Detekcja multimerów Aβ w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Niniejszy protokół umożliwia wykrywanie beta malterów w tkance korowej człowieka. W pierwszej kolejności homogenizat tkanki poddawany jest sonikacji za pomocą sondy i klarowaniu poprzez wirowanie przy niskiej prędkości. Następnie zredukowane próbki gotowane są w buforze SDS i nanoszone na żel poliakrylamidowy.

Białka z żelu są przenoszone na membranę nitrocelulozową, a następnie membrana jest podgrzewana parą w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Na koniec, na wytrząsarce orbitalnej, membranę inkubuje się przez noc w przeciwciałach pierwotnych, następnie w przeciwciałach wtórnych koniugowanych z HRP, a potem w odczynniku nadtlenkowym do luminescencji przed naświetlaniem na filmie rentgenowskim. Cześć, jestem Rebecca Rosen z laboratorium Larry'ego Walkera w Katedrze Neuronauki w Narodowym Centrum Badań nad Naczelnymi Yerkes na Uniwersytecie Emory.

Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykrywać multimery Abeta oraz homogenaty korowe za pomocą elektroforezy w żelu SDS i immunoblottingu z termicznie indukowaną regeneracją antygenu. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania poziomów i rozkładu poszczególnych multimerów Abeta w niefiksowanych tkankach korowych pobranych od ludzi z chorobą Alzheimera oraz starszych naczelnych. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Zacznij od około stu miligramów niefiksowanej tkanki kory mózgu i homogenizuj ją w około 400 µL lodowatego buforu, wykonując około 30 równomiernych ruchów tłuczkiem. Dla stężenia 20% w/v stosunek masy tkanki do objętości buforu powinien wynosić 1 mg na 4 µL. Po homogenizacji przenieś homogenaty do polipropylenowej probówki o pojemności 4 mL i poddaj sonikacji sondą trzy razy po 5 s przy mocy 5.

Po sonikacji przenieść homogenaty do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez pięć minut przy 3000 G, a następnie ostrożnie zebrać klarowne nadsączniki i przechowywać alikwoty tych ekstraktów o objętości 50 µL w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Następnie określić całkowite stężenie białka w świeżo rozmrożonych alikwotach klarownych homogenatów, stosując test kwasu biurowego lub test BCA zgodnie z instrukcjami producenta; klarowne 20% homogenaty kory powinny mieć stężenie białka powyżej 5 µg/µL i mogą zatem zostać rozcieńczone w stosunku 1:10, aby mieścić się w zakresie pomiarowym czytnika płytek. W przypadku testu BCA przygotować denaturujące reakcje z tymi samymi alikwotami klarownych homogenatów.

Należy użyć około 50 do 60 µg całkowitego białka i odpowiednio dostosować objętość homogenatów korowych, tak aby każda próbka zawierała taką samą ilość całkowitego białka. Przygotować próbki o całkowitej objętości 25 µL dla każdego żelu trice o stężeniu od 10 do 20%. Dla każdego żelu należy przygotować kontrolę pozytywną zawierającą od 10 do 100 ng syntetycznego peptydu a beta 40 lub a beta 42, rozcieńczonego w 1X PBS do objętości 10 µL, z dodatkiem 12,5 µL 2X buforu do próbek SDS oraz 2,5 µL 10x odczynnika redukującego.

Po przygotowaniu wszystkich próbek, w tym kontroli beta, mieszać je w wirówce typu vortex przez 5–10 s i inkubować w suchym bloku grzejnym w temperaturze 100 °C przez 5 min, a następnie krótko wirować wszystkie probówki, aby usunąć kondensację z zakrętek. Nanieść próbki na żel zanurzony w buforze do elektroforezy SDS-PAGE w komorze elektroforetycznej, nanosząc do co najmniej jednego dołka 10 µL nierozcieńczonego markera masy cząsteczkowej. Prowadzić elektroforezę przy stałym napięciu 125 V przez około 90 min lub do momentu, gdy marker 4 kDa znajdzie się około 1 cm od dolnej krawędzi żelu.

Ostrożnie wyjmij żele z plastikowych kaset i złóż kanapkę transferową zgodnie z instrukcjami producenta. Wstępnie zwilż podkładki do transferu oraz membrany nitrocelulozowe o wielkości porów 0,2 µm buforem transferowym Tris-glicyna. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z podkładek do transferu lub z kanapki z papierem filtrowanym i membraną.

Wypełnij wewnętrzną komorę aparatury do transferu buforem do transferu, a komorę zewnętrzną wodą destylowaną. Prowadź transfer przez dwie do trzech godzin przy stałym natężeniu prądu 25 milliamps. Po zakończeniu transferu rozmontuj układ i umieść żele w naczyniu z wodą destylowaną, a membrany w naczyniu z 1x PBS na czas wszystkich kolejnych etapów protokołu.

Należy upewnić się, że żele i membrany są całkowicie przykryte płynem, aby zapobiec ich wysychaniu. W celu wizualizacji wydajności transferu białek należy barwić żele nierozcieńczonym barwnikiem SimplyBlue Safe przez około jedną godzinę oraz membrany barwnikiem Ponceau S w stężeniu 1x przez około pięć minut. Czas inkubacji powinien być dostosowany do instrukcji producenta; takie barwienie nie zakłóca procesu immunoblottingu.

