Name: Przygotowanie próbki MALDI: metoda ultra cienkowarstwowa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Naucz się metody ultra cienkowarstwowej do przygotowania próbek MALDI-MS dla analizy białek. Technika ta zapewnia dokładne oznaczanie masy cząsteczek i wymaga stosowania reagentów klasy HPLC oraz odpowiedniego czyszczenia płytki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podczas przygotowywania cienkiej warstwy bardzo ważne jest noszenie rękawiczek bezpudrowych.
Czyszczenie płytki z próbką
<ol>
	<li>Użyć płytki do próbek MALDI wykonanej ze stali nierdzewnej lub złota.</li>
	<li>Przemyć MeOH i delikatnie wytrzeć chusteczką Kimwipe. Nie należy pocierać ani szorować powierzchni chusteczką, aby uniknąć jej zarysowania.</li>
	<li>Przemyć H2O i delikatnie wytrzeć chusteczką Kimwipe.</li>
	<li>Przemyć MeOH i delikatnie wytrzeć chusteczką Kimwipe.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórzyć cykl czyszczenia MeOH/H2O/MeOH, zawsze kończąc etapem z MeOH.</li>
	<li>Upewnić się, że na płytce nie pozostały żadne ślady („ghost spots”) ani osady. W przypadku wystąpienia takich śladów, opłukać płytkę wodą dejonizowaną, pocierając powierzchnię dłonią w rękawiczce (nie używać chusteczek Kimwipe). Powtórzyć cykl czyszczenia MeOH/H2O/MeOH.</li>
	<li>Użyć płytki niezwłocznie po praniu.</li>
</ol>
Przygotowanie roztworu do podłoża cienkowarstwowego
<ol>
	<li>Wymieszać 1 część nasyconego 4-HCCA (2 części ACN, 1 część wody i 0,1% końcowego stężenia TFA) z 3 częściami izopropanolu. 
	 
	Uwaga: Roztwór do nanoszenia cienkiej warstwy na podłoże jest bardzo stabilny i&#160;może być przechowywany w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez rok. Można go również przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
Przygotowanie podłoża z cienkiej warstwy
<ol>
	<li>Nanieś 20-50 µL roztworu podłoża do cienkiej warstwy na lewą środkową część płytki i rozprowadź go bokiem końcówki pipety. Wykonuj ruchy w jednym kierunku.</li>
	<li>W miarę wysychania roztworu rozpuszczalnik organiczny odparowuje bardzo szybko, pozostawiając na powierzchni płytki drobne kropelki wody. W tym momencie owiń palec wskazujący warstwą chusteczki Kimwipe i początkowo delikatnie osusz nim powierzchnię płytki.</li>
	<li>Gdy powierzchnia zostanie oczyszczona z kropel wody, przetrzyj całą płytkę jednokierunkowymi ruchami za pomocą chusteczki Kimwipe. 
	 
	Uwaga: Jeśli roztwór nie rozprowadza się w wystarczającym stopniu po powierzchni płytki, zwiększ zawartość ACN i ponownie przygotuj cienką warstwę. Parametrami, które mogą wpływać na rozprowadzanie roztworu, są m.in. wilgotność i temperatura otoczenia. 
	 
