Name: Kwantyfikacja ognisk γH2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę ilościowej oceny uszkodzeń DNA za pomocą ognisk γH2AX w komórkach ludzkich po napromieniowaniu. Technika immunofluorescencji pozwala monitorować naprawę DNA i oceniać radiomodyfikatory.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Podziękowania kierujemy do Australian Institute of Nuclear Science and Engineering za udzielone wsparcie. TCK był laureatem nagród AINSE. Epigenomic Medicine Lab jest wspierane przez National Health and Medical Research Council of Australia (566559). LM otrzymuje wsparcie z Melbourne Research (University of Melbourne) oraz dodatkowych stypendiów Biomedical Imaging CRC. Nieocenioną pomocą przy realizacji tej pracy było wsparcie Monash Micro Imaging (dr Stephen Cody i dr Iśka Carmichael).

Przygotowanie komórek
<ol>
 <li>Ludzkie keratynocyty (FEP-1811) hodowano w bezz écoulkowym medium do keratynocytów (K-SFM; Invitrogen) uzupełnionym o czynnik wzrostu naskórka, ekstrakt z przysadki bydlęcej oraz 20 μg/ml gentamycyny, w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Zawiesinę pojedynczych komórek przygotowano poprzez odklejenie komórek za pomocą trypsyny-EDTA (0,05% v/v).</li>
 <li>Komórki wysiano na 8-dołkowe szkiełka z mikrokomorami Lab Tek II (10 000 komórek/dołek), a następnie inkubowano przez 3 dni w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
Naświetlanie
<ol>
 <li>Komórki nawożono na lodzie dawką 2 Gy przy użyciu źródła 137Cs (naświetlarka Gammacell 1000 Elite; Nordion International, ON, Kanada; 20,6 sekundy/Gy)</li>
 <li>Niepromieniowany kontrolny zestaw komórek oraz komórki napromieniowane dawką 2 Gy inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
 <li>Po odlaniu pożywki komórki przemyto 300μl PBS (bez Ca2+ lub Mg2+) na dołek i inkubowano na mieszalniku orbitalnym przez 5 minut.</li>
 <li>Po odlaniu buforu do każdego dołka dodano 100μl świeżo przygotowanej 4% (v/v) paraformaldehydy i inkubowano preparaty w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wszystkie inkubacje przeprowadzano w wilgotnej kuwecie do barwienia.</li>
 <li>Następnie komórki przemyto PBS (bez Ca2+ lub Mg2+). Preparaty umieszczono w słoiku Coplina i inkubowano na mieszalniku orbitalnym przez 5 minut. Krok płukania powtórzono jeszcze dwukrotnie.</li>
 <li>Bufor odlano, a nadmiar PBS delikatnie odsączono.</li>
 <li>Komórki poddano permeabilizacji, dodając 100ml Triton X-100 (0,1% v/v) na dołek i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Komórki przemyto PBS (bez Ca2+ lub Mg2+) zgodnie z opisem w krokach 3 i 4 powyżej.</li>
 <li>Niespecyficzne wiązanie białek zablokowano, dodając 100ml BSA (1% v/v) na dołek i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Po odlaniu nadmiaru BSA do każdego dołka dodano 100μl mysiego monoklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego anty-fosfo histon-H2AX (rozcieńczonego 1:500 w 1% BSA; Millipore) i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Komórki przemyto PBS (bez Ca2+ lub Mg2+) zgodnie z opisem w krokach 3 i 4 powyżej, a następnie inkubowano z 100μl przeciwciała wtórnego (Alexa Fluor 488 kozie anty-mysie IgG rozcieńczone 1:500 w 1% BSA; Invitrogen) na dołek przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. (Rozcieńczone przeciwciało przechowywano w ciemności przez cały czas trwania procedury).</li>
 <li>Komórki przemyto PBS (bez Ca2+ lub Mg2+) zgodnie z opisem w krokach 3 i 4 powyżej, jednak ekspozycję na światło ograniczono za pomocą folii.</li>
