Name: Wybór aptamerów dla białka amyloidu β, czynnika wywołującego chorobę Alzheimera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Poznaj metodę selekcji aptamerów RNA wiążących białko amyloidu β związane z chorobą Alzheimera. Technika SELEX umożliwia uzyskanie cząsteczek o wysokiej specyficzności do celu białkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty AG030709 z NIH/NIA oraz 07-65798 z Departamentu Zdrowia Publicznego Kalifornii (California Department of Public Health). Dziękujemy Margaret M. Condron za syntezę peptydów i analizę aminokwasów, dr Elizabeth F. Neufeld za pomoc i wsparcie w początkowych etapach projektu, dr Chi-Hong B. Chen za zapewnienie wsparcia i odczynników oraz dr Andrew D. Ellington za pomocne dyskusje.

<ol><li>Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnostics+and+therapeutics+for+Alzheimer%27s+disease-how+early+can+we+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Neurother%22%5BJournal%5D)">Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there.</a> Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).</li>
<li>Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+early+detection+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the early detection of Alzheimer's disease.</a> Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).</li>
<li>Kawas, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Early Alzheimer's disease.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B2-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shifts+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%3A+the+emerging+role+of+oligomeric+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies.</a> J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+pre-fibrillar+protein+assemblies+in+Alzheimer%27s+disease+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Alzheimer+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders.</a> Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+therapeutics+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).</li>
<li>Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+specifically+interact+with+the+prion+protein+PrP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP.</a> J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).</li>
<li>Bibby, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+novel+in+vitro+selection+technique+to+isolate+and+characterise+high+affinity+DNA+aptamers+binding+mammalian+prion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins.</a> J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).</li>
<li>Rhie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+2%27-fluoro-RNA+aptamers+that+bind+preferentially+to+disease-associated+conformations+of+prion+protein+and+inhibit+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion.</a> J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).</li>
<li>King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioaptamer+interactions+with+prion+proteins%3A+sequence-specific+and+non-specific+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites.</a> J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Proske, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-protein-specific+aptamer+reduces+PrPSc+formation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation.</a> ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).</li>
<li>Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-bovine+prion+protein+RNA+aptamer+containing+tandem+GGA+repeat+interacts+both+with+recombinant+bovine+prion+protein+and+its+%CE%B2+isoform+with+high+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity.</a> Prion. 2, 73-80 (2008).</li>
<li>Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+formation+by+recombinant+full-length+prion+proteins+in+phospholipid+bicelle+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions.</a> J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).</li>
<li>Bunka, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+RNA+aptamers+specific+for+amyloid+fibril+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes.</a> J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).</li>
<li>Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+RNA+aptamers+to+the+Alzheimer%27s+disease+amyloid+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+generated+against+oligomeric+A%CE%B240+recognize+common+amyloid+aptatopes+with+low+specificity+but+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity.</a> PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heregulin+signaling+by+an+aptamer+that+preferentially+binds+to+the+oligomeric+form+of+human+epidermal+growth+factor+receptor-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).</li>
<li>Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+DS+%22Lab+math%3A+a+handbook+of+measurements%2C+calculations%2C+and+other+quantitative+skills+for+use+at+the+bench%22">Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+developed+for+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Methods developed for SELEX.</a> Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).</li>
<li>Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+selected+against+amyloid+%CE%B2-peptide+%28A%CE%B2%29+inhibit+the+aggregation+of+A%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ.</a> Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Punktem wyjścia procesu SELEX jest synteza losowej biblioteki oligonukleotydów zawierającej zazwyczaj od 1012 do 1015 sekwencji. W przypadku DNA SELEX biblioteka ta jest wykorzystywana bezpośrednio po wygenerowaniu puli ssDNA, natomiast w RNA SELEX, zaprezentowanym tutaj, biblioteka ssDNA jest najpierw konwertowana enzymatycznie na pulę RNA poprzez transkrypcję in-vitro. Następnie SELEX jest przeprowadzany iteracyjnie, przy czym każdy cykl obejmuje ekspozycję i wiązanie oligonukleotydów z z...