Jeśli barwienie wykaże nieefektywny transfer białek, należy zmodyfikować czas transferu w kroku trzecim w celu odzyskiwania antygenu. W parowarze hermetycznie zamknąć membranę w wytrzymałej plastikowej torebce CapEx wypełnionej około 50 mililitrów 1x PBS w temperaturze pokojowej. Położyć torebkę płasko w rozgrzanym parowarze w temperaturze 100 °C; gdy torebka zacznie pęcznieć, inkubować przez dodatkowe 15 minut przed wyjęciem z parowaru.

Należy pozwolić membranie powoli ostygnąć przed wyjęciem jej z woreczka, aby zapobiec nadmiernemu pomarszczeniu w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyjmij membranę z woreczka i płucz ją przez pięć minut w XPBS na wytrząsarce orbitalnej, a następnie przez pięć minut w TBST na wytrząsarce orbitalnej. Następnie inkubuj membranę w roztworze blokującym przez jedną godzinę na wytrząsarce orbitalnej bez płukania, po czym przenieś membranę do naczynia zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe 6 E 10, specyficzne dla regionu terminalnego A beta, rozcieńczone w roztworze blokującym w stosunku od 1:1000 do 1:5000.

Inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie przez 24 do 48 godzin z wytrząsaniem w temperaturze 4 °C. Po jednym szybkim płukaniu myć membranę przez 30 minut. W TBST kontynuować trzy 10-minutowe płukania na wytrząsarce orbitalnej.

Inkubować membranę z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP, rozcieńczonym w roztworze blokującym w stosunku 1:10 000, przez 90 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. W niniejszym protokole zastosowano przeciwciało owcze przeciwko US. Ponownie płukać membranę przez 30 minut w buforze TBST, zaczynając od jednego szybkiego płukania, a następnie wykonując trzy 10-minutowe płukania na wytrząsarce orbitalnej.

Po ostatnim płukaniu inkubować membranę w świeżo przygotowanych, nierozcieńczonych odczynnikach super signal West Pico ECL przez pięć minut. Zdejmując membranę z wytrząsarki ustawionej na wysokie RPM, odsączyć nadmiar odczynnika. Używając beztłuszczowego papieru filtrującego lub chusteczek Kimwipes, umieścić membranę w kasecie do klisz pomiędzy plastikowymi foliami ochronnymi, a następnie odsączyć pozostały odczynnik super signal beztłuszczowymi chusteczkami Kimwipes.

W razie potrzeby naświetlać film Kodak Biomax MR.Film w odstępach 30 sekund, do 30 minut, a następnie wywołać w wywoływaczu do filmów. W tym doświadczeniu po pięciu minutach prążki monomerów A beta prawdopodobnie ulegną nasyceniu. Przejrzyste homogenaty zawierające 50 µg całkowitego białka od siedmiu ludzkich dawców przeanalizowano pod kątem obecności multimerów beta-amyloidu (A beta) oraz białka prekursorowego amyloidu (APP), czyli białka transbłonowego, z którego odszczepiany jest peptyd A beta.

Przedstawiamy tutaj reprezentatywne obrazy z eksperymentu western blot dla A beta i APP przy czasie ekspozycji wynoszącym 30 minut oraz 5 minut. Ekspozycja 30-minutowa umożliwia wizualizację znacznie słabszych prążków dimerów, trimerów, tetramerów oraz prążków o wyższej masie cząsteczkowej lub oligomerów Abeta, jednak powoduje prześwietlenie pozostałych ścieżek w porównaniu do czasu ekspozycji wynoszącego 5 minut. Ten sam prążek tetrameru jest obecny, lecz słaby, co pozwala na wyraźną wizualizację pozostałych ścieżek.

W ścieżkach od pierwszej do trzeciej widoczne są homogenaty kory osób z chorobą Alzheimera (AD), w ścieżce czwartej osobnik ludzki z diagnozą otępienia z ciałami Lewy'ego (DLB) i choroby Alzheimera, w ścieżkach piątej i szóstej przypadki otępienia z ciałami Lewy'ego, a w ścieżce siódmej kontrolny przypadek osoby starszej bez otępienia. Immunoblotting z użyciem przeciwciała 6C10 ujawnił monomery, dimery, trimery, tetramery i oligomery Aβ we wszystkich przypadkach choroby Alzheimera, a także liczne oligomery Aβ o wysokiej masie cząsteczkowej w dwóch przypadkach AD, co wskazuje na heterogeniczność agregacji Aβ między ludzkimi osobnikami syntetycznymi.

Obecność beta 40 w prawym torze potwierdza tożsamość prążków o niższej masie cząsteczkowej. Przedstawiliśmy właśnie eksperyment Western blot z użyciem żelu SDS-PAGE w celu zidentyfikowania multimerów beta w nieutrwalonych homogenatach tkankowych z mózgów ludzi z chorobami neurodegeneracyjnymi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest przygotowanie wysokoskoncentrowanych homogenatów kory do rozdziału metodą elektroforezy żelowej, aby wykryć rzadziej występujące multimery Abeta.

Ważne jest również przeprowadzenie indukowanego ciepłem odsłaniania epitopów antygenowych przed immunoblottingiem z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Abeta. Odsłanianie antygenu pomaga odsłonić zamaskowane epitopy Abeta w celu optymalnego wiązania przeciwciał podczas immunoblottingu. Wystarczy dowolny parowar, kuchenka mikrofalowa lub łaźnia wodna utrzymująca temperaturę 100 °C.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.