Drosophila Monitor aktywności (DAM): metoda pomiaru aktywności lokomotorycznej u much

- Monitor aktywności Drosophila lub DAM zawiera wyśrodkowane rurki aktywności wyposażone w pokarm dla much na jednym końcu i przepuszczający powietrze bliższy na drugim. Ta konfiguracja może pomieścić pojedyncze muchy podczas eksperymentów trwających kilka dni, a nawet tygodni.

Umieść DAM w kontrolowanym środowisku, takim jak inkubator z ustawioną temperaturą, wilgotnością i cyklem światła. Przeprowadź eksperyment w ciemnym pomieszczeniu i, jeśli to konieczne, użyj źródła światła podczerwonego do obsługi urządzenia, które w przeciwieństwie do jasnego światła nie wpływa na system okołodobowy muchy.

W celu zarejestrowania aktywności ruchowej należy podłączyć aparaturę do systemu komputerowego, który przechowuje odczyty z detektorów DAM. Elektronika DAM w sposób ciągły wykrywa integralność wiązki podczerwieni, która jest emitowana przez środek każdej lampy i okresowo przesyła dane do systemu komputerowego.

Gdy mucha chodzi tam iz powrotem wewnątrz rury, przecina wiązkę podczerwieni. Te przerwy są zliczane przez DAM w czasie dla każdej rurki i służą jako miara aktywności muchy.

W poniższym protokole użyjemy systemu DAM do badania rytmów okołodobowych u dorosłych samców Drosophila.

- Przed załadowaniem much do probówek aktywnościowych włącz inkubatory, które będą używane do przechowywania monitorów aktywności. Dostosuj temperaturę za pomocą elementów sterujących inkubatora i ustaw reżim światła/ciemności za pomocą sterownika światła systemu DAM lub własnego systemu sterowania oświetleniem inkubatora, zgodnie z pożądanym projektem eksperymentalnym.

Następnie znieczul muchy dwutlenkiem węgla. Następnie za pomocą cienkiego pędzla delikatnie przenieś pojedynczą muchę do rurki do aktywności. Chwyć środek pojedynczego kawałka przędzy o długości około pół cala za pomocą cienkich kleszczyków i włóż przędzę do nieżywnościowego końca rurki aktywności, aby zatkać otwór i zapobiec ucieczce muchy podczas eksperymentu, jednocześnie umożliwiając przepływ powietrza do rurki.

Trzymaj rurkę leżącą na boku, aż mucha się obudzi, aby mucha nie przykleiła się do jedzenia. Włóż rurki do monitorów aktywności. W nowszym, bardziej kompaktowym modelu monitorów TriKinetics konieczne jest przytrzymanie rur na miejscu za pomocą gumowych opasek, aby zapewnić, że wiązka podczerwieni przechodzi przez rurkę w pozycji środkowej.

Na koniec umieść monitory aktywności w inkubatorach i podłącz je do systemu zbierania danych za pomocą przewodów telefonicznych. Za pomocą oprogramowania do zbierania danych w systemie DAM sprawdź, czy wszystkie monitory są prawidłowo podłączone i czy dane są zbierane z każdego z nich.

Teraz, gdy muchy zostały załadowane do rurek aktywności, a system monitorowania aktywności lokomotorycznej jest gotowy, dane mogą być teraz rejestrowane. Muchy są synchronizowane i porywane poprzez wystawienie ich na działanie pożądanego światła/ciemności lub LD i reżimu temperatury przez dwa do pięciu pełnych dni. Najczęściej stosowanym warunkiem porywania jest cykl światło/ciemność 12 godzin światła/12 godzin ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Do celów badania rytmów okołodobowych w odniesieniu do tego protokołu, czas, w którym zapalają się światła w inkubatorze, jest definiowany jako czas Zeitgebera 0, a wszystkie inne czasy są względne w stosunku do tej wartości. W standardowych warunkach LD 12:12 Drosophila melanogaster typu dzikiego