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>Laboratorium Biopolimerów UCLA</td><td></td><td>Proszek liofilizowany</td></tr><tr><td>Automatyczna mikrowaga MX5 Automated-S</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki o pojemności 1,6 ml powlekane silikonem</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 lub C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Stosować w dygestorium.</td></tr><tr><td>Persiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Mieszać w wstrząsarku wirówkowym (vortex) do czasu uzyskania klarownego roztworu. APS należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem i wykorzystać w ciągu 48 h.</td></tr><tr><td>Heksahydrat dichlorotris(2,2'-bipirydylo)rutenu(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Wymieszaj w wstrząsarce wirowej (vortex), aż roztwór stanie się klarowny. Przykryj probówkę z RuBpy folią aluminiową, aby chronić odczynnik przed światłem otoczenia. RuBpy należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem i wykorzystać w ciągu 48 h.</td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Salt&amp;#8482; Excellulose&amp;#8482; kolumny do odsalania</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>probówki o pojemności 0,6 ml z powłoką silikonową</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Żele Novex Tricine (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10-dołkowa; rozmiar mini (8 cm x 8 cm); 25 &amp;#x03BC;objętość nakładania na dołek; zakres rozdziału od 5 kDa do 40 kDa</td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>spektrofotometr Beckman DU 640</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>biblioteka ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Zamawiane na specjalne zamówienie</td><td>Bibliotekę zaprojektowano tak, aby zawierała 49 losowych nukleotydów flankowanych przez dwa regiony stałe zawierające miejsca wiązania starterów oraz miejsca klonowania: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; 5'-TCC GTT CGG GAT CCT-3'&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>polimeraza DNA Taq</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>Rekombinowany &lt;em&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; polimeraza DNA dostarczona w ilości 10&amp;#215; bufor do PCR oraz oddzielna probówka z 25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; do rutynowej reakcji PCR.</td></tr><tr><td>Mieszanina nukleotydów do PCR, roztwór 10 mM</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(po 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>Starter forward</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Zamówione na specjalne zamówienie</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Starter odwrotny</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Zamawiane na specjalne zamówienie</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAquick PCR Purification Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki stożkowe o pojemności 1,6 ml z nakrętkami z uszczelkami typu O-ring</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; System wielkoskalowej produkcji RNA&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>Zestaw zawiera: 120 &amp;#x03BC;Mieszanina enzymów (polimeraza RNA, rekombinowana RNazyna)&amp;#174; inhibitor rybonukleazy i rekombinowana nieorganiczna pirofosfataza); 240 &amp;#x03BC;bufor do transkrypcji 5; 100 &amp;#x03BC;każdy z 4 rNTP, 100 mM; 110 j. RQ1 DNase wolnej od RNaz, 1 j./&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;liniowy kontrolny DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M octanu sodu (pH 5,2); 1,25 ml wody wolnej od nukleaz</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-cytydyna 5&amp;rsquo;-trifosforan, 250 &amp;mu;Ci (9,25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>Aktywność właściwa: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM tricyny (pH 7,6)</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy nasycony cytrynianem (125:24:1, pH 4,7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:alkohol izoamylowy (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Etanol bezwodny do biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>chłodząca mikrocentryfuga Z216-MK</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; Mikrokolumny G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>Zakupiono w Fisher Scientific (45-001-487)</td><td>Wypełnione Sephadexem&amp;#8482; G-50 klasy DNA, uprzednio równoważony w buforze STE zawierającym 0,15% Kathonu jako biocydu</td></tr><tr><td>Blatowy licznik scyntylacyjny Triathler</td><td>Hidex Oy, Turku, Finlandia</td><td>Model Triathler LSC: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; bufor do próbek TBE-mocznik (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>Żele 6% TBE-mocznikowe 1,0 mm, 10 studzienek</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; Bufor do elektroforezy TBE (5x)&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>Dekontaminant radioaktywny</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do nakładania próbek na żel</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-komórka</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-komórka</td></tr><tr><td>Kalka autoradiograficzna</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>Stosować w całkowitej ciemności</td></tr><tr><td>Film do autoradiografii, Hyperfilm&amp;#8482; ECL (elektrochemiluminescencja)</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>Można stosować w czerwonym świetle ochronnym.</td></tr><tr><td>Dyski membranowe</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>mieszane estry celulozy, hydrofilowe, 0,22-&amp;#x03BC;membrany m-disc</td></tr><tr><td>Szklana podstawa z fritem do kolby o pojemności 125 ml</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol do biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor RNazy</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;System odwrotnej transkrypcji</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany inhibitor RNazy</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; Barwnik do nakładania próbek</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby alzheimera