	Uwaga: W przypadku płytek złotych warstwa zazwyczaj przejawia się jako żółtawy odblask, w zależności od kąta widzenia i oświetlenia. W przypadku płytek stalowych zazwyczaj widoczna jest tylko krawędź warstwy. 
	&#160;</li>
	<li>Przed umieszczeniem płytki w uchwycie oczyść jej krawędzie nową chusteczką Kimwipe, aby zapobiec zanieczyszczeniu instrumentu matrycą.</li>
</ol>
Przygotowanie roztworu matrycy
<ol>
	<li><a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">Nasycony roztwór 4-HCCA</a> w FWI (3 części kwasu mrawkowego, 1 część wody, 2 części izopropanolu) jest zalecany do analizy zarówno białek błonowych, jak i rozpuszczalnych. Może być on również stosowany w szczególnych przypadkach do analizy bardzo hydrofobowych dużych peptydów (M &#62;4,000 u). Należy upewnić się, że roztwór matrycy używany do nanoszenia białek nie zawiera więcej niż ~50% składników organicznych,&#160;ponieważ spowodowałoby to całkowite rozpuszczenie podłoża z cienkiej warstwy, niwelując zalety tej metody.</li>
</ol>
Test podłoża z cienkiej warstwy
<ol>
	<li>Nanieś 0,5 µL roztworu matrycy na płytkę. Na granicy między cienką warstwą a kropelką pojawi się białawy osad. Gdy warstwa ta całkowicie pokryje dno kropelki, zazwyczaj w ciągu 10–15 s, odessij nadmiar cieczy za pomocą linii próżniowej. Jeśli utworzenie osadu trwa dłużej niż 30 s&#160;, może to wskazywać na problem z podłożem cienkiej warstwy i/lub roztworem matrycy.</li>
</ol>
Nakładanie próbki
<ol>
	<li>Stężenie anality w roztworach wyjściowych powinno mieścić się w przedziale od 10 do 1000 µM.</li>
	<li>Rozcieńcz roztwór anality w roztworze matrycy do końcowego stężenia anality wynoszącego 0,2–2 µM. Na przykład, zacznij od 1 µL&#160;próbki i 9 µL&#160;roztworu matrycy. 
	 
	Uwaga: Upewnij się, że matryca w roztworze końcowym jest bliska nasycenia, w przeciwnym razie dojdzie do ponownego rozpuszczenia podłoża cienkowarstwowego. 
	 
	Uwaga: Stężenia anality wymagane do uzyskania zadowalających sygnałów&#160;są w dużym stopniu zależne od złożoności i składu roztworu (np. zanieczyszczeń) oraz jonizowalności anality. 
	 
	Uwaga: Jeśli rozcieńczenie jednostopniowe nie przynosi dobrych wyników, należy spróbować kolejnego etapu rozcieńczania. Choć może wydawać się to nieintuicyjne, silnie stężone roztwory anality rzadko dają dobre widma. 
	 
	Uwaga: Białka błonowe zazwyczaj wymagają większych rozcieńczeń. 
	&#160;</li>
	<li>Nanieś 0,5 µL&#160;mieszaniny próbki z matrycą na płytkę. Na granicy między cienką warstwą a kroplą utworzy się białawy osad. Osad ten jest wynikiem kokrystalizacji matrycy i anality. Gdy warstwa ta całkowicie pokryje dno kropli, zazwyczaj w ciągu 10–15 s, odessaj nadmiar cieczy za pomocą linii próżniowej. Jeśli utworzenie osadu trwa dłużej niż 30 s&#160;, może to wskazywać na obecność zanieczyszczeń hamujących krystalizację lub zbyt wysokie stężenie anality.</li>
</ol>
Aplikacja kalibratora
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę kalibratora i matrycy w podobny sposób, tak aby końcowe stężenie kalibratora wynosiło od 0,1–0,5 µM.</li>
	<li>Nanieść 0,5 µL&#160;mieszaniny kalibratora i matrycy na płytkę w bliskim sąsiedztwie plamek z próbką. Ta bliskość fizyczna jest wykorzystywana w procedurze pseudowewnętrznej kalibracji, podczas której podczas akwizycji próbki płytka jest przemieszczana z plamki z próbką do plamki z kalibratorem, aby dodać do widma kilka impulsów laserowych kalibratora. Podejście to gwarantuje wyższą dokładność kalibracji masy niż w przypadku stosowania wyłącznie kalibracji zewnętrznej.</li>
</ol>
Krok płukania
<ol>
	<li>Przemyj każdą plamkę około 2 µL lodowatego 0,1% wodnego roztworu TFA. Odessij nadmiar cieczy za pomocą linii próżniowej.</li>
</ol>
Pozyskiwanie widm mas
<ol>
	<li>Można teraz przystąpić do pozyskiwania widm masowych. W przypadku zastosowania roztworu matrycy FWI, widma należy pozyskać jak najszybciej, aby zapobiec nieodwracalnym modyfikacjom analitytu, takim jak formylacja.</li>
</ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

