Name: Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę profilowania polirybosomów w komórkach eukariotycznych przy użyciu frakcjonowania gradientem sacharozy. Technika ta umożliwia analizę regulacji translacji i dynamiki rybosomów w różnych warunkach eksperymentalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Woolfordowi za opracowanie podstaw tej metody; TGK jest wspierany przez NIH GM057483 oraz AI076245, a PRC przez GM77073.

1. Przygotowanie gradientów sacharozy 7-47%
<ol>
	<li>Przygotuj gradienty sacharozy na jeden dzień przed użyciem, aby gradienty stały się ciągłe. Przygotuj sterylne 7% i 47% roztwory sacharozy zawierające 50 mM NH44Cl, 50mM Tris-octan pH 7,0 oraz 12mM MgCl22 i przechowywać w temperaturze 4°C 1.</li>
	<li>W celu przygotowania 6 gradientów wymieszaj roztwory stokowe sacharozy o stężeniach 7% i 47%, aby otrzymać po 48 ml roztworów o następujących stężeniach sacharozy. Do każdego roztworu sacharozy dodaj DTT (roztwór stokowy 1 M) do stężenia końcowego 1 mM. 
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
 <tr>
 <td>Stężenie końcowe</td>
 <td>7% sacharozy</td>
 <td>47% sacharoza</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7%</td>
 <td>48 mL</td>
 <td>0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>17%</td>
 <td>36 ml</td>
 <td>12 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27%</td>
 <td>24 mL</td>
 <td>24 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37%</td>
 <td>12 ml</td>
 <td>36 mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>47%</td>
 <td>0</td>
 <td>48 mL</td>
 </tr>
</tbody>
</table></li>
	<li>Aby przygotować gradienty, przymocuj pipetę Pasteura do strzykawki o pojemności 20 ml, zabezpieczając i uszczelniając połączenie Parafilmem, lub użyj długiej igły. Do dna probówki do ultracentryfugi z polyallomeru o wymiarach 1 x 3,5 cala dodaj 7 ml 7% sacharozy. Następnie dodaj 7 ml 17% roztworu sacharozy pod roztwór 7%, umieszczając końcówkę pipety Pasteura blisko dna probówki i pipetując z prędkością nieprzekraczającą 0,3 ml/s. Powtórz czynność dla 7 ml roztworów sacharozy o stężeniach odpowiednio 27%, 37% i 47%. Powinny być widoczne wyraźne linie między warstwami, co wskazuje na minimalne zmieszanie składników. Gradienty należy przechowywać w 4°C przez noc, wraz z wirnikami, butelkami i probówkami, które zostaną wykorzystane do pobierania próbek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ekstraktu drożdżowego
<ol>
	<li>Hodować 125 mL kultury drożdży do osiągnięcia OD600 na poziomie 0,8-1,0. Dodać do kultury cykloheksymid do stężenia końcowego 100 μg/mL i kontynuować inkubację z wytrząsaniem w temperaturze 30°C przez 15 min.</li>
	<li>W tym czasie przygotować bufor lizujący zawierający 80 μg/mL cykloheksymidu, 200 μg/mL heparyny, 0,2% DEPC, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1M NaCl oraz 30mM MgCl2. Od tego momentu wszystkie składniki przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Przelać kulturę do butelki wirówkowej o pojemności 250 mL i wypełnić lodem. Wirować przy 8 000 x g (7 250 rpm w rotorze SLA-1500) przez 5 min w temperaturze 4°C. Przemyć osad raz 10 mL lodowatego buforu lizującego i przenieść do polipropylenowych probówek o pojemności 15 mL. Wirować przy 5 900 x g (~6 000rpm w rotorze SLA-600TC) przez 3 min w temperaturze 4°C. Resuspender osad w 0,5 mL buforu lizującego, przenieść do probówki 1,5 mL i dodać 0,5 mL schłodzonych, wypalanych, mytych kwasem szklanych kulek. Homogenizować komórki w vortexerze w czterech 30-sekundowych interwałach, chłodząc probówkę w lodzie przez 30 sek między każdym interwałem. Dodać kolejne 0,5 mL buforu lizującego do probówki 1,5 mL. Wirować z maksymalną prędkością w mikrocentry fudze (14 000 rpm w mikrocentry fudze Eppendorf 5417R) przez 10 min w temperaturze 4°C. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrocentry fugi o pojemności 1,5 mL. Pobrać 10 μl do oddzielnej probówki w celu wyznaczenia stosunku OD260 / OD280 (patrz krok 3.1 poniżej). Przechowywać ekstrakty w temperaturze -80°C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ekstraktów z komórek ssaków