 <li>Przeciwbarwienie jąder przeprowadzono, dodając 100ml TOPRO3 (rozcieńczonego 1:500; Invitrogen) na dołek i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Komórki przemyto PBS (bez Ca2+ lub Mg2+) zgodnie z opisem w kroku 10 powyżej.</li>
 <li>Komory ostrożnie usunięto z preparatów, nadmiar wilgoci odsączono i pozostawiono preparaty do wyschnięcia na powietrzu.</li>
 <li>Do każdego dołka dodano jedną kroplę roztworu przeciwblaknięcia ProLong GOLD (Invitrogen), a następnie przykryto preparaty szkiełkami (22x50 mm) i odsączono nadmiar cieczy z krawędzi.</li>
 <li>Preparaty przechowywano w ciemności przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej przed uszczelnieniem lakierem do paznokci.</li>
 <li>Preparaty przechowywano przez noc w temperaturze 4°C w ciemności przed analizą.</li>
</ol>
Mikroskopia / Analiza
<ol>
 <li>Do pozyskiwania obrazów z wykorzystaniem standardowych laserów GFP (dla γH2AX - Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG) i dalekiej czerwieni (dla TOPRO-3) wykorzystano mikroskop konfokalny Zeiss LSM510 Meta. Zazwyczaj stosowany jest obiektyw imersyjny olejowy 63 x. Obrazy są pozyskiwane w serii Z z wielkością kroku 0.5 μm. Krok 0.5 μm wybrano w celu zminimalizowania utraty ognisk znajdujących się w różnych płaszczyznach jąder komórkowych. Podczas analizy poszczególne płaszczyzny są dekonwolwowane i nakładane na siebie w celu uzyskania obrazu z maksymalną projekcją, aby zminimalizować nakładanie się ognisk (z zastosowaniem filtra Top-hat).</li>
 <li>Do analizy liczby ognisk wykorzystano oprogramowanie Metamorph (Molecular Devices, USA). Program kwantyfikuje liczbę ognisk w każdej komórce po zastosowaniu progu odcięcia w celu wykluczenia tła. Informacje są zapisywane w arkuszu kalkulacyjnym Microsoft Excel do dalszej analizy.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Analiza uszkodzeń DNA w komórkach; obraz fluorescencyjnej mikroskopii barwienia γH2AX; grupa nieleczona vs. ekspozycja na 2 Gy." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Wizualizacja immunofluorescencyjna ognisk γH2AX (zielone) w nieleczonych ludzkich keratynocytach oraz w komórkach napromieniowanych dawką 2 Gy i inkubowanych przez kolejną 1 godzinę w 37°C, 5% CO2. DNA zabarwiono barwnikiem TOPRO-3 (niebieski). Obrazy wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510 Meta. Pas skala = 10 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, barwienie γH2AX i TOPRO-3, jądra komórkowe, uszkodzenia DNA, analiza obrazu złożonego." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Wizualizacja immunofluorescencyjna ognisk γH2AX (zielone) w ludzkich keratynocytach oraz w komórkach napromieniowanych dawką 2 Gy i inkubowanych przez kolejną 1 godzinę w 37°C, 5% CO2. Obrazy wykonano za pomocą konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 510 Meta z zastosowaniem sekcjonowania Z co 0,5 μm (1-9), aby zapewnić uchwycenie wszystkich ognisk. Obrazy zostały następnie zestawione w stosy w celu ilościowej analizy przy użyciu programu Metamorph. DNA wybarwiono TOPRO-3 (niebieski). Stosy obrazów γH2AX oraz niebieskich zostały nałożone na siebie w celu wizualizacji. Pasek skali = 10 μm.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Po ekspozycji na promieniowanie jonizujące (promienie γ), ogniska γH2AX tworzą się szybko, a ich liczba osiąga maksimum między 30 a 60 minutą2. W związku z tym zastosowany przez nas punkt czasowy 1 godziny po napromienianiu odzwierciedla początkowe powstawanie DSB. W naszym eksperymencie wykorzystaliśmy klinicznie istotną dawkę promieniowania 2 Gy. Metodę tę można jednak stosować dla dawek do 4 Gy w celu wykrycia początkowego powstawania DSB; znaczne nakładanie się ognisk uniemożliwia dokładną kwantyfikację pr...

