Po przygotowaniu do lizy komórek, wyjąć je z zamrażarki. W przypadku analizy IP lizować komórki poprzez dodanie 300 µL buforu.

Próbki krótko wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie inkubować przez 20 minut na lodzie. Do analizy próbek całkowitych glikoprotein dodać 300 µL buforu B. Inkubować komórki przez 20 minut na lodzie, a następnie poddać sonikacji czterokrotnie, po 10 sekund każdorazowo przy maksymalnej amplitudzie. Następnie gotować próbki przez pięć minut.

Na koniec wszystkie lizaty odwiruj przy 16 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś nadsącz do nowej probówki EOR, a osad odrzuć. Przejdź do etapu IP, aby zbadać białko docelowe pod kątem immunoprecypitacji glikoproteiny H2A przedstawionej w niniejszej procedurze.

Do supernatantu z lizowanych komórek dodać 20 µL na próbkę białka A agarose oraz 3 µL na próbkę króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-H2A. Inkubować próbki od 4 do 16 godzin w temperaturze 4 °C, stale mieszając poprzez powolną rotację. Po zakończeniu inkubacji odwirować kuleczki i ostrożnie usunąć supernatat za pomocą odsysacza, a następnie przepłukać kuleczki czterokrotnie, dodając 500 µL buforu TEA.

Odwiruj kulki i usuń nadsącz, aby uwolnić związane białka z kulek. Do osadu z kulek dodaj 10 µL buforu denaturującego z zestawu endo H i gotuj próbki przez pięć minut. Odwiruj kulki i przenieś nadsącz do nowej probówki EOR.

Białka ellu są teraz gotowe do deglikozylacji. Glikany są uwalniane zarówno z próbek IP, jak i z próbek białka całkowitego przy użyciu enzymu endo H. W przypadku próbek IP do każdej próbki należy dodać 0,5 µL enzymu endo H oraz 10 µL dwukrotnego buforu reakcyjnego endo H. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez trzy godziny.

W celu wyizolowania całkowitych glikoprotein, nanieś nadsącz z lizatów komórkowych na filtr MicroCon z granicą odcięcia 30 kilodalton. Przemyj całkowity ekstrakt białkowy trzykrotnie 100 µL buforu E poprzez powtarzanie wirowania przy 14 000 G przez trzy minuty. Następnie do filtra MicroCon, w którym pozostały przemyte białka, dodaj 3 µL 10 x buforu do reakcji endo H oraz 1,5 µL enzymu endo H i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze 37 °C razem z próbkami IP.

Po zakończeniu trzystannej inkubacji próbkę IP rozcieńczyć pięciokrotnie wodą dejonizowaną, nanieść na nowy filtr MicroCon i wirować przy 14 000 Gs przez trzy minuty. Następnie wypłukać zarówno próbki IP, jak i białka całkowitego, dodając 50 µL wody dejonizowanej i wirować próbki; powtórzyć tę procedurę jeszcze dwa razy. Jeśli jest to wymagane, zachować filtraty zawierające odszczepione glikany w probówkach z endo H. Glikoproteiny oporne na działanie endo H inkubować następnie z 200 mU N-glikosydazy F w 15 µL buforu C w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.

Elucję wodą dejonizowaną przeprowadza się w sposób przedstawiony na nagraniu. Próbki należy całkowicie wysuszyć za pomocą koncentratora próżniowego z podgrzewaniem do 45 °C w celu przyspieszenia procesu. Wysuszone osady należy zawiesić ponownie w 12 µL rozpuszczalnika HPLC, a następnie nanieść próbki na kolumnę SPHE lub amino zainstalowaną w urządzeniu HPLC.

Próbki należy poddać analizie zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Dla każdego przebiegu próbki należy zebrać 48 frakcji. Do pomiaru wartości CPM zebranych frakcji należy użyć licznika scyntylacyjnego, a następnie przedstawić odczyty CPM w funkcji numeru frakcji.

Oblicz procent pozostałości mannozy dla wszystkich rodzajów glikanów zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy łańcuchów cukrowych całkowitych glikoprotein z próbki poddanej jednogodzinnemu znakowaniu impulsowemu. Odczyt CPM frakcji HPLC przedstawiono jako funkcję numeru frakcji na wynikowym profilu.

Każdy szczyt reprezentuje konkretny gatunek glikanu zidentyfikowany za pomocą analizy HPLC ze znanymi standardami glikanów. Dla każdego gatunku glikanu wykreślono jego procent molowy w stosunku do całkowitej puli glikanów jako funkcję czasu pogoni (chase time). Przedstawiona tutaj analiza dotyczy konkretnego błędnie sfałdowanego glikoproteiny wyizolowanej metodą immunoprecypitacji z próbki traktowanej inhibitorem proteasomów MG 1 32.

Przycięte formy glikanów M₅₆ kumulują się podczas okresu pogoni (chase period), co prowadzi do wniosku, że oligosacharydy znajdujące się na błędnie sfałdowanych białkach ulegają intensywnemu przycinaniu mannozy przed degradacją. Stoi to w sprzeczności z oligosacharydami w całkowitej puli glikoprotein z próbek traktowanych w ten sam sposób. W tym przypadku M₉₈ pozostają głównymi formami glikanów podczas pogoni, przy jedynie niewielkim wzroście ilości M₅₆. Prowadzi to do wniosku, że tylko niewielka frakcja całkowitej puli glikoprotein jest kierowana do ERAD (degradacji białek związanej z retikulum endoplazmatycznym).

Skrócony rad. Jak szczegółowo wyjaśniono w towarzyszącym protokole pisemnym, zaprezentowaliśmy właśnie sposób wykorzystania połączenia pulsowania w żywych komórkach i analizy HPLC w celu śledzenia dynamiki składu niepołączonych oligosacharydów podczas cyklu życia glikoproteiny. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o unikaniu zanieczyszczenia próbek z fazy chase śladami monomerów radioaktywnych, co doprowadziłoby do niepożądanego znakowania glikanów podczas okresów chase w trakcie rozdziału według wielkości.

Ważne jest również dostosowanie układu HPLC do stałego ciśnienia, aby zapewnić spójność frakcjonowania glikanów. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.