<ol>
	<li>W przypadku komórek adherentnych, hodować je w szalce 100 mm do osiągnięcia ok. 70% konfluencji. Wymagana jest jedna szalka 100 mm na 11 ml gradientu (typowy uzysk to ok. 20 jednostek OD260). Ilość należy skalować liniowo dla większych lub mniejszych objętości gradientu. W przypadku komórek nieadherentnych, na 11 ml gradientu potrzeba około 1 x 107 komórek.</li>
	<li>Przed lizą dodać cykloheksymid do stężenia 100 μg/mL. Inkubować w 37°C przez 15 min. Przenieść płytki na lód i dwukrotnie wypłukać komórki w lodowatym PBS. Wszystkie kolejne kroki MUSZĄ być wykonywane w temperaturze 0-4°C.</li>
	<li>Usunąć wszystkie pozostałości PBS poprzez aspirację (pozostawić płytki do odcieknięcia na nachylonym złożu lodu), dodać 1 mL buforu do lizy, zebrać komórki skrobaczką i przenieść do schłodzonej wcześniej probówki 1,5 mL. Składniki buforu do lizy będą wymagały optymalizacji w zależności od typu komórek i warunków hodowli. Dobrym buforem startowym będzie 20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 15 mM MgCl2, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v/v), 100 μg/mL cykloheksymidu, 2 mM DTT oraz 1 mg/mL heparyny. Kluczowymi zmiennymi są stężenia chlorku magnezu i potasu, a także zastosowanie lub pominięcie niejonowych detergentów w celu poprawy ekstrakcji polisomów cytoszkieletowych lub związanych z błoną. Lizować komórki, przepuszczając je dwukrotnie przez igłę strzykawki o rozmiarze 27G lub wykonując 5-10 ruchów homogenizatorem Dounce z tłuczkiem typu B. Strzykawkę lub homogenizator należy schłodzić przed użyciem.</li>
	<li>Wirować przy 14,000 x g przez 5 min w mikrowirówce z chłodzeniem. Przenieść świeży lizat do gradientu sacharozy (dla komórek ssaków gradient ten przygotowuje się w buforze do lizy pozbawionym Triton X-100 i heparyny, ale w pozostałym zakresie zgodnie z opisem w 1.2 i 1.3) lub zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie do późniejszego użycia.</li>
</ol>
4. Wirowanie gradientów
<ol>
	<li>Rozmrozić lizaty poliribosomów na lodzie. Określić stężenie kwasów nukleinowych w lizacie, dodając zarezerwowaną próbkę 10 μL do 1 mL wody i odczytując stosunek OD260/OD280 za pomocą spektrofotometru. Typowa wydajność z hodowli drożdży prowadzonej zgodnie z opisem wynosi 50 jednostek OD.</li>
	<li>Używając pipety z końcówką przyłożoną do ścianki probówki w pobliżu powierzchni gradientu, ostrożnie nanieść 25 jednostek OD260 lizatu na wierzch gradientu. Dla gradientu o objętości 35 mL zazwyczaj nanosi się 500 μl lizatu. W celu zapewnienia naniesienia takiej samej objętości do wszystkich gradientów można zastosować bufor do lizy. Mniejsze ilości materiału zapewniają lepszą rozdzielczość. Za pomocą pęsety ostrożnie umieścić probówki z gradientami w koszykach rotora z koszyczkami odchylanymi.</li>
	<li>Wirować gradienty przy 100,000 x g (23,000 rpm w rotorze Surespin 630) przez 4 h w temperaturze 4°C. Protokół ten można dostosować do gradientów o mniejszej objętości.</li>
</ol>
5. Gromadzenie danych i frakcji
<ol>
