Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych
15 czerwca 2010
Ten artykuł opisuje protokół ekstrakcji translujących rybosomów z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy przez frakcjonowanie gradientu sacharozy, aby umożliwić analizę różnych populacji rybosomów. W związku z tym metoda ta jest złotym standardem w badaniu regulacji tłumaczenia.
Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie i porównanie frakcji strefy mono i polirybosomów z lizatów komórkowych. Osiąga się to poprzez najpierw hodowlę komórek będących przedmiotem zainteresowania. Drugim etapem zabiegu jest przygotowanie lizatu komórkowego.
Trzecim etapem procedury jest odwirowanie lizatu przez gradient sacharozy. Ostatnim etapem procedury jest frakcjonowanie gradientu i wizualizacja różnych populacji rybosomów za pomocą śladu UV. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany w translacji w różnych warunkach eksperymentalnych poprzez analizę profilu polirybosomów.
Cześć, nazywam się Anthony Esposito i pracuję w laboratorium dr Terry'ego Gossa Kinseya na wydziale genetyki molekularnej, mikrobiologii i immunologii w UMD i J Robert Wood Johnson Medical School. A ja nazywam się Marcus Lewis. Również z McKinsey Lab tutaj w R-W-J-M-S.
Dzisiaj pokażemy Ci procedurę analizy polirybosomów. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania zmian i syntezy białek, które wynikają z mutacji lub czynników środowiskowych. Więc zacznijmy. Sacharoza.
Gradienty należy przygotować na jeden dzień przed użyciem, aby gradienty stały się ciągłe. Wymieszaj odpowiednie objętości 7% i 47% roztworów podstawowych sacharozy, aby uzyskać 48 mililitrów każdego z następujących stężeń sacharozy: 7%17%27%37% i 47%Dodaj jeden molowy DTT do każdego roztworu sacharozy, aby uzyskać końcowe stężenie jednego milimola. Aby wlać gradienty, przymocuj pipetę do makaronu do 20-mililitrowej strzykawki, zabezpieczając i uszczelniając folią para.
Dodaj siedem mililitrów 7% sacharozy na dno ultra probówki wirówkowej poly aamer o wymiarach 1 cal na 3,5 cala. Następnie dodaj siedem mililitrów 17% roztworu sacharozy pod 7% roztwór, powoli umieszczając końcówkę pipety do makaronu w pobliżu dna pipety probówkowej. Wylanie każdej warstwy powinno zająć nie mniej niż 20 sekund.
Powtórz z siedmioma mililitrami po 27%37% i 47% roztworów sacharozy, gdy gradient zostanie znudzony. Należy zauważyć wyraźne linie między warstwami wskazujące, że nastąpiło minimalne mieszanie. Przechowuj wszystkie nachylenia o czterech stopniach Celsjusza przez noc, wraz z wirnikami, butelkami i rurkami, które będą używane do pobierania próbek.
Aby przygotować ekstrakty z komórek drożdży, zacznij od wyhodowania stu 25 mililitrów kultury drożdży do OD 600 0,8 do jednego. Dodaj cyclo heide do kultury do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr i kontynuuj wstrząsanie w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po 15 minutach wlej kulturę do 250-mililitrowej butelki wirówki i napełnij lodem.
Od tego momentu trzymaj wszystko na lodzie w wirówce na poziomie 8 000 razy grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Resus, zawiesić granulat w 10 mililitrach lodu, zimną lizę, bufor i przenieść do 15-mililitrowych probówek polipropylenowych. Wirować w temperaturze 5 900 razy większej niż grawitacja przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zawiesić osad w 0,5 mililitra buforu do lizy. Przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej rurki mikro fuge, a następnie dodaj 0,5 mililitra schłodzonych, pieczonych szklanych kulek mytych kwasem. Wiruj komórki przez cztery 32. interwały, wywołując rurkę na lodzie przez 30 sekund między każdym interwałem.
