Name: SDS-PAGE/Wykrywanie immunoblot multimerów Aβ w homogenatach tkanki korowej człowieka za pomocą pobierania antygenu i epitopu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj metodę wykrywania multimerów Aβ w tkance korowej człowieka za pomocą SDS-PAGE i immunoblotingu z odzyskiwaniem antygenu. Ta technika umożliwia badanie patologii choroby Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Serdeczne podziękowania kierujemy do Elaine Pranski oraz Carolyn Suwyn za doskonałą pomoc techniczną, a także do Harry'ego LeVine'a III, M. Paula Murphy'ego i Marli Gearing za ważne rozmowy. Finansowanie zapewniły granty RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, fundacja Woodruff Foundation oraz Komitet Badawczy Uniwersytetu Emory.

Część 1: Przygotowanie klarownych homogenatów tkankowych
<ol>
 <li>Poddać homogenizacji w homogenizatorze Douncea nieutrwaloną tkankę korową w czterokrotnej objętości lodowatego buforu (0,1M roztwór soli fosforanowo-buforowanej [bezwapniowy i bezmagnezowy] z dodatkiem 2x koktajlu inhibitorów proteaz [Santa Cruz]), wykonując około 30 równomiernych ruchów tłokiem (np. dodać 400μl buforu do 100mg tkanki). </li>
 <li>Wirować homogenaty przez 5 minut przy 3,000g (4°C). Ostrożnie zebrać klarowne nadosady i przechowywać alikwoty tych ekstraktów w temperaturze -80°C do momentu użycia. </li>
 <li>Oznaczyć całkowite stężenie białka (μg/μl) w klarownych homogenatach, stosując metodę kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta (ThermoFisher).</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie próbek do SDS-PAGE
<ol>
 <li>W przypadku żelu Tricine 10-20% z 10 studzienkami (Invitrogen), maksymalna objętość, jaką można nałożyć do jednej studzienki, wynosi ~25μl. Całkowita objętość obejmuje 2x bufor do próbek SDS oraz 10x środek redukujący, zatem maksymalna objętość oczyszczonego homogenatu, jaką można nałożyć do jednej studzienki, to 10μl. Oczyszczone homogenaty kory 20% (w/v) powinny mieć całkowite stężenie białka powyżej 5 μg/μl, co pozwala na nałożenie 50μg całkowitego białka na studzienkę. Próbki o stężeniu białka poniżej 5mg/ml będą wymagały nałożenia mniejszej ilości całkowitego białka na studzienkę. Niemniej jednak, wysokie poziomy białka są optymalne dla wykrywania monomerów i agregatów Aβ (optymalna ilość to 50-60μg całkowitego białka). Zawsze należy nakładać taką samą ilość całkowitego białka do każdej studzienki.</li>
 <li>Dla każdego żelu należy nałożyć do co najmniej jednej studzienki 10μl markera masy cząsteczkowej, takiego jak SeeBlue Plus2 (Invitrogen). Jako kontrolę pozytywną, w innej studzience należy przeprowadzić analizę 10-100ng syntetycznego peptydu Aβ40 lub Aβ42 (rozcieńczonego w 1xPBS).</li>
 <li>Mieszaniny reakcyjne należy przygotować w lodzie, używając świeżo rozmrożonych, oczyszczonych homogenatów. Probówki należy wstrząsnąć w wortexie przez 5-10 sekund, podgrzać w bloku grzejnym w temperaturze 100°C przez 5 minut, a następnie szybko odwirować wszystkie próbki, aby usunąć kondensację z zakrętki.</li>
</ol>
Część 3: Elektroforeza w żelu SDS-PAGE
<ol>
 <li> a wymieszane w wortexie próbki nanieś na żel Tricine 10-20% w komorze XCell Sure Lock Mini-Cell Gelbox, stosując bufor do elektroforezy Tricine SDS, zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen),</li>
 <li>elektroforezę prowadź przy stałym napięciu 125V przez około 90 minut. Kontynuuj proces, aż prążek markera 4KDa znajdzie się około 1 cm od dolnej krawędzi żelu.</li>
</ol>
Część 4: Przenoszenie białek z żeli na membrany
<ol>
 <li>Ostrożnie wyjmij żele z plastikowej kasety i złóż kanapkę transferową wewnątrz modułu XCell II Blot zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen). Namocz wcześniej podkładki do transferu oraz membrany nitrocelulozowe 0.2μm w buforze transferowym Tris-Glycine (20% methanol), a następnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z podkładek lub z układu papieru filtrowanego/membrany. </li>
 <li>W komorze XCell Gelbox napełnij wewnętrzną komorę buforem transferowym, a zewnętrzną komorę dIH2O (długotrwała ekspozycja na methanol może prowadzić do zużycia plastikowej komory żelowej).</li>
 <li>Przeprowadź transfer przez 2-3 godziny przy stałym natężeniu prądu 25mA. </li>
 <li>Po zakończeniu transferu rozdziel kanapkę, a żele umieść w dIH2O, natomiast membrany w 1xPBS, oba rodzaje próbek w kwadratowych plastikowych szalkach Petriego (lub innym odpowiednim pojemniku).</li>