przygotowanie próbek do analizy maldi: metoda ultracienkiej warstwy

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

W tym filmie zaprezentowano przygotowanie ultracienkiej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek metodą spektrometrii mas z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą (MALDI-MS) 1,2. Metoda ultracienkiej warstwy polega na wytworzeniu na płytce do próbek warstwy podłoża z kryształów matrycy (kwasu alfa-cyjano-4-hydroksycynnamowego), która służy jako baza do późniejszej krystalizacji mieszaniny matrycy i analitu. Zalety metody ultracienkiej warstwy w porównaniu z innymi podejściami do nanoszenia próbek (np. metodą wysuszonej kropli) to (i) większa tolerancja na zanieczyszczenia, takie jak sole i detergenty, (ii) lepsza rozdzielczość oraz (iii) wyższa jednorodność przestrzenna. Metoda ta jest szczególnie przydatna do dokładnego wyznaczania masy białek. Protokół został pierwotnie opracowany i zoptymalizowany do analizy białek błonowych i z sukcesem wykorzystany do analizy kanałów jonowych, transporterów metabolitów oraz receptorów zawierających od 2 do 12 domen transbłonowych 2. Od czasu pierwotnej publikacji wykazano, że jest ona równie użyteczna w analizie białek rozpuszczalnych. W rzeczywistości zastosowaliśmy ją w przypadku wielu białek o szerokim zakresie właściwości, w tym tych o masach cząsteczkowych sięgających 380 kDa 3. Obecnie jest to nasza preferowana metoda analizy masy cząsteczkowej wszystkich białek. Opisana procedura konsekwentnie pozwala na uzyskanie wysokiej jakości widm, a ponadto jest czuła, stabilna i łatwa do wdrożenia.

Niniejszy film prezentuje przygotowanie ultrascienistej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MS).

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

W niniejszym materiale wideo przedstawiono przygotowanie ultracienkiej warstwy matrycy/analitu do analizy peptydów i białek metodą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą...

Witamy w tutorialu CHI Lab dotyczącym metody ultracienkiej warstwy, która jest szczególnie przydatna do dokładnego wyznaczania masy białek. Ze względu na wysoką czułość spektrometrii mas, stosujemy wyłącznie odczynniki klasy HPLC oraz lateksowe lub nitrylowe rękawiczki niezapylające do czyszczenia płytki. Płucz płytkę naprzemiennie metanolem i wodą, a na koniec ponownie metanolem.Pomiędzy każdym płukaniem delikatnie usuń nadmiar rozpuszczalnika, używając chusteczek do soczewek. Kroki mycia można powtarzać tyle razy, ile jest to konieczne, aby uzyskać czystą płytkę. Po wyczyszczeniu i wysuszeniu płytkę należy wykorzystać niezwłocznie.Nanieś i rozprowadź od 20 do 30 µL roztworu substratu do cienkiej warstwy na czystą płytkę MALDI. W tym kroku używamy końcówki do pipety P250, aby równomiernie rozprowadzić roztwór, unikając jednocześnie porysowania płytki. Gdy cienka warstwa wysycha, usuń ewentualne pozostałe krople wody, delikatnie osuszając powierzchnię chusteczką Kimwipe.Następnie delikatnie przetrzyj płytkę jednym płynnym ruchem za pomocą chusteczki Kimwipe, aby prawidłowo utworzyć cienką warstwę. Na koniec oczyść krawędzie płytki, aby uniknąć zanieczyszczenia spektrometru mas. Kluczowe jest przetestowanie cienkiej warstwy przed naniesieniem próbki.Jeśli miejsce testowe schnie zbyt długo, a kryształy nie są homogeniczne, problem może tkwić w samej cienkiej warstwie lub w roztworze matrycy; w takim przypadku należy oczyścić płytkę, ponownie nanieść cienką warstwę i powtórzyć test. Podczas nakładania próbek na cienką warstwę nie należy doprowadzić do całkowitego odparowania plam. Zamiast tego, gdy krystalizacja spowolni i ustanie, należy usunąć nadmiar rozpuszczalnika.Przy użyciu aspiratora próżniowego. Obecność zanieczyszczeń, takich jak sole i detergenty, a także wysokie stężenie analitu mogą zakłócać krystalizację. Dalsze rozcieńczenie próbki może poprawić krystalizację. Nanieś kropki „Ants” w bezpośrednim sąsiedztwie próbki. Umożliwi to przeprowadzenie pseudo-kalibracji wewnętrznej, w której płytka jest przemieszczana z miejsca z próbką do miejsca kalibracyjnego.Podczas pozyskiwania próbek, poprzez dodanie do widma kilku impulsów lasera CAS, podejście to gwarantuje wyższą dokładność kalibracji masy niż w przypadku samej kalibracji zewnętrznej. Bardzo ważne jest wypłukanie wszelkich zanieczyszczeń, takich jak sól lub detergent, które mogą zakłócać jonizację analitu. W tym celu nanieś kroplę lodowatej wody o stopniu czystości HPLC z dodatkiem 0,1% kwasu trifluorooctowego bezpośrednio na plamki.Usuń roztwór płuczący za pomocą aspiratora próżniowego, jak pokazano tutaj. Metoda ta pozwala uzyskać doskonałe widma zarówno dla białek błonowych, jak i rozpuszczalnych.

