Name: SDS-PAGE/Wykrywanie immunoblot multimerów Aβ w homogenatach tkanki korowej człowieka za pomocą pobierania antygenu i epitopu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj metodę wykrywania multimerów Aβ w tkance korowej człowieka za pomocą SDS-PAGE i immunoblotingu z odzyskiwaniem antygenu. Ta technika umożliwia badanie patologii choroby Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdeczne podziękowania kierujemy do Elaine Pranski oraz Carolyn Suwyn za doskonałą pomoc techniczną, a także do Harry'ego LeVine'a III, M. Paula Murphy'ego i Marli Gearing za ważne rozmowy. Finansowanie zapewniły granty RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, fundacja Woodruff Foundation oraz Komitet Badawczy Uniwersytetu Emory.

Część 1: Przygotowanie klarownych homogenatów tkankowych
<ol>
 <li>Poddać homogenizacji w homogenizatorze Douncea nieutrwaloną tkankę korową w czterokrotnej objętości lodowatego buforu (0,1M roztwór soli fosforanowo-buforowanej [bezwapniowy i bezmagnezowy] z dodatkiem 2x koktajlu inhibitorów proteaz [Santa Cruz]), wykonując około 30 równomiernych ruchów tłokiem (np. dodać 400μl buforu do 100mg tkanki). </li>
 <li>Wirować homogenaty przez 5 minut przy 3,000g (4°C). Ostrożnie zebrać klarowne nadosady i przechowywać alikwoty tych ekstraktów w temperaturze -80°C do momentu użycia. </li>
 <li>Oznaczyć całkowite stężenie białka (μg/μl) w klarownych homogenatach, stosując metodę kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta (ThermoFisher).</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie próbek do SDS-PAGE
<ol>
 <li>W przypadku żelu Tricine 10-20% z 10 studzienkami (Invitrogen), maksymalna objętość, jaką można nałożyć do jednej studzienki, wynosi ~25μl. Całkowita objętość obejmuje 2x bufor do próbek SDS oraz 10x środek redukujący, zatem maksymalna objętość oczyszczonego homogenatu, jaką można nałożyć do jednej studzienki, to 10μl. Oczyszczone homogenaty kory 20% (w/v) powinny mieć całkowite stężenie białka powyżej 5 μg/μl, co pozwala na nałożenie 50μg całkowitego białka na studzienkę. Próbki o stężeniu białka poniżej 5mg/ml będą wymagały nałożenia mniejszej ilości całkowitego białka na studzienkę. Niemniej jednak, wysokie poziomy białka są optymalne dla wykrywania monomerów i agregatów Aβ (optymalna ilość to 50-60μg całkowitego białka). Zawsze należy nakładać taką samą ilość całkowitego białka do każdej studzienki.</li>
 <li>Dla każdego żelu należy nałożyć do co najmniej jednej studzienki 10μl markera masy cząsteczkowej, takiego jak SeeBlue Plus2 (Invitrogen). Jako kontrolę pozytywną, w innej studzience należy przeprowadzić analizę 10-100ng syntetycznego peptydu Aβ40 lub Aβ42 (rozcieńczonego w 1xPBS).</li>
 <li>Mieszaniny reakcyjne należy przygotować w lodzie, używając świeżo rozmrożonych, oczyszczonych homogenatów. Probówki należy wstrząsnąć w wortexie przez 5-10 sekund, podgrzać w bloku grzejnym w temperaturze 100°C przez 5 minut, a następnie szybko odwirować wszystkie próbki, aby usunąć kondensację z zakrętki.</li>
</ol>
Część 3: Elektroforeza w żelu SDS-PAGE
<ol>
 <li> a wymieszane w wortexie próbki nanieś na żel Tricine 10-20% w komorze XCell Sure Lock Mini-Cell Gelbox, stosując bufor do elektroforezy Tricine SDS, zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen),</li>
 <li>elektroforezę prowadź przy stałym napięciu 125V przez około 90 minut. Kontynuuj proces, aż prążek markera 4KDa znajdzie się około 1 cm od dolnej krawędzi żelu.</li>
</ol>
Część 4: Przenoszenie białek z żeli na membrany
<ol>
 <li>Ostrożnie wyjmij żele z plastikowej kasety i złóż kanapkę transferową wewnątrz modułu XCell II Blot zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen). Namocz wcześniej podkładki do transferu oraz membrany nitrocelulozowe 0.2μm w buforze transferowym Tris-Glycine (20% methanol), a następnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z podkładek lub z układu papieru filtrowanego/membrany. </li>
 <li>W komorze XCell Gelbox napełnij wewnętrzną komorę buforem transferowym, a zewnętrzną komorę dIH2O (długotrwała ekspozycja na methanol może prowadzić do zużycia plastikowej komory żelowej).</li>
 <li>Przeprowadź transfer przez 2-3 godziny przy stałym natężeniu prądu 25mA. </li>
 <li>Po zakończeniu transferu rozdziel kanapkę, a żele umieść w dIH2O, natomiast membrany w 1xPBS, oba rodzaje próbek w kwadratowych plastikowych szalkach Petriego (lub innym odpowiednim pojemniku).</li>