	<li>Na około 30 min przed zakończeniem 4-godzinnego wirowania przymocuj igłę do przebijaka do probówek Model 184. Podłącz pióro do on-line monitora absorbancji/fluorescencji Isco Model UA-5. Włącz monitor absorbancji, aby umożliwić osiągnięcie stabilnej linii bazowej przed analizą próbek. Elektroniczną akwizycję profilu polisomów można łatwo uzyskać, podłączając jednostkę akwizycji danych DI-148U (DATAQ Instruments) do rejestratora wykresów. Profile mogą być następnie zbierane w czasie rzeczywistym i zapisywane do późniejszej adnotacji przy użyciu dołączonego oprogramowania WinDaq.</li>
	<li>Napełnij pompę strzykawkową 50mL Fluorinertu, korzystając z przepływu wstecznego w ustawieniu szybkim. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Połącz wąż ze strzykawki z przebijakiem do probówek i krótko uruchom przepływ Fluorinertu z prędkością 3 mL/min w kierunku w przód, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z węża.</li>
	<li>Pod wężem na końcu celi przepływowej ustaw zlewkę na odpady lub serię probówek (jeśli zbierane są frakcje), aby zbierać nadmiar próbki.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij z rotora wirówki probówki z polialomeru zawierające gradient sacharozy i umieść je w lodzie (wcześniej przygotuj wgłębienia w lodzie za pomocą pustej probówki, aby uniknąć zaburzenia gradientów).</li>
	<li>Aby przeanalizować ekstrakty komórkowe, umieść probówkę z gradientem na przebijaku do probówek. Podłącz górną część probówki do wylotu i zabezpiecz. Podnieś dolną platformę do probówki wirówkowej tak, aby igła przebiła dno probówki. Gdy igła przejdzie przez dno probówki wirówkowej, rozpocznij przepływ Fluorinertu w kierunku w przód z prędkością 6mL/min.</li>
	<li>Gdy Fluorinert zacznie wpływać do probówki, monitoruj ruch igły na on-line monitorze absorbancji. Gdy igła zacznie się poruszać, włącz ruch wykresu, ustawiając prędkość na 60. Monitor zarejestruje OD254, zaczynając od materiału wolnego, następnie wykryje podjednostki rybosomalne 40S i kontynuując aż do kompleksów polirybosomów. Jeśli zbierane są frakcje do analizy RNA lub białek, zazwyczaj pobiera się frakcje 0,2 min (1 mL). Do analizy RNA frakcje należy zbierać bezpośrednio do probówek zawierających Trizol (Invitrogen), fenol lub SDS/proteinazę K, w zależności od preferowanej metody ekstrakcji.</li>
	<li>Po osiągnięciu końca profilu polirybosomów wyłącz przepływ Fluorinertu do probówki wirówkowej i zatrzymaj ruch wykresu w monitorze absorbancji/fluorescencji.</li>
	<li>Wycofaj Fluorinert z probówki wirówkowej do strzykawki, rozpoczynając przepływ w kierunku wstecznym z dużą prędkością, dbając o to, aby nie zaciągnąć sacharozy z probówki do strzykawki. Odkręć probówkę wirówkową od przebijaka, opuść igłę i wyjmij probówkę.</li>
	<li>Powtórz kroki od 5.5 do 5.8 dla każdego gradientu sacharozy.</li>
	<li>Po przeanalizowaniu wszystkich gradientów sacharozy wycofaj Fluorinert z węża z powrotem do strzykawki. Zdemontuj każdą część frakcjonatora (przebijak do probówek i celę przepływową), w tym wąż odpływowy znajdujący się na górze, i dokładnie wypłucz wodą.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1948/1948fig1.jpg" alt="Wykres profilu sedymentacji; podjednostki rybosomalne, polizomy; analiza gęstości względem A254nm." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Reprezentatywny zapis ekstraktu rybosomalnego przygotowanego z szczepu drożdży BY4741 (mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) w obecności cykloheksymidu. Ekstrakt rybosomalny poddano frakcjonowaniu przy użyciu gradientu sacharozy 7–47% i analizowano za pomocą aparatury z pompą strzykawkową połączoną z detektorem UV. Oznaczono piki zawierające polirybosomy oraz rybosomy 80S, 60S i 40S.

