Montowanie mózgów dorosłych Drosophila: metoda przygotowania szkiełek do obrazowania konfokalnego

- Na dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym przyklej dwa szkiełka nakrywkowe w wystarczającej odległości między nimi, aby stworzyć przestrzeń do zamontowania mózgów Drosophila. Pod mikroskopem stereoskopowym odpipetuj mózgi w pożywce montażowej w tej przestrzeni. Ujemny ładunek tkanki pomoże mózgom przylegać do dodatniego ładunku na powierzchni szkiełka.

Usuń nadmiar podłoża mocującego, aby umożliwić precyzyjne ustawienie mózgów na szkiełku w układzie siatki z płatami czułkowymi skierowanymi do góry, a następnie połącz dwa szkiełka nakrywkowe, przyklejając trzeci szkiełko nakrywkowe, aby zakryć mózgi.

Aby wypełnić ubytek, umieść pożywkę montażową po jednej kropli na raz w krawędzi ubytku i pozwól mu rozprzestrzenić się ruchem kapilarnym, aby nie przeszkadzało mózgowi.

Uszczelnij ubytek lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w ciemności, aby zachować fluorescencję poplamionych tkanek.

W przykładowym protokole zamontujemy mózgi Drosophila do konfokalnego obrazowania neuronów wybarwionych immunologicznie.

- Aby zamontować mózgi, zbuduj zjeżdżalnię mostową. Umieść dwie pokrywy dolne w odległości około jednego centymetra od siebie na dodatnio naładowanej prowadnicy. Upewnij się, że strona z dodatnim ładunkiem jest skierowana do góry. Następnie przyklej szkiełka nakrywkowe do szkiełka lakierem do paznokci i pozwól lakierowi całkowicie wyschnąć przed kontynuowaniem.

Następnie umieścić szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym i odpipetować mózgi w pożywce w przestrzeni między szkiełkami nakrywkowymi. Pamiętaj, aby dostosować oświetlenie, aby poprawić wizualizację mózgu.

Następnie zassaj dodatkowe media montażowe ze szkiełka, uważając, aby uniknąć mózgu. Następnie odchodować pozostały nadmiar nośnika montażowego. Pozwoli to na dokładniejsze ustawienie mózgów. Teraz, za pomocą kleszczy, zorientuj mózgi w siatkowy wzór z płatami czułkowymi skierowanymi do góry.

Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na mózgach i użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić krawędzie górnego szkiełka nakrywkowego, które są przymocowane do dolnych szkiełek nakrywkowych.

Teraz załaduj środkową wnękę świeżymi nośnikami montażowymi kroplami, umożliwiając wciągnięcie nośnika pod szkiełko nakrywkowe za pomocą kapilary. Gdy ubytek zostanie wypełniony, uszczelnij go całkowicie za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.