Następnie dodaj kolejne 0,5 mililitra buforu do lizy do 1,5-mililitrowej wirówki probówkowej 5,000 razy. Grawitacja przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Przenieś supernatant do nowej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i wiruj z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Na koniec przenieś supinat do nowej 1,5-mililitrowej rurki mikro centri. Ekstrakt można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu przeniesienia lizatu do gradientu sacharozy. Przyłóż końcówkę pipety do ścianki probówki w pobliżu powierzchni gradientu i delikatnie nałóż lizat na wierzch gradientu.
W przypadku gradientu 35 mililitrów zwykle ładuje się 500 mikrolitrów lizatu. Za pomocą kleszczy ostrożnie opuść nachylenie do wiadra wahadłowego wirnika łyżki. Odwiruj gradienty przy 100 000 razy grawitacji przez cztery godziny w czterech stopniach Celsjusza.
Około 30 minut przed zakończeniem czterogodzinnego wirowania. Przymocuj igłę do przekłuwacza rurki i podłącz pióro do monitora fluorescencji absorbancji online. Włącz zasilanie monitora absorbancji, aby umożliwić osiągnięcie stabilnej linii podstawowej przed analizą próbek.
Elektroniczną akwizycję profilu PolyZone można łatwo uzyskać w czasie rzeczywistym poprzez dołączenie jednostki akwizycji danych DI 1 48 U. Do rejestratora wykresów, napełnij pompę strzykawkową 50 mililitrami nakrętek florina, używając szybkiego ustawienia przepływu wstecznego. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
Podłącz wąż od strzykawki do przekłuwacza rurek. I na krótko włącz przepływ Flo obojętnego z prędkością sześciu mililitrów na minutę w kierunku do przodu. Aby oczyścić wąż z pęcherzyków powietrza, umieść szereg rurek pod wężem na końcu komory przepływowej, aby zebrać spływającą próbkę.
Przygotuj wiadro na lód z wstępnie uformowaną studzienką do przechowywania probówki wirówkowej zawierającej gradient sacharozy. Po zakończeniu czterogodzinnego wirowania ostrożnie wyjmij probówki wirówkowe z wirnika wirówki i umieść je na lodzie. Uważaj, aby nie zakłócić nachylenia.
Aby przeanalizować ekstrakty komórkowe, umieść rurkę gradientową na przebijaczu rurki i podłącz górną część rurki do wylotu i zabezpiecz. Podnieś dolny stopień do probówki wirówkowej tak, aby igła przebiła dno probówki. Rozpocznij przepływ alertu Florina w kierunku do przodu z prędkością sześciu mililitrów na minutę.
Gdy rowek zacznie spływać do probówki, monitoruj ruch igły na monitorze absorpcji UV online. Gdy igła zacznie się poruszać, włącz ruch wykresu do ustawienia prędkości 60. Po osiągnięciu końca profilu polirybosomu należy wyłączyć przepływ obojętnego Flo do probówki wirówkowej i zatrzymać ruch wykresu na monitorze fluorescencji absorbancji.
Wciągnąć obojętny płyn Flo z probówki wirówkowej do strzykawki, rozpoczynając przepływ w odwrotnym kierunku z dużą szybkością, uważając, aby nie wciągnąć sacharozy z probówki do strzykawki. Odkręć probówkę wirówkową od przebijacza do probówki, opuść igłę i wyjmij probówkę. Reprezentatywny ślad ekstraktu rybosomu przygotowanego z drożdży w obecności cyclo heide pokazano tutaj.
Wskazywane są piki absorbancji UV zawierające polirybosomy oraz rybosomy A TS 60 s i 40 s. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić analizę polirybosomów Podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o szybkiej pracy, utrzymywaniu próbek w niskiej temperaturze i wolnych od RNA.
Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych, umożliwiający analizę różnych populacji rybosomalnych. Metoda polega na rozdziale rybosomów na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co jest kluczowe dla badania regulacji translacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Genetyka
Wprowadzenie
- Zrozumienie funkcji rybosomów jest kluczowe dla badania syntezy białek.
- Profilowanie polirybosomów dostarcza informacji na temat regulacji translacji.
- Techniki ekstrakcji rybosomów stanowią fundament badań w biologii molekularnej.
- Czynniki środowiskowe oraz mutacje mogą zmieniać syntezę białek.
Cel badania
- Aby wyodrębnić i porównać frakcje monorybosomów i polirybosomów z lizatów komórkowych.