<ol><li>Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+allowing+an+mRNA+secondary+structure+diminishes+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+iso-1-cytochrome+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
<li>Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stabilization+of+preinitiation+complexes+by+formaldehyde+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking.</a> Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).</li>
<li>Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+distribution+of+phospholipid+hydroperoxide+glutathione+peroxidase+mRNA%3A+evidence+for+a+block+in+elongation+at+the+UGA%2Fselenocysteine+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon.</a> Rna. 6, 1573-1584 (2000).</li>
<li>Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuan%2C+HJ+%22Analysis+of+mRNA+formation+and+function%22">Analysis of mRNA formation and function</a>. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).</li>
<li>Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenocysteine+codons+decrease+polysome+association+on+endogenous+selenoprotein+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs.</a> Genes Cells. 6, 121-129 (2001).</li>
<li>Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+upstream+open+reading+frame+regulates+translation+of+GADD34+during+cellular+stresses+that+induce+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Informacje uzyskane z profilu polirybosomalnego mogą dostarczyć cennych danych na temat stanu translacyjnego komórki. Dodatkowo można określić stan montażu samych podjednostek rybosomalnych2. Na przykład obecność tzw. halfmerów lub piku 80S i większych z lekkim „barkiem” po prawej stronie profilu wskazuje na związaną podjednostkę 40S oczekującą na przyłączenie podjednostki 60S. Przeprowadzenie eksperymentu bez dodawania cykloheksymidu lub innego inhibitora elongacji pozwala na analizę szybkości odrywania się rybosomów (run off), co wskazuje, czy elongacja uległa zmianie3. Same frakcje stanowią bogate źródło materiału do późniejszego oznaczania asocjacji konkretnego mRNA lub białka z subpopulacjami rybosomalnymi za pomocą analizy Northern lub Western blotting frakcji. Całkowitą pulę mRNA związanych z aktywnymi rybosomami można określić za pomocą powiązanej analizy microarray4 lub głębokiego sekwencjonowania5. Powiązania białkowe można również stabilizować poprzez odpowiednie dodanie odczynnika sieciującego6.
Warto również wspomnieć o analizie polirybosomów z komórek ssaków jako o osobnym protokole, ze względu na ewidentne trudności w ustaleniu warunków niezbędnych do uzyskania stabilnych polisomów. Systemy buforowe opisane w literaturze są bardzo zróżnicowane 7-10, w związku z czym może istnieć potrzeba optymalizacji buforu do lizy w zależności od typu komórek, lub równie prawdopodobne jest, że system buforowy nie jest tak istotny, jak skrupulatna dbałość o pracę ze świeżymi lizatami przechowywanymi w niskich temperaturach. Z naszej wiedzy nie opisano systematycznej oceny parametrów wpływających na tworzenie polisomów u ssaków.

<table><tbody><tr><td>probówka do ultrawirówki z polialomeru</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>326823</td><td>1 x 3.5 in. (25x89mm)</td></tr><tr><td>Fluorinert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>cykloheksymida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7698</td><td></td></tr><tr><td>heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td>Inne szczepy sprawdzają się równie dobrze</td></tr></tbody></table>

analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Synteza białek jest złożonym procesem komórkowym regulowanym na wielu poziomach. Na przykład globalna translacja może zostać zahamowana w fazie inicjacji lub elongacji przez różne stresy komórkowe, takie jak głodzenie aminokwasowe lub odstawienie czynników wzrostu. Z drugiej strony, translacja poszczególnych cząsteczek mRNA może być regulowana poprzez lokalizację mRNA lub obecność komplementarnych mikroRNA. W badaniach nad syntezą białek często wykorzystuje się analizę polirybosomów, aby wyjaśnić mechanizmy regulacji translacji lub defekty syntezy białek. W tym teście kompleksy mRNA/rybosom są izolowane z komórek eukariotycznych. Gradient gęstości sacharozy oddziela cząsteczki mRNA związane z wieloma rybosomami, znane jako polirybosomy, od cząsteczek mRNA związanych z pojedynczym rybosomem, czyli monosomem. Frakcjonowanie gradientów umożliwia izolację i ilościowe oznaczenie różnych populacji rybosomalnych oraz związanych z nimi mRNA lub białek. Różnice w stosunku polirybosomów do monosomów w określonych warunkach mogą wskazywać na defekty w inicjacji translacji lub w jej elongacji/terminacji. Analiza mRNA obecnego we frakcjach polirybosomalnych może wykazać, czy zestaw poszczególnych mRNA podlegających translacji zmienia się w zależności od warunków doświadczalnych. Ponadto montaż rybosomów można monitorować poprzez analizę pików małej i dużej podjednostki rybosomalnej, które są również rozdzielane przez gradient. W tym filmie przedstawiamy metodę przygotowania surowych ekstraktów rybosomalnych z komórek drożdży, rozdział ekstraktu za pomocą gradientu sacharozy oraz interpretację wyników. Procedura ta jest łatwo adaptowalna do komórek ssaków.