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującym, zależnym od wieku zaburzeniem neurodegeneracyjnym o podstępnym przebiegu, co utrudnia jej diagnozę przedobjawową1. Rozpoznanie AD można postawić z całkowitą pewnością jedynie pośmiertnie, dlatego ustanowienie przedobjawowej, wczesnej diagnostyki AD jest kluczowe dla opracowania i wdrażania skutecznych terapii2,3.
Białko amyloidu β (Aβ) odgrywa centralną rolę w patogenezie AD. Uważa się, że rozpuszczalne, oligomeryczne kompleksy Aβ wpływają na neurotoksyczność leżącą u podstaw dysfunkcji synaptycznej i utraty neuronów w AD4,5. Opisano różne formy rozpuszczalnych kompleksów Aβ, jednak ich wzajemne relacje oraz znaczenie dla etiologii i patogenezy AD są złożone i nie do końca poznane6. Specyficzne narzędzia rozpoznawania molekularnego mogą pomóc w wyjaśnieniu zależności między kompleksami Aβ oraz ułatwić wykrywanie i charakteryzację tych struktur na wczesnym etapie przebiegu choroby, zanim pojawią się objawy. Rozpoznawanie molekularne opiera się zazwyczaj na przeciwciałach. Jednak alternatywna klasa narzędzi rozpoznawania molekularnego, aptamery, oferuje istotne zalety w porównaniu z przeciwciałami7,8. Aptamery są oligonukleotydami generowanymi w drodze selekcji in-vitro: systematycznej ewolucji ligandów poprzez wykładnicze wzbogacanie (SELEX)9,10. SELEX jest procesem iteracyjnym, który podobnie jak ewolucja darwinowska, pozwala na selekcję, amplifikację, wzbogacanie i utrwalanie określonej właściwości, np. silnego i specyficznego wiązania ligandu (aptamery) lub aktywności katalitycznej (rybozymy i DNAzymy).
Mimo pojawienia się aptamerów jako narzędzi w nowoczesnej biotechnologii i medycynie11, były one niedostatecznie wykorzystywane w dziedzinie badań nad amyloidami. Niewiele aptamerów RNA lub ssDNA wyselekcjonowano przeciwko różnym formom białek prionowych (PrP)12-16. Wykazano, że aptamer RNA wytworzony przeciwko rekombinowanemu bydlęcemu PrP rozpoznaje bydlęce PrP-β17, czyli rozpuszczalny, oligomeryczny, bogaty w struktury β-kartki wariant konformacyjny pełnowymiarowego PrP, który tworzy włókna amyloidowe18. Stwierdzono, że aptamery wytworzone przy użyciu monomerycznej i kilku form włóknistych β2-mikroglobuliny (β2m) wiążą włókna niektórych innych białek amyloidogennych poza włóknami β2m19. Ylera et al. opisali aptamery RNA wyselekcjonowane przeciwko unieruchomionemu monomerycznemu Aβ4020. Co nieoczekiwane, aptamery te wiązały włókniste Aβ40. Wszystkie te dane rodzą kilka istotnych pytań. Dlaczego aptamery wyselekcjonowane przeciwko białkom monomerycznym rozpoznawały ich formy polimeryczne? Czy możliwe jest uzyskanie aptamerów przeciwko formom monomerycznym i/lub oligomerycznym białek amyloidogennych? Aby odpowiedzieć na te pytania, podjęliśmy próbę selekcji aptamerów dla kowalencyjnie stabilizowanych oligomerów Aβ4021, wytworzonych przy użyciu fotostymulowanego sieciowania niezmodyfikowanych białek (PICUP)22,23. Podobnie jak w poprzednich badaniach17,19,20, aptamery te reagowały z włóknami Aβ oraz kilkoma innymi białkami amyloidogennymi, prawdopodobnie rozpoznając potencjalnie wspólny strukturalny aptatop amyloidowy21. W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię SELEX wykorzystaną do produkcji tych aptamerów21.

Aptamery to krótkie oligonukleotydy rybo- lub deoksyrybonukleinowe, wyselekcjonowane metodami ewolucji in-vitro na podstawie powinowactwa do konkretnego celu. Aptamery są narzędziami rozpoznawania molekularnego o wszechstronnych zastosowaniach terapeutycznych, diagnostycznych i badawczych. Prezentujemy metody selekcji aptamerów przeciwko białku amyloid β, czynnikowi sprawczemu choroby Alzheimera.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą, zależną od wieku dysfunkcją neurodegeneracyjną o podstępnym przebiegu, co sprawia, że jej diagnoza presymptomatyczna ...