 <li>Aby zwizualizować wydajność transferu białek, żele można barwić barwnikiem Simply Blue SafeStain (Invitrogen), a membrany barwnikiem Ponceau S Red (Sigma Aldrich), oba zgodnie z instrukcjami producenta. Barwienie to nie zakłóci procesu immunoblottingu. Jeśli barwienie wykaże niską wydajność transferu białek, należy zmodyfikować czas transferu określony w kroku 3.</li>
</ol>
Część 5. Odmaskowywanie epitopów antygenowych i immunoblotting
<ol>
 <li>Przywracanie antygenów jest istotnym etapem odsłaniania epitopów Aβ na błonie w celu umożliwienia wiązania przeciwciał podczas immunoblottingu. Wystarczy dowolny parowar, kuchenka mikrofalowa lub łaźnia wodna utrzymująca stałą temperaturę 100°C. Aby przeprowadzić przywracanie antygenów w parowarze, należy zgrzać termicznie błonę w wytrzymałej plastikowej torebce Kapak wypełnionej 1xPBS w temperaturze pokojowej. Torebkę należy ułożyć płasko w wstępnie podgrzanym parowarze; gdy torebka zacznie się rozszerzać, inkubować przez dodatkowe 15 minut. Przed wyjęciem błony z torebki należy pozwolić jej powoli ostygnąć, aby zapobiec nadmiernemu marszczeniu.</li>
 <li>W temperaturze pokojowej ostrożnie wyjąć błonę z torebki do parowania i płukać ją przez 5 minut w 1xPBS, a następnie przez 5 minut w TBS-T (bufor solny Tris, pH 8.0 z 0.05% Tween-20 [Sigma]) na wytrząsarce orbitalnej. Inkubować błonę w roztworze blokującym (2.5% odtłuszczonego mleka w TBS-T) przez jedną godzinę przy wytrząsaniu. Bez płukania przenieść błonę do naczynia lub plastikowej torebki zawierającej przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym (6E10 w rozcieńczeniu 1:1,000 [1μg/ml] lub 1:5,000 [0.2μg/ml], Covance), unikając pęcherzyków powietrza. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie przez 24-48 godzin przy wytrząsaniu w 4°C (dłuższa inkubacja może zapewnić lepszy sygnał).</li>
 <li>Płukać błonę przez 30 minut w TBS-T (jedno szybkie płukanie, a następnie 3 x 10-minutowe płukania).</li>
 <li>Inkubować błonę w przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z HRP (Amersham ECL sheep anti-mouse, GE Healthcare), rozcieńczonych 1:10,000 w roztworze blokującym, przez 90 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Płukać błonę przez 30 minut w TBS-T (jedno szybkie płukanie, a następnie 3 x 10-minutowe płukania).</li>
 <li>Na wytrząsarce inkubować błonę w świeżo przygotowanym odczynniku do elektrochemiluminescencji SuperSignal West Pico (ThermoFisher) przez 5 minut, odsączyć nadmiar odczynnika na bezpyłowym papierze filtrującym i umieścić błonę w kasecie do filmu, pomiędzy plastikowymi foliami ochronnymi. W razie potrzeby odsączyć dodatkowy odczynnik SuperSignal za pomocą bezpyłowych chusteczek Kimwipes.</li>
 <li>Naświetlać na film Kodak Biomax MR w odstępach od 30 sekund do 30 minut i wywołać w wywoływaczu do filmów. Po 5 minutach prążki monomerów Aβ będą prawdopodobnie nasycone.</li>
 <li>Błony można poddać procesowi strippingu (po płukaniu w TBS-T) poprzez wytrząsanie w buforze do strippingu Restore Plus przez 30 minut w temperaturze pokojowej i w razie potrzeby ponownie inkubować z dodatkowymi przeciwciałami.</li>
</ol>
Część 6: Reprezentatywny immunoblot: 
<img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1a.jpg" alt="Elektroforeza żelowa SDS-PAGE dla analizy białek w próbkach z chorobą Alzheimera i DLB." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1b.jpg" alt="Wynik elektroforezy, prążki białkowe dla AD, DLB, ND, Aβ40; analiza białek w badaniach nad chorobą Alzheimera." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1b"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1c.jpg" alt="Analiza Western blot dla ekspresji białek w próbkach AD, DLB; zawiera marker kDa, prążki APP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1c"> Ryciny 1a-c. Klarowane homogenaty zawierające 50μg całkowitego białka od 7 ludzkich dawców zostały przeanalizowane pod kątem obecności multimerów Aβ oraz APP. Immunoblotting z użyciem przeciwciała 6E10 ujawnił monomery, dimery, trimery, tetramery Aβ oraz APP (górny prążek) we wszystkich przypadkach choroby Alzheimera, a także liczne multimery Aβ o wyższej masie cząsteczkowej w 2 przypadkach AD. Syntetyczne Aβ40 potwierdziło tożsamość prążków o niższej masie cząsteczkowej. AD: choroba Alzheimera, DLB: otępienie z ciałami Lewy’ego, ND: człowiek bez otępienia. (a) 30-minutowa ekspozycja filmu, (b) 5-minutowa ekspozycja filmu, (c) 30-sekundowa ekspozycja filmu.