 <li>Aby zwizualizować wydajność transferu białek, żele można barwić barwnikiem Simply Blue SafeStain (Invitrogen), a membrany barwnikiem Ponceau S Red (Sigma Aldrich), oba zgodnie z instrukcjami producenta. Barwienie to nie zakłóci procesu immunoblottingu. Jeśli barwienie wykaże niską wydajność transferu białek, należy zmodyfikować czas transferu określony w kroku 3.</li>
</ol>
Część 5. Odmaskowywanie epitopów antygenowych i immunoblotting
<ol>
 <li>Przywracanie antygenów jest istotnym etapem odsłaniania epitopów Aβ na błonie w celu umożliwienia wiązania przeciwciał podczas immunoblottingu. Wystarczy dowolny parowar, kuchenka mikrofalowa lub łaźnia wodna utrzymująca stałą temperaturę 100°C. Aby przeprowadzić przywracanie antygenów w parowarze, należy zgrzać termicznie błonę w wytrzymałej plastikowej torebce Kapak wypełnionej 1xPBS w temperaturze pokojowej. Torebkę należy ułożyć płasko w wstępnie podgrzanym parowarze; gdy torebka zacznie się rozszerzać, inkubować przez dodatkowe 15 minut. Przed wyjęciem błony z torebki należy pozwolić jej powoli ostygnąć, aby zapobiec nadmiernemu marszczeniu.</li>
 <li>W temperaturze pokojowej ostrożnie wyjąć błonę z torebki do parowania i płukać ją przez 5 minut w 1xPBS, a następnie przez 5 minut w TBS-T (bufor solny Tris, pH 8.0 z 0.05% Tween-20 [Sigma]) na wytrząsarce orbitalnej. Inkubować błonę w roztworze blokującym (2.5% odtłuszczonego mleka w TBS-T) przez jedną godzinę przy wytrząsaniu. Bez płukania przenieść błonę do naczynia lub plastikowej torebki zawierającej przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym (6E10 w rozcieńczeniu 1:1,000 [1μg/ml] lub 1:5,000 [0.2μg/ml], Covance), unikając pęcherzyków powietrza. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, a następnie przez 24-48 godzin przy wytrząsaniu w 4°C (dłuższa inkubacja może zapewnić lepszy sygnał).</li>
 <li>Płukać błonę przez 30 minut w TBS-T (jedno szybkie płukanie, a następnie 3 x 10-minutowe płukania).</li>
 <li>Inkubować błonę w przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z HRP (Amersham ECL sheep anti-mouse, GE Healthcare), rozcieńczonych 1:10,000 w roztworze blokującym, przez 90 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Płukać błonę przez 30 minut w TBS-T (jedno szybkie płukanie, a następnie 3 x 10-minutowe płukania).</li>
 <li>Na wytrząsarce inkubować błonę w świeżo przygotowanym odczynniku do elektrochemiluminescencji SuperSignal West Pico (ThermoFisher) przez 5 minut, odsączyć nadmiar odczynnika na bezpyłowym papierze filtrującym i umieścić błonę w kasecie do filmu, pomiędzy plastikowymi foliami ochronnymi. W razie potrzeby odsączyć dodatkowy odczynnik SuperSignal za pomocą bezpyłowych chusteczek Kimwipes.</li>
 <li>Naświetlać na film Kodak Biomax MR w odstępach od 30 sekund do 30 minut i wywołać w wywoływaczu do filmów. Po 5 minutach prążki monomerów Aβ będą prawdopodobnie nasycone.</li>
 <li>Błony można poddać procesowi strippingu (po płukaniu w TBS-T) poprzez wytrząsanie w buforze do strippingu Restore Plus przez 30 minut w temperaturze pokojowej i w razie potrzeby ponownie inkubować z dodatkowymi przeciwciałami.</li>
</ol>
Część 6: Reprezentatywny immunoblot: 
<img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1a.jpg" alt="Elektroforeza żelowa SDS-PAGE dla analizy białek w próbkach z chorobą Alzheimera i DLB." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1b.jpg" alt="Wynik elektroforezy, prążki białkowe dla AD, DLB, ND, Aβ40; analiza białek w badaniach nad chorobą Alzheimera." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1b"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1c.jpg" alt="Analiza Western blot dla ekspresji białek w próbkach AD, DLB; zawiera marker kDa, prążki APP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1c"> Ryciny 1a-c. Klarowane homogenaty zawierające 50μg całkowitego białka od 7 ludzkich dawców zostały przeanalizowane pod kątem obecności multimerów Aβ oraz APP. Immunoblotting z użyciem przeciwciała 6E10 ujawnił monomery, dimery, trimery, tetramery Aβ oraz APP (górny prążek) we wszystkich przypadkach choroby Alzheimera, a także liczne multimery Aβ o wyższej masie cząsteczkowej w 2 przypadkach AD. Syntetyczne Aβ40 potwierdziło tożsamość prążków o niższej masie cząsteczkowej. AD: choroba Alzheimera, DLB: otępienie z ciałami Lewy’ego, ND: człowiek bez otępienia. (a) 30-minutowa ekspozycja filmu, (b) 5-minutowa ekspozycja filmu, (c) 30-sekundowa ekspozycja filmu.

