JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 2:38 min • April 30th, 2023
- Aby przygotować larwy Drosophila do testu z sondą cieplną, zbierz zwierzęta w pożądanym stadium rozwojowym i przenieś pojedyncze larwy na płytkę testową z cienką warstwą wody. Woda pozwala larwom na swobodne poruszanie się bez przywierania do powierzchni płytki.
Larwy Drosophila wykrywają szkodliwe bodźce termiczne za pośrednictwem wielodendrytycznych neuronów czuciowych w naskórku, zwanych nocyceptorami. Nie wystrzeliwują, dopóki nie zostanie osiągnięty pewien próg sensoryczny, taki jak potencjalnie szkodliwe wysokie temperatury.
Ustaw sondę ciepła na temperaturę, która przekroczy ten próg sensoryczny i spowoduje wyzwolenie nocyceptorów. Delikatnie dociśnij końcówkę sondy do larwy, aby zastosować ciepło. Larwa zareaguje na szkodliwą temperaturę zachowaniami termonocyceptywnymi, wycofując się z sondy. Zatrzymaj się, gdy larwa będzie odgrywać rolę 360 stopni z dala od sondy ciepła lub gdy upłynął określony czas. Zapisz czas odpowiedzi.
W przykładowym protokole zobaczymy demonstrację miejscowego testu sondy ciepła na larwach Drosophila we wczesnym stadium rozwoju.
- Najpierw ustaw temperaturę sondy termicznej na żądaną wartość zadaną. Użyj pędzla lub kleszczy, aby delikatnie przenieść pojedynczą larwę na płaską platformę, upewniając się, że lawa jest pokryta cienką warstwą wody.
- Aby zminimalizować wahania ciśnienia, a także zapewnić prawidłowe położenie i kąt sondy ciepła, praktyka czyni mistrza.
- Delikatnie dociśnij końcówkę sondy do larwy w segmencie A4, lekko dociskając końcówkę pod kątem około 45 stopni między sondą a powierzchnią larwy. Ciśnienie powinno spowodować niewielkie wgłębienie na powierzchni larwy i zwykle będzie wystarczające, aby zapobiec poruszaniu się. Kontynuuj stymulację larwy, aż pojawi się reakcja odstawienia lub do osiągnięcia 20-sekundowego punktu granicznego.
Reagujące larwy zazwyczaj najpierw wykazują wstępne zachowanie polegające na podnoszeniu głowy i ogona, a następnie wycofaniu się polegającym na przetaczaniu się o co najmniej 360 stopni. Po zainicjowaniu zachowania związanego z wycofaniem zwolnij kontakt z sondą i zarejestruj opóźnienie lub czas potrzebny do wycofania. Jeśli w ciągu 20 sekund nie zostanie zaobserwowane żadne zachowanie związane z odstawieniem, oznacza to, że larwa nie reaguje.