- Aby zwizualizować różne populacje rybosomów za pomocą pomiaru absorbancji UV.
- Aby analizować zmiany w translacji w różnych warunkach eksperymentalnych.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek eukariotycznych i przygotowanie lizatów komórkowych.
- Wirowanie w gradiencie sacharozy.
- Frakcjonowanie gradientu w celu wyizolowania populacji rybosomalnych.
- Wizualizacja profili rybosomalnych przy użyciu monitorowania absorbancji UV.
Główne wyniki
- Skuteczna separacja monosomów i polirybosomów.
- Wyraźna wizualizacja populacji rybosomalnych za pomocą detekcji UV.
- Analiza regulacji translacji w różnych warunkach.
- Wnioski dotyczące wpływu mutacji na syntezę białek.
Wnioski
- Protokół ten stanowi złoty standard w badaniach nad regulacją translacji.
- Umożliwia on badaczom efektywną analizę dynamiki rybosomalnej.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia molekularnych mechanizmów translacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza profilu polirybosomów umożliwia zespołom biofarmaceutycznym badanie mechanizmów kontroli translacji oraz wykrywanie defektów w syntezie białek w krytycznych punktach zwrotnych etapu odkryć. Metoda ta dostarcza ilościowych informacji na temat translacji globalnej oraz specyficznej dla poszczególnych transkryptów, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i redukcję ryzyka mechanistycznego. Jej adaptowalność do różnych systemów eukariotycznych zapewnia szeroką przydatność dla portfela wczesnych etapów B+R oraz badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę regulacji translacji w warunkach zaburzeń genetycznych lub środowiskowych.
- Wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka poprzez rozróżnienie defektów inicjacji od defektów elongacji/terminacji.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez kwantyfikację zmian w stosunku polirybosomów do monosomów.
- Stanowi platformę do oceny wpływu potencjalnych interwencji na syntezę białek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe odczyty zaangażowania rybosomalnego w celu standaryzacji testu.
- Umożliwia powtarzalne frakcjonowanie i detekcję populacji rybosomalnych w oparciu o UV.
- Przygotowuje ekstrakty biologiczne odpowiednie dla dalszych etapów analizy mRNA lub białek.
- Wspiera screening związków modulujących aparat translacyjny lub szlaki regulacyjne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie odkrywania biomarkerów translacyjnych z mechanistycznym wglądem w regulację syntezy białek.
- Zapewnia ciągłość przejścia od modeli komórkowych do systemów przedklinicznych poprzez adaptację protokołów dla różnych gatunków eukariotów.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, ujawniając defekty translacyjne powiązane z modelami chorób.
- Zapewnia kontekst mechanistyczny dla fenotypów zaobserwowanych w badaniach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Profilowanie polirybosomów wpisuje się w kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając analizę translacji w oparciu o postawione hipotezy, co wspiera zarówno walidację celów, jak i identyfikację związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa wydajność translacji i wyjaśnia specyficzne dla danej ścieżki mechanizmy regulacyjne.
- Przesiewanie: Oferuje solidne, ilościowe frakcjonowanie oraz wyniki absorbancji UV w celu przygotowania do analizy.
- Analityka: Umożliwia pomiar ilościowy populacji rybosomów w czasie rzeczywistym do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy modele komórkowe i przedkliniczne poprzez umożliwienie adaptacji protokołów i dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma dla różnorodnych badań translacyjnych i mechanistycznych w ramach programów B&R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad kontrolą translacji.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy ekstrakcji, frakcjonowania i detekcji w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez ujawnianie wąskich gardeł translacyjnych i umożliwianie efektywnego kosztowo triażu portfela projektów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli z uwzględnieniem ryzyka na podstawie wierności translacyjnej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biologii rybosomów oraz technik frakcjonowania gradientowego.
- Wymagany jest dostęp do ultracentryfugi oraz aparatury do pomiaru absorbancji UV.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do systemów drożdżowych i ssaczych poprzez wprowadzenie niezbędnych modyfikacji protokołu.
- Integralność próbek oraz warunki wolne od RNaz są krytyczne dla uzyskania wiarygodnych wyników.
