JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 3:56 min • April 30th, 2023
- U dorosłej muchy mięśnie lotu pośredniego lub IFM są największymi mięśniami muchy obejmującymi całą klatkę piersiową. IFM koordynują charakterystyczne ruchy skrzydeł o wysokiej częstotliwości u much dwuskrzydłych, w tym Drosophila. Dwie przeciwstawne grupy włókien mięśniowych składają się na IFM.
Po pierwsze, grzbietowe mięśnie podłużne lub DLM znajdują się wzdłuż środkowej płaszczyzny klatki piersiowej nad jelitem i rozciągają się od przodu do tyłu. Po drugie, mięśnie grzbietowo-brzuszne lub DVM rozciągają się od góry do dołu klatki piersiowej i są otoczone przez TDT, czyli mięsień skokowy. Obie grupy mięśni są przyczepione do naskórka.
Po około 48 godzinach od powstania poczwarki (APF) dojrzewające IFM można wizualnie zidentyfikować za pomocą prostego mikroskopu preparacyjnego. W przykładowym protokole zbierzemy IFM z poczwarek starszych niż 48 godzin APF w celu przeprowadzenia analizy o wysokiej przepustowości.
- W przypadku rozwarstwienia IFM po 48 godzinach APF użyj lekko zwilżonego pędzla, aby przenieść poczwarki na pasek dwustronnej taśmy klejącej zamontowanej na szkiełku mikroskopowym. Ustaw poczwarki w linii, brzuszną stroną do dołu i z przodu w kierunku dołu szkiełka. Kiedy wszystkie poczwarki zostaną umieszczone, użyj kleszczy, aby rozdzielić i otworzyć pierwszą obudowę poczwarki powyżej przednich przetchlink, a następnie delikatnie przesuń parę kleszczy grzbietowo w kierunku tylnym, przecinając obudowę poczwarki, gdy kleszcze się poruszają.
Uwolnić poczwarkę z otwartego etui i natychmiast przenieść poczwarkę do kropli PBS na drugim szkiełku mikroskopowym. Kiedy wszystkie poczwarki zostaną uwolnione, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć odwłok poczwarki od klatki piersiowej i wepchnij odwłok do osobnego stosu. Kiedy wszystkie klatki piersiowe zostaną usunięte, użyj kawałka bibuły, aby usunąć większość PBS i stos brzuchów.
Dodaj kroplę świeżo schłodzonego PBS do pozostałych torsów przed użyciem nożyczek do cięcia od głowy wzdłuż podłużnej osi ciała jednym ruchem, aby podzielić klatkę piersiową na pół. Kiedy wszystkie poczwarki zostaną wycięte, użyj kleszczy z numerem pięć, aby wybrać jedną z półsekcji i delikatnie włóż końcówki jednego kleszcza powyżej i poniżej środka IFM.
Trzymając nieruchomo pierwszą parę kleszczy, użyj cienkich nożyczek, aby odciąć jeden koniec IFM od naskórka i ścięgien, a następnie obróć poczwarkę o 180 stopni, aby umożliwić odcięcie drugiego końca IFM od naskórka i ścięgien. Użyj kleszczy, aby przenieść wiązkę IFM z klatki piersiowej na krawędź pęcherzyka PBS, używając napięcia wody, aby utrzymać wiązkę na miejscu.
Następnie popchnij tuszę na przeciwną stronę szkiełka i w ten sam sposób rozetnij resztę IFM. Po zebraniu wszystkich IFM użyj kleszczy numer pięć, aby usunąć wszelkie mięśnie skokowe lub fragmenty naskórka, które mogły znaleźć się w próbkach. Następnie użyj napięcia wody, aby delikatnie uchwycić wypreparowane IFM między parą kleszczy i umieść IFM w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 250 mikrolitrów schłodzonego PBS.