<ol><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebral+proteopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+amyloid%2C+and+Alzheimer%27s+disease%3A+a+perspective+in+honor%5BTitle%5D)+AND+%22of+Carl+Cotman.+Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li>
<li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li>
<li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li>
<li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li>
</ol>

Pomimo znaczenia agregacji Aβ w patogenezie choroby Alzheimera1,4,5, niewiele badań opisało lub określiło ilościowo rozkład różnorodnych multimerów Aβ w próbkach tkanki kory mózgowej człowieka2. Powszechnie stosowane techniki immunohistochemiczne nie pozwalają na rozróżnienie poszczególnych gatunków multimerów Aβ w utrwalonej tkance kory. W homogenatach nieutrwalonej tkanki kory multimery Aβ mogą zostać rozdzielone i ocenione biochemicznie przy użyciu elektroforezy w żelu oraz metod detekcji opartyc...

<table><tbody><tr><td>Tabletki z kompletnym koktajlem inhibitorów proteaz</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-29130</td><td>1 tabletka w 25ml buforu</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw XCell SureLock Mini-Cell i moduł do transferu XCell II Blot Kit CE Mark</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek Novex Tricine SDS (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>Reduktor do próbek NuPAGE (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Marker wielkości białek SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Żel Novex 10-20% Tricine 1,0 mm, 10 studni</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrany nitrocelulozowe, rozmiar porów 0,2 &amp;mu;m</td><td>Invitrogen</td><td>LC2000</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy Novex Tricine SDS (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do transferu Novex Tris-Glycine (25X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Nie zakłóca barwienia immunocytochemicznego</td></tr><tr><td>Roztwór barwiący ATX Ponceau S Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09276</td><td>Nie zakłóca barwienia immunocytochemicznego</td></tr><tr><td>Plastikowe woreczki na próbki Kapak zamykane termicznie</td><td>Fisher Scientific</td><td>0181225AA</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne 6E10 przeciwko A&amp;#946;(1-16)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Rozcieńczać 1:1 000 do 1:5 000 dla WB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole A&amp;#946; (od owcy)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Rozcieńczać 1:10 000</td></tr><tr><td>Substrat chemiluminescencyjny SuperSignal West Pico</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Film Kodak Biomax MR</td><td>Carestream Health</td><td>870 1302</td><td></td></tr></tbody></table>

detekcja multimerów a&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą sds-page/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

Uważa się, że anomalne fałdowanie i polimeryzacja peptydydu β-amyloidu (Aβ) inicjują kaskadę neurodegeneracyjną w patogenezie choroby Alzheimera1Aβ to głównie peptyd składający się z 40 lub 42 aminokwasów, który ma tendencję do samoagregacji w bogate w struktury β-kartki włókna amyloidowe, występujące w rdzeniach blaszek starczych w mózgu w chorobie Alzheimera. Coraz więcej dowodów sugeruje, że rozpuszczalne multimery Aβ o niskiej masie cząsteczkowej są bardziej toksyczne niż włóknisty amyloid Aβ2Identyfikacja i ilościowe oznaczenie niskocząsteczkowych oraz wysokocząsteczkowych gatunków multimerów Aβ w tkance mózgowej stanowią kluczowy cel badań nad chorobą Alzheimera, a zastosowane metody mogą być również wykorzystane do identyfikacji i charakterystyki toksycznych multimerów w innych proteopatiach3Naturalnie występujące multimery Aβ można wykryć za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie immunoblottingu z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla Aβ. Jednakże rozdzielenie i wykrycie multimerów Aβ wymaga zastosowania wysoce skoncentrowanych homogenatów kory mózgowej oraz odzyskiwania antygenu z membran nitrocelulozowych o małych porach. W niniejszej pracy opisujemy technikę przygotowania oczyszczonych homogenatów kory mózgowej człowieka, rozdzielania białek metodą SDS-PAGE oraz odzyskiwania epitopów antygenowych/western blottingu z użyciem przeciwciała 6E10 skierowanego przeciwko regionowi N-końcowemu peptydu Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomery, dimery, trimery, tetramery oraz multimery o wyższej masie cząsteczkowej Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów A&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Uważa się, że anomalne fałdowanie i polimeryzacja peptydu &beta;-amyloidu (A&beta;) inicjują kaskadę neurodegeneracyjną w chorobie Alzheimera...