Ogólnym celem eksperymentów selekcyjnych jest wyłonienie cząsteczek RNA, które wiążą się swoiście i z wysokim powinowactwem do białka docelowego w procesie RNA Selects. Osiąga się to poprzez transkrypcję in vitro RNA z biblioteki losowych oligonukleotydów DNA, a następnie inkubację puli transkrybowanego RNA z białkiem docelowym. W drugim kroku stosuje się wiązanie z filtrem.Pozwala to na oddzielenie RNA wiążącego się z celem od puli RNA niewiążącego. Następnie cząsteczki RNA wiążącego się z celem poddawane są odwrotnej transkrypcji do D-N-A, amplifikacji metodą P-C-R oraz ponownej transkrypcji do RNA.Ta pula RNA, która jest obecnie wzbogacona o niektóre wiążące aberracje, jest wykorzystywana do wiązania z celem w kolejnym cyklu selekcji. Zazwyczaj po ośmiu do 20 cyklach wyselekcjonowane i scharakteryzowane zostają aptamery o wysokim powinowactwie, specyficzne dla celu. Witajcie, jestem gal bean z Katedry Neurologii na UCLA, dzisiaj, far rahimi.Starszy stażysta postdoc w moim laboratorium zademonstruje proces zwany cellex. Wykorzystywaliśmy ten proces w laboratorium do selekcji przeciwciał przeciwko oligomerom beta-amyloidu. Zatem zacznijmy.Zapraszamy do zapoznania się z materiałem.

selection-aptamers-for-amyloid-protein-causative-agent-alzheimer-s

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wybór Aptamerów dla Amyloidu β-Proteiny, Czynnika Powodującego Chorobę Alzheimera

Opisujemy technikę przygotowania klarownych homogenatów kory mózgu człowieka, rozdziału białek metodą SDS-PAGE, odsłaniania antygenów oraz immunoblottingu z użyciem przeciwciała przeciwko peptydowi Aβ. Stosując ten protokół, konsekwentnie wykrywamy monomeryczne i multimeryczne Aβ w tkance korowej pobranej od ludzi z patologią choroby Alzheimera.

Detekcja multimerów A&beta; w homogenatach tkanki kory mózgowej człowieka za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu z zastosowaniem odzyskiwania epitopu antygenu

Korzystając z mikroskopii sił atomowych w połączeniu z technologią biopanoramowania, stworzyliśmy negatywny i pozytywny system biopanowania, aby uzyskać przeciwciała przeciwko specyficznym dla choroby wariantom białek obecnym w dowolnym materiale biologicznym, nawet w niskich stężeniach.  Udało nam się uzyskać przeciwciała przeciwko wariantom białka TDP-43 zaangażowanym w stwardnienie zanikowe boczne.

Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Podczas gdy transport białek na powierzchni komórki jest stosunkowo łatwy do zbadania, wizualizacja transportu białek wewnątrzkomórkowych jest znacznie trudniejsza. Tutaj używamy konstruktów zawierających fotoaktywowany GFP i demonstrujemy metodę dokładnego śledzenia białka prekursorowego amyloidu z aparatu Golgiego do dalszych przedziałów i śledzenia jego klirensu.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego transportu APP za pomocą fotoaktywowalnego GFP

Aby zbadać efekty Aβo in vivo, opracowaliśmy model oparty na powtarzających się wlewach rozpuszczalnego Aβo z hipokampa w połączeniu z ciągłym wlewem przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych, aby przeciwdziałać neurotoksycznemu działaniu Aβo.

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

Opisany jest skrócony protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego.

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Obrazowanie molekularne z laserową desorpcją/jonizacją wspomaganą matrycą, spektrometria mas (MALDI-IMS) pozwala na jednoczesne mapowanie wielu analitów w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykrywania i wizualizacji białka β amyloidu w tkankach mózgowych choroby Alzheimera i próbkach mózgowej angiopatii amyloidowej za pomocą MALDI-IMS.

Wizualizacja złogów β amyloidu w ludzkim mózgu za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Obecny protokół opisuje i porównuje procedurę przeprowadzania analizy całego regionu lub podregionu zainteresowania odcinków mózgu myszy strzałkowej w celu ilościowego określenia obciążenia beta-amyloidu w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera APP/PS1.

Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj metodę selekcji aptamerów RNA wiążących białko amyloidu β związane z chorobą Alzheimera. Technika SELEX umożliwia uzyskanie cząsteczek o wysokiej specyficzności do celu białkowego.

Wybór aptamerów dla białka amyloid $\beta$, czynnika sprawczego choroby Alzheimera

Przeglądaj więcej filmów