<table><tbody><tr><td>Pożywka bezsurowicza dla keratynocytów (K-SFM)</td><td>Pożywki</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Pożywka dla keratynocytów uzupełniona rekombinowanym ludzkim czynnikiem wzrostu naskórka 1-53 (EGF 1-53) oraz ekstraktem z przysadki bydlęcej (BPE).</td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe Lab Tek lI (8-dołkowe)</td><td>Szkiełka komorowe</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>Krywki (22x50mm)</td><td>Krywki</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Seryjna albumina bydlęca (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>BSA (1%) jest stosowana do blokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe są rozcieńczane w BSA.</td></tr><tr><td>PBS (bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; i Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Trypsyna-EDTA (0,05%) stosowana do odrywania komórek od kolb hodowlanych.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1%) stosowany do permeabilizacji komórek.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Paraformaldehyd (4%) stosowany do fiksacji komórek.</td></tr><tr><td>Mysi monoklonalny przeciwciało przeciwko fosfohistonie-H2AX</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego (1:500) w 1% BSA.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało przeciwko mysiej IgG (H+L)</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Rozcieńczenie przeciwciała drugorzędowego (1:500) w 1% BSA.</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>Barwnik DNA</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>Powszechnie stosowany barwnik DNA: dihydrochlorek 4,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI). Może być używany wyłącznie z mikroskopami wyposażonymi w odpowiedni laser wzbudzający.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Roztwór przeciw Zanikaniu fluorescencji</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Współczynnik załamania światła 1,42 w 20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkanek z wentylowanym zakrętką</td><td>Kolba hodowlana</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Szalka do hodowli tkanek (150x25mm)</td><td>Szalka Petriego</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Słoik Coplina, szklany</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do barwienia</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Naświetlacz Gammacell 1000 Elite</td><td>Naświetlacz gamma</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;h2ax w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSBs), które są wywoływane przez procesy metaboliczne endogenne lub czynniki egzogenne, stanowią jedną z najpoważniejszych uszkodzeń DNA pod względem przeżycia i zachowania integralności genomu. Wczesną odpowiedzią na powstanie DSB jest fosforylacja wariantu histonu H2A, H2AX, na reszcie seryny-139 w wysoce zachowanym motywie C-terminalnym SQEY, prowadząca do powstania γH2AX1. Po wystąpieniu DSB H2AX jest szybko fosforylowany przez rodzinę białek fosfatydyloinozytolu 3-kinazy (PIKK), w tym zmienioną ataksję telangiektazję (ATM), katalityczną podjednostkę kinazy DNA-białko oraz kinazę związaną z ATM i RAD3 (ATR).2. Zazwyczaj w pęknięciu podwójnego łańcucha DNA (DSB) bierze udział tylko kilka par zasad (bp), jednak występuje znaczna amplifikacja sygnału, co wynika z ważnej roli modyfikacji chromatyny w sygnalizacji uszkodzeń DNA i ich naprawie. Fosforylacja H2AX, której głównym mediatorem jest ATM, rozprzestrzenia się na przylegające obszary chromatyny, wpływając na około 0,03% całkowitej ilości H2AX w komórce na każde pojedyncze DSB.2,3. Odpowiada to fosforylacji około 2000 cząsteczek H2AX obejmujących obszary chromatyny o długości ~2 Mbp wok&oacute;ł miejsca przerwania podw&oacute;jnej nici DNA, co prowadzi do powstawania wyraźnych ognisk γH2AX, kt&oacute;re można łatwo zwizualizować i ilościowo oznaczyć metodą mikroskopii immunofluorescencyjnej2. Ubytek γH2AX w miejscach DSB odzwierciedla naprawę, jednak istnieje pewna kontrowersja dotycząca tego, co definiuje pełną naprawę DSB; zaproponowano, że ponowne połączenie obu nici DNA jest wystarczające, ale sugerowano również, że konieczne jest przywrócenie pierwotnego stanu skondensowanego chromatyny4-8. Zanikanie γH2AX wiąże się przynajmniej częściowo z odfosforylacją przez fosfatazy, fosfatazę 2A i fosfatazę 4C5,6Dodatkowo stwierdzono udział usuwania γH2AX poprzez jego relokację z udziałem wymiany histonów z H2A.Z.7,8. Wажne jest, że ilościowa analiza ognisk γH2AX otworzyła szeroki zakres zastosowań w badaniach medycznych i jądrowych. W niniejszej pracy prezentujemy najpowszechniej stosowaną metodę immunofluorescencyjną do oceny wstępnych uszkodzeń DNA poprzez wykrywanie i ilościowe określanie ognisk γH2AX w podlegających promieniowaniu γ ludzkich keratynocytach przylegających9.