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Synteza białek to złożony proces komórkowy, który jest regulowany na wielu poziomach. Na przykład globalna translacja może zostać zahamowana w fazie inicjacji ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie i porównanie frakcji monosomów oraz polirybosomów z lizatów komórkowych. W tym celu w pierwszej kolejności należy przeprowadzić hodowlę odpowiednich komórek. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie lizatu komórkowego.Trzecim krokiem procedury jest centryfugowanie lizatu w gradiencie sacharozy. Ostatnim etapem procedury jest frakcjonowanie gradientu i wizualizacja różnych populacji rybosomów za pomocą śladu UV. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zmiany w translacji w różnych warunkach eksperymentalnych poprzez analizę profilu polirybosomów.Witajcie, jestem Anthony Esposito z laboratorium dr Terry Goss Kinsey w katedrze genetyki molekularnej, mikrobiologii i immunologii na UMD oraz w J Robert Wood Johnson Medical School. A ja jestem Marcus Lewis, również z laboratorium dr Kinsey tutaj w R-W-J-M-S.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy poliribosomów. W naszym laboratorium stosujemy tę metodę do badania zmian w syntezie białek wynikających z mutacji lub czynników środowiskowych. Zacznijmy zatem. Sacharoza.Gradienty należy przygotować dzień przed użyciem, aby stały się ciągłe. Wymieszać odpowiednie objętości roztworów stokowych sacharozy 7% i 47%, aby otrzymać 48 ml każdego z następujących stężeń sacharozy: 7%, 17%, 27%, 37% oraz 47%. Do każdego roztworu sacharozy dodać 1 M DTT do stężenia końcowego 1 mM. Aby wylać gradienty, należy przymocować pipetę Pasteura do strzykawki 20 ml, zabezpieczając i uszczelniając połączenie folią Parafilm.Do dna probówki do ultrawirówki z poliameru o wymiarach 1 cal na 3,5 cala dodaj siedem mililitrów 7% sacharozy. Następnie, pod warstwę 7% roztworu dodaj siedem mililitrów 17% roztworu sacharozy, umieszczając końcówkę pipety w pobliżu dna probówki i pipetując powoli. Wlewanie każdej warstwy powinno zająć nie mniej niż 20 sekund.Powtórz procedurę, używając po siedmiu mililitrów roztworów sacharozy o stężeniach 27%, 37% oraz 47%, gdy gradient zostanie utworzony. Powinny być widoczne wyraźne linie między warstwami, co wskazuje na minimalne mieszanie. Przechowuj wszystkie gradienty w temperaturze czterech stopni Celsius overnight, wraz z rotorami, butelkami i probówkami, które zostaną wykorzystane do pobierania próbek.Aby przygotować ekstrakty z komórek drożdży, należy rozpocząć od wyhodowania 100 25 ml kultury drożdży do OD 600 wynoszącej od 0,8 do 1. Do kultury należy dodać cykloheksymid do stężenia końcowego 100 µg/ml i kontynuować inkubację z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez 15 minut. Po 15 minutach kulturę należy przelać do butelki wirówkowej o pojemności 250 ml i otoczyć lodem.Od tego momentu wszystkie próbki należy utrzymywać w lodzie; odwiruj z prędkością 8 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Resuspenduj osad w 10 ml schłodzonego w lodzie buforu lizującego i przenieś do polipropylenowych probówek o pojemności 15 ml. Odwiruj z prędkością 5 900 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C; resuspenduj.Resuspend osad w 0,5 ml buforu do lizy. Przenieś zawiesinę do probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie dodaj 0,5 ml schłodzonych, wypalanych i przemytych kwasem szklanych kulek. Homogenizuj komórki za pomocą wstrząsarki vortex w czterech 32-sekundowych interwałach, chłodząc probówkę na lodzie przez 30 sekund pomiędzy każdym z nich.Następnie do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml należy dodać kolejne 0,5 ml buforu lizującego i wirować z prędkością 5 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Należy przenieść nadsącz do nowej probówki mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i wirować z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Na koniec przenieś