Niniejszy protokół umożliwia wykrywanie beta malterów w tkance korowej człowieka. W pierwszej kolejności homogenizat tkanki poddawany jest sonikacji za pomocą sondy i klarowaniu poprzez wirowanie przy niskiej prędkości. Następnie zredukowane próbki gotowane są w buforze SDS i nanoszone na żel poliakrylamidowy.Białka z żelu są przenoszone na membranę nitrocelulozową, a następnie membrana jest podgrzewana parą w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Na koniec, na wytrząsarce orbitalnej, membranę inkubuje się przez noc w przeciwciałach pierwotnych, następnie w przeciwciałach wtórnych koniugowanych z HRP, a potem w odczynniku nadtlenkowym do luminescencji przed naświetlaniem na filmie rentgenowskim. Cześć, jestem Rebecca Rosen z laboratorium Larry'ego Walkera w Katedrze Neuronauki w Narodowym Centrum Badań nad Naczelnymi Yerkes na Uniwersytecie Emory.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykrywać multimery Abeta oraz homogenaty korowe za pomocą elektroforezy w żelu SDS i immunoblottingu z termicznie indukowaną regeneracją antygenu. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania poziomów i rozkładu poszczególnych multimerów Abeta w niefiksowanych tkankach korowych pobranych od ludzi z chorobą Alzheimera oraz starszych naczelnych. Zapraszamy do rozpoczęcia.Zacznij od około stu miligramów niefiksowanej tkanki kory mózgu i homogenizuj ją w około 400 µL lodowatego buforu, wykonując około 30 równomiernych ruchów tłuczkiem. Dla stężenia 20% w/v stosunek masy tkanki do objętości buforu powinien wynosić 1 mg na 4 µL. Po homogenizacji przenieś homogenaty do polipropylenowej probówki o pojemności 4 mL i poddaj sonikacji sondą trzy razy po 5 s przy mocy 5.Po sonikacji przenieść homogenaty do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez pięć minut przy 3000 G, a następnie ostrożnie zebrać klarowne nadsączniki i przechowywać alikwoty tych ekstraktów o objętości 50 µL w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Następnie określić całkowite stężenie białka w świeżo rozmrożonych alikwotach klarownych homogenatów, stosując test kwasu biurowego lub test BCA zgodnie z instrukcjami producenta; klarowne 20% homogenaty kory powinny mieć stężenie białka powyżej 5 µg/µL i mogą zatem zostać rozcieńczone w stosunku 1:10, aby mieścić się w zakresie pomiarowym czytnika płytek. W przypadku testu BCA przygotować denaturujące reakcje z tymi samymi alikwotami klarownych homogenatów.Należy użyć około 50 do 60 µg całkowitego białka i odpowiednio dostosować objętość homogenatów korowych, tak aby każda próbka zawierała taką samą ilość całkowitego białka. Przygotować próbki o całkowitej objętości 25 µL dla każdego żelu trice o stężeniu od 10 do 20%. Dla każdego żelu należy przygotować kontrolę pozytywną zawierającą od 10 do 100 ng syntetycznego peptydu a beta 40 lub a beta 42, rozcieńczonego w 1X PBS do objętości 10 µL, z dodatkiem 12,5 µL 2X buforu do próbek SDS oraz 2,5 µL 10x odczynnika redukującego.Po przygotowaniu wszystkich próbek, w tym kontroli beta, mieszać je w wirówce typu vortex przez 5–10 s i inkubować w suchym bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 5 min, a następnie krótko wirować wszystkie