<ol><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebral+proteopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+amyloid%2C+and+Alzheimer%27s+disease%3A+a+perspective+in+honor%5BTitle%5D)+AND+%22of+Carl+Cotman.+Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li>
<li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li>
<li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li>
<li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li>
</ol>

Pomimo znaczenia agregacji Aβ w patogenezie choroby Alzheimera1,4,5, niewiele badań opisało lub określiło ilościowo rozkład różnorodnych multimerów Aβ w próbkach tkanki kory mózgowej człowieka2. Powszechnie stosowane techniki immunohistochemiczne nie pozwalają na rozróżnienie poszczególnych gatunków multimerów Aβ w utrwalonej tkance kory. W homogenatach nieutrwalonej tkanki kory multimery Aβ mogą zostać rozdzielone i ocenione biochemicznie przy użyciu elektroforezy w żelu oraz metod detekcji opartyc...

<table><tbody><tr><td>Tabletki z kompletnym koktajlem inhibitorów proteaz</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-29130</td><td>1 tabletka w 25ml buforu</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw XCell SureLock Mini-Cell i moduł do transferu XCell II Blot Kit CE Mark</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbek Novex Tricine SDS (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>Reduktor do próbek NuPAGE (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Marker wielkości białek SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Żel Novex 10-20% Tricine 1,0 mm, 10 studni</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrany nitrocelulozowe, rozmiar porów 0,2 &amp;mu;m</td><td>Invitrogen</td><td>LC2000</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy Novex Tricine SDS (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do transferu Novex Tris-Glycine (25X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Nie zakłóca barwienia immunocytochemicznego</td></tr><tr><td>Roztwór barwiący ATX Ponceau S Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09276</td><td>Nie zakłóca barwienia immunocytochemicznego</td></tr><tr><td>Plastikowe woreczki na próbki Kapak zamykane termicznie</td><td>Fisher Scientific</td><td>0181225AA</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne 6E10 przeciwko A&amp;#946;(1-16)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Rozcieńczać 1:1 000 do 1:5 000 dla WB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole A&amp;#946; (od owcy)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Rozcieńczać 1:10 000</td></tr><tr><td>Substrat chemiluminescencyjny SuperSignal West Pico</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Film Kodak Biomax MR</td><td>Carestream Health</td><td>870 1302</td><td></td></tr></tbody></table>

detekcja multimerów a&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą sds-page/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