nadsącz do nowej probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1.5 ml. Ekstrakt można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeniesienia lizatu na gradient sacharozy. Przystaw końcówkę pipety do ścianki probówki w pobliżu powierzchni gradientu i delikatnie nanieś lizat na wierzch gradientu.W przypadku gradientu o objętości 35 ml zazwyczaj nakłada się 500 µl lizatu. Używając pęsety, ostrożnie umieść gradient w koszyku rotora z koszyczkami wahadłowymi. Wiruj gradienty przy 100 000 ×g przez cztery godziny w temperaturze 4 °C.Około 30 minut przed zakończeniem czterogodzinnego wirowania należy przymocować igłę do nakłuwacza probówek, a piórko do monitora absorbancji i fluorescencji online. Włączyć zasilanie monitora absorbancji, aby umożliwić osiągnięcie stabilnej linii bazowej przed analizą próbek.Elektroniczny zapis profilu PolyZone można łatwo uzyskać w czasie rzeczywistym, podłączając jednostkę akwizycji danych DI 1 48 U. W przypadku rejestratoru wykresów, należy napełnić pompę strzykawkową 50 mililitrów florin nuts, korzystając z ustawienia szybkiego przepływu wstecznego. Należy upewnić się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza.Podłącz wąż z analitycznej strzykawki do nakłuwacza rurek. Następnie krótko uruchom przepływ Floinert z prędkością 6 ml/min w kierunku w przód. Aby usunąć pęcherzyki powietrza z węża, umieść serię probówek pod wężem na wylocie celi przepływowej, aby zebrać odpływ próbki.Przygotować wiaderko z lodem z wcześniej uformowanym wgłębieniem do umieszczenia probówki wirówkowej zawierającej gradient sacharozy. Po zakończeniu czterogodzinnego wirowania ostrożnie wyjąć probówki wirówkowe z rotora wirówki i umieścić je w lodzie, dbając o to, aby nie zakłócić gradientów.Aby przeanalizować ekstrakty komórkowe, należy umieścić probówkę z gradientem na nakłuwaczu do probówek, podłączyć górną część probówki do wylotu i zabezpieczyć połączenie. Podnieść dolną platformę do probówki wirówkowej tak, aby igła przebiła dno probówki. Rozpocząć przepływ Florin alert w kierunku w przód z prędkością 6 ml/min.Gdy eluat zacznie wpływać do probówki, należy monitorować ruch wskazówki na monitorze absorbancji UV w trybie online. W momencie, gdy wskazówka zacznie się poruszać, należy włączyć przesuw zapisu, ustawiając prędkość na 60. Po osiągnięciu końca profilu polirybosomów należy odciąć dopływ Flo inert do probówki wirówki i zatrzymać przesuw zapisu na monitorze fluorescencji i absorbancji.Wycofaj Flo inert z probówki wirówkowej do strzykawki, uruchamiając przepływ w kierunku odwrotnym z dużą prędkością, dbając o to, aby nie zassać sacharozy z probówki do strzykawki. Odkręć probówkę wirówkową od nakłuwacza, opuść igłę i wyjmij probówkę. Tutaj przedstawiono reprezentatywny zapis ekstraktu rybosomalnego przygotowanego z drożdży w obecności cykloheksymidu.Wskazano piki absorbancji UV odpowiadające polirybosomom oraz rybosomom 60 s i 40 s. Właśnie przedstawiliśmy sposób przeprowadzania analizy polirybosomów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko, utrzymując próbki w niskiej temperaturze i chroniąc RNA przed degradacją.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza profilu polirybosomow eukariotycznych

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Ogólnym celem techniki profilowania polisomów jest analiza aktywności translacyjnej poszczególnych mRNA lub transkryptomu mRNA podczas syntezy białek. Metoda ta jest ważna dla badań nad regulacją syntezy białek, aktywacją i represją translacji w zdrowiu i wielu chorobach człowieka.

Profilowanie polisomów w Leishmania, komórkach ludzkich i jądrach myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Poznaj metodę profilowania polirybosomów w komórkach eukariotycznych przy użyciu frakcjonowania gradientem sacharozy. Technika ta umożliwia analizę regulacji translacji i dynamiki rybosomów w różnych warunkach eksperymentalnych.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Przeglądaj więcej filmów