maldi-sample-preparation-the-ultra-thin-layer-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Preparacja próbki MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Opracowaliśmy technologię opartą na cienkiej warstwie krzemionki mezoporowatej do selektywnego odzyskiwania białek i peptydów o niskiej masie cząsteczkowej z surowicy ludzkiej. Właściwości fizykochemiczne naszych chipów mezoporowatych zostały precyzyjnie dostrojone, aby zapewnić znaczną kontrolę nad wzbogacaniem peptydów, a w konsekwencji umożliwić profilowanie proteomu surowicy do celów diagnostycznych.

Wzbogacanie białek o niskiej masie cząsteczkowej na cienkich warstwach mezoporowatej krzemionki w celu odkrywania biomarkerów

Dokładny pomiar masy stanowi ważny krok podczas badania białek. Do takiego oznaczania można wykorzystać spektrometrię mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), a jej kluczową zaletą jest tolerancja na sole, detergenty i zanieczyszczenia. Poniżej przedstawiono przystępne podejście do analizy białek większych niż 100 kDa za pomocą MALDI-MS.

Wspomagana matrycą desorpcja/jonizacja laserowa czas przelotu (MALDI-TOF) Analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek większych niż 100 kDa

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężne narzędzie, które może być używane do odkrywania i identyfikowania różnych związków chemicznych w nienaruszonych tkankach, zachowując związki w ich naturalnym środowisku, co może dostarczyć nowych informacji na temat procesów biologicznych. W niniejszym artykule opisano metodę MSI opracowaną do analizy małych cząsteczek.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula

Źródło obrazowania spektrometrią mas (MSI) działające pod ciśnieniem atmosferycznym zostało opracowane przez sprzężenie desorpcji laserowej w średniej podczerwieni i post-jonizacji elektrorozpylania. Egzogenna matryca lodowa została wykorzystana jako matryca pochłaniająca energię, aby ułatwić rezonansową desorpcję materiału związanego z tkanką. Ten manuskrypt zawiera protokół krok po kroku do wykonywania IR-MALDESI MSI u noworodków całego ciała.

Obrazowanie spektrometrii mas całego ciała za pomocą jonizacji elektronatryskowej z desorpcją laserową wspomaganą matrycą w podczerwieni (IR-MALDESI)

Pokazano protokół redukcji przestrzennych niejednorodności sygnałów jonowych w spektrometrii mas MALDI poprzez regulację temperatury substratu podczas procesów suszenia próbki.

Przygotowanie jednorodnych próbek MALDI do zastosowań ilościowych

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących prawidłowego przygotowania próbki do analizy lipidów i metabolitów w małych tkankach, takich jak mózg Drosophila, przy użyciu wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji (MALDI) obrazowania spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do szybkiej analizy lipidów w mózgu Drosophila przy użyciu obrazowania metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Naucz się metody ultra cienkowarstwowej do przygotowania próbek MALDI-MS dla analizy białek. Technika ta zapewnia dokładne oznaczanie masy cząsteczek i wymaga stosowania reagentów klasy HPLC oraz odpowiedniego czyszczenia płytki.

Przygotowanie próbek do analizy MALDI: metoda ultracienkiej warstwy

Przeglądaj więcej filmów