Uważa się, że anomalne fałdowanie i polimeryzacja peptydydu β-amyloidu (Aβ) inicjują kaskadę neurodegeneracyjną w patogenezie choroby Alzheimera1Aβ to głównie peptyd składający się z 40 lub 42 aminokwasów, który ma tendencję do samoagregacji w bogate w struktury β-kartki włókna amyloidowe, występujące w rdzeniach blaszek starczych w mózgu w chorobie Alzheimera. Coraz więcej dowodów sugeruje, że rozpuszczalne multimery Aβ o niskiej masie cząsteczkowej są bardziej toksyczne niż włóknisty amyloid Aβ2Identyfikacja i ilościowe oznaczenie niskocząsteczkowych oraz wysokocząsteczkowych gatunków multimerów Aβ w tkance mózgowej stanowią kluczowy cel badań nad chorobą Alzheimera, a zastosowane metody mogą być również wykorzystane do identyfikacji i charakterystyki toksycznych multimerów w innych proteopatiach3Naturalnie występujące multimery Aβ można wykryć za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS, a następnie immunoblottingu z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla Aβ. Jednakże rozdzielenie i wykrycie multimerów Aβ wymaga zastosowania wysoce skoncentrowanych homogenatów kory mózgowej oraz odzyskiwania antygenu z membran nitrocelulozowych o małych porach. W niniejszej pracy opisujemy technikę przygotowania oczyszczonych homogenatów kory mózgowej człowieka, rozdzielania białek metodą SDS-PAGE oraz odzyskiwania epitopów antygenowych/western blottingu z użyciem przeciwciała 6E10 skierowanego przeciwko regionowi N-końcowemu peptydu Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomery, dimery, trimery, tetramery oraz multimery o wyższej masie cząsteczkowej Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów A&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Uważa się, że anomalne fałdowanie i polimeryzacja peptydu &beta;-amyloidu (A&beta;) inicjują kaskadę neurodegeneracyjną w chorobie Alzheimera...

Niniejszy protokół umożliwia wykrywanie beta malterów w tkance korowej człowieka. W pierwszej kolejności homogenizat tkanki poddawany jest sonikacji za pomocą sondy i klarowaniu poprzez wirowanie przy niskiej prędkości. Następnie zredukowane próbki gotowane są w buforze SDS i nanoszone na żel poliakrylamidowy.Białka z żelu są przenoszone na membranę nitrocelulozową, a następnie membrana jest podgrzewana parą w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Na koniec, na wytrząsarce orbitalnej, membranę inkubuje się przez noc w przeciwciałach pierwotnych, następnie w przeciwciałach wtórnych koniugowanych z HRP, a potem w odczynniku nadtlenkowym do luminescencji przed naświetlaniem na filmie rentgenowskim. Cześć, jestem Rebecca Rosen z laboratorium Larry'ego Walkera w Katedrze Neuronauki w Narodowym Centrum Badań nad Naczelnymi Yerkes na Uniwersytecie Emory.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykrywać multimery Abeta oraz homogenaty korowe za pomocą elektroforezy w żelu SDS i immunoblottingu z termicznie indukowaną regeneracją antygenu. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania poziomów i rozkładu poszczególnych multimerów Abeta w niefiksowanych tkankach korowych pobranych

sds-pageimmunoblot-detection-multimers-human-cortical-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Zastosowanie techniki SDS-PAGE/Immunoblot do wykrywania multimerów Aβ w homogenatach ludzkiego tkanki korowej przy użyciu odzyskiwania antygenu-epitopu

Odwracalne dodawanie palmitynianu do białek jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego transportu białek. Jest to szczególnie interesujące w neuronach, w których wiele białek synaptycznych jest palmitoilowanych. Wykorzystujemy prostą metodę biochemiczną do wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych neuronach, które można dostosować do wielu typów komórek i tkanek.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Przedstawiamy protokół do identyfikacji grup białkowych zawierających antygeny dla ludzkich i mysich przeciwciał IgM ze specyficznymi łańcuchami lekkimi kappa (Vκ). Protokół ten nie ogranicza się do przeciwciał klasy IgM, ale ma zastosowanie do wszystkich izotypów immunoglobulin, które celują w swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem podczas immunoprecypitacji.

Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Opisany jest skrócony protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego.

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Ta praca opisuje syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego homo-PROTAC na bazie pomalidomidu jako nowatorskie podejście do indukowania ubikwitynacji i degradacji cereblonu ligazy ubikwityny E3 (CRBN), celu analogów talidomidu.

Chemiczna inaktywacja cereblon ligazy ubikwityny E3 przez Homo-PROTAC na bazie pomalidomidu

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj metodę wykrywania multimerów Aβ w tkance korowej człowieka za pomocą SDS-PAGE i immunoblotingu z odzyskiwaniem antygenu. Ta technika umożliwia badanie patologii choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów Aβ w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Przeglądaj więcej filmów