Ilościowe oznaczanie pęknięć obu nici DNA z wykorzystaniem formowania γH2AX jako markera molekularnego stało się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX po narażeniu komórek na promieniowanie.

Ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;H2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Pęknięcia obu nici DNA (DSB), wywoływane przez endogenne procesy metaboliczne lub źródła egzogenne, należą do najpoważniejszych uszkodzeń DNA...

Witajcie, jestem Ian Ma z Laboratorium Medycyny Epigenomicznej kierowanego przez dr. Toma Carisa w Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute. Obecnie przygotowuję rozprawę doktorską, która koncentruje się na wpływie promieniowania na Gamma H2AX, będący molekularnym markerem pęknięć dwuniciowych. Dzisiaj zaprezentuję eksperyment dotyczący ilościowego oznaczania Gamma H2AX w odpowiedzi na promieniowanie gamma w ludzkich keratynocytach.Niniejszy protokół immunobarwienia może być wykorzystany do monitorowania zarówno początkowych uszkodzeń DNA, jak i jego naprawy. Metoda ta jest również przydatna do oceny skuteczności potencjalnych związków modyfikujących działanie promieniowania. Na przykład radiouczulacze, od których oczekuje się zwiększenia uszkodzeń DNA, spowodują wystąpienie większej liczby ognisk gamma H2AX, podczas gdy radioprotektory wywołają efekt przeciwny, objawiający się mniejszą liczbą wykrytych ognisk ze względu na redukcję pęknięć dwuniciowych DNA.Przejdźmy teraz do eksperymentu. Komórki wykorzystane w tym doświadczeniu to ludzkie cyty, które przygotowano na szkiełkach z komorami, rozmieszczając po 10 000 komórek w każdej studience. Przed naświetlaniem szkiełka inkubowa

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilość ognisk γH2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

Analiza mikroskopowa ognisk γH2AX, które tworzą się po fosforylacji H2AX w Ser-139 w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA, stała się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy przeciwciało przeciwko monometylowanej histonie H3 w lizynie 4 jako marker epigenetyczny aktywnie transkrybowanej euchromatyny, aby ocenić przestrzenną dystrybucję powstawania indukowanych promieniowaniem ognisk γH2AX w jądrze komórkowym.

Ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$H2AX po napromieniowaniu jonizującym

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Prezentowana metoda łączy ilościową analizę pęknięć dwuniciowych DNA (DSB), dystrybucji cyklu komórkowego i apoptozy, aby umożliwić specyficzną dla cyklu komórkowego ocenę indukcji i naprawy DSB, jak również konsekwencji niepowodzenia naprawy.

Specyficzny dla cyklu komórkowego pomiar γH2AX i apoptozy po stresie genotoksycznym za pomocą cytometrii przepływowej

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół przedstawia przygotowanie preparatu i automatyczną ocenę testu ognisk γ-H2AX na limfocytach krwi obwodowej. Aby zilustrować metodę i czułość testu, izolowane limfocyty napromieniano in vitro. Ta zautomatyzowana metoda wykrywania DNA DSB jest przydatna w szybkich i wysokowydajnych zastosowaniach dozymetrii biologicznej.

Zautomatyzowana mikroskopowa metoda oceny ognisk γ-H2AX w ludzkich limfocytach krwi obwodowej

Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.

Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metodę ilościowej oceny uszkodzeń DNA za pomocą ognisk γH2AX w komórkach ludzkich po napromieniowaniu. Technika immunofluorescencji pozwala monitorować naprawę DNA i oceniać radiomodyfikatory.

Ilościowe oznaczanie ognisk γH2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Przeglądaj więcej filmów