probówki, aby usunąć kondensację z zakrętek. Nanieść próbki na żel zanurzony w buforze do elektroforezy SDS-PAGE w komorze elektroforetycznej, nanosząc do co najmniej jednego dołka 10 µL nierozcieńczonego markera masy cząsteczkowej. Prowadzić elektroforezę przy stałym napięciu 125 V przez około 90 min lub do momentu, gdy marker 4 kDa znajdzie się około 1 cm od dolnej krawędzi żelu.Ostrożnie wyjmij żele z plastikowych kaset i złóż kanapkę transferową zgodnie z instrukcjami producenta. Wstępnie zwilż podkładki do transferu oraz membrany nitrocelulozowe o wielkości porów 0,2 µm buforem transferowym Tris-glicyna. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z podkładek do transferu lub z kanapki z papierem filtrowanym i membraną.Wypełnij wewnętrzną komorę aparatury do transferu buforem do transferu, a komorę zewnętrzną wodą destylowaną. Prowadź transfer przez dwie do trzech godzin przy stałym natężeniu prądu 25 milliamps. Po zakończeniu transferu rozmontuj układ i umieść żele w naczyniu z wodą destylowaną, a membrany w naczyniu z 1x PBS na czas wszystkich kolejnych etapów protokołu.Należy upewnić się, że żele i membrany są całkowicie przykryte płynem, aby zapobiec ich wysychaniu. W celu wizualizacji wydajności transferu białek należy barwić żele nierozcieńczonym barwnikiem SimplyBlue Safe przez około jedną godzinę oraz membrany barwnikiem Ponceau S w stężeniu 1x przez około pięć minut. Czas inkubacji powinien być dostosowany do instrukcji producenta; takie barwienie nie zakłóca procesu immunoblottingu.Jeśli barwienie wykaże nieefektywny transfer białek, należy zmodyfikować czas transferu w kroku trzecim w celu odzyskiwania antygenu. W parowarze hermetycznie zamknąć membranę w wytrzymałej plastikowej torebce CapEx wypełnionej około 50 mililitrów 1x PBS w temperaturze pokojowej. Położyć torebkę płasko w rozgrzanym parowarze w temperaturze 100 °C; gdy torebka zacznie pęcznieć, inkubować przez dodatkowe 15 minut przed wyjęciem z parowaru.Należy pozwolić membranie powoli ostygnąć przed wyjęciem jej z woreczka, aby zapobiec nadmiernemu pomarszczeniu w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyjmij membranę z woreczka i płucz ją przez pięć minut w XPBS na wytrząsarce orbitalnej, a następnie przez pięć minut w TBST na wytrząsarce orbitalnej. Następnie inkubuj membranę w roztworze blokującym przez jedną godzinę na wytrząsarce orbitalnej bez płukania, po czym przenieś membranę do naczynia zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe 6 E 10, specyficzne dla regionu terminalnego A beta, rozcieńczone w roztworze blokującym w stosunku od 1:1000 do 1:5000.Inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie przez 24 do 48 godzin z wytrząsaniem w temperaturze 4 °C. Po jednym szybkim płukaniu myć membranę przez 30 minut. W TBST kontynuować trzy 10-minutowe płukania na wytrząsarce orbitalnej.Inkubować membranę z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP, rozcieńczonym w roztworze blokującym w stosunku 1:10 000, przez 90 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. W niniejszym protokole zastosowano przeciwciało owcze przeciwko US. Ponownie płukać membranę przez 30 minut w buforze TBST, zaczynając od jednego szybkiego płukania, a następnie wykonując trzy 10-minutowe płukania na wytrząsarce orbitalnej.Po ostatnim płukaniu inkubować membranę w świeżo przygotowanych, nierozcieńczonych odczynnikach super signal West Pico ECL przez pięć minut. Zdejmując membranę z wytrząsarki ustawionej na wysokie RPM, odsączyć nadmiar odczynnika. Używając beztłuszczowego papieru filtrującego lub chusteczek Kimwipes, umieścić membranę w kasecie do klisz pomiędzy plastikowymi foliami ochronnymi, a następnie odsączyć pozostały odczynnik super signal beztłuszczowymi chusteczkami Kimwipes.W razie potrzeby naświetlać film Kodak Biomax MR.Film w odstępach 30 sekund, do 30 minut, a następnie wywołać w wywoływaczu do filmów. W tym doświadczeniu po pięciu minutach prążki monomerów A beta prawdopodobnie ulegną nasyceniu. Przejrzyste homogenaty zawierające 50 µg całkowitego białka od siedmiu ludzkich dawców przeanalizowano pod kątem obecności multimerów beta-amyloidu (A beta) oraz białka prekursorowego amyloidu (APP), czyli białka transbłonowego, z którego odszczepiany jest peptyd A beta.Przedstawiamy tutaj reprezentatywne obrazy z eksperymentu western blot dla A beta i APP przy czasie ekspozycji wynoszącym 30 minut oraz 5 minut. Ekspozycja 30-minutowa umożliwia wizualizację znacznie słabszych prążków dimerów, trimerów, tetramerów oraz prążków o wyższej masie cząsteczkowej lub oligomerów Abeta, jednak powoduje prześwietlenie pozostałych ścieżek w porównaniu do czasu ekspozycji wynoszącego 5 minut. Ten sam prążek tetrameru jest obecny, lecz słaby, co pozwala na wyraźną wizualizację pozostałych ścieżek.W ścieżkach od pierwszej do trzeciej widoczne są homogenaty kory osób z chorobą Alzheimera (AD), w ścieżce czwartej osobnik ludzki z diagnozą otępienia z ciałami Lewy'ego (DLB) i choroby Alzheimera, w ścieżkach piątej i szóstej przypadki otępienia z ciałami Lewy'ego, a w ścieżce siódmej kontrolny przypadek osoby starszej bez otępienia. Immunoblotting z użyciem przeciwciała 6C10 ujawnił monomery, dimery, trimery, tetramery i oligomery Aβ we wszystkich przypadkach choroby Alzheimera, a także liczne oligomery Aβ o wysokiej masie cząsteczkowej w dwóch przypadkach AD, co wskazuje na heterogeniczność agregacji Aβ między ludzkimi osobnikami syntetycznymi.Obecność beta 40 w prawym torze potwierdza tożsamość prążków o niższej masie cząsteczkowej. Przedstawiliśmy właśnie eksperyment Western blot z użyciem żelu SDS-PAGE w celu zidentyfikowania multimerów beta w nieutrwalonych homogenatach tkankowych z mózgów ludzi z chorobami neurodegeneracyjnymi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przygotowanie wysokoskoncentrowanych homogenatów kory do rozdziału metodą elektroforezy żelowej, aby wykryć rzadziej występujące multimery Abeta.Ważne jest również przeprowadzenie indukowanego ciepłem odsłaniania epitopów antygenowych przed immunoblottingiem z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Abeta. Odsłanianie antygenu pomaga odsłonić zamaskowane epitopy Abeta w celu optymalnego wiązania przeciwciał podczas immunoblottingu. Wystarczy dowolny parowar, kuchenka mikrofalowa lub łaźnia wodna utrzymująca temperaturę 100 °C.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.

sds-pageimmunoblot-detection-multimers-human-cortical-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zastosowanie techniki SDS-PAGE/Immunoblot do wykrywania multimerów Aβ w homogenatach ludzkiego tkanki korowej przy użyciu odzyskiwania antygenu-epitopu

Odwracalne dodawanie palmitynianu do białek jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego transportu białek. Jest to szczególnie interesujące w neuronach, w których wiele białek synaptycznych jest palmitoilowanych. Wykorzystujemy prostą metodę biochemiczną do wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych neuronach, które można dostosować do wielu typów komórek i tkanek.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Przedstawiamy protokół do identyfikacji grup białkowych zawierających antygeny dla ludzkich i mysich przeciwciał IgM ze specyficznymi łańcuchami lekkimi kappa (Vκ). Protokół ten nie ogranicza się do przeciwciał klasy IgM, ale ma zastosowanie do wszystkich izotypów immunoglobulin, które celują w swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem podczas immunoprecypitacji.

Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Opisany jest skrócony protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego.

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Ta praca opisuje syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego homo-PROTAC na bazie pomalidomidu jako nowatorskie podejście do indukowania ubikwitynacji i degradacji cereblonu ligazy ubikwityny E3 (CRBN), celu analogów talidomidu.

Chemiczna inaktywacja cereblon ligazy ubikwityny E3 przez Homo-PROTAC na bazie pomalidomidu

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj metodę wykrywania multimerów Aβ w tkance korowej człowieka za pomocą SDS-PAGE i immunoblotingu z odzyskiwaniem antygenu. Ta technika umożliwia badanie patologii choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów Aβ w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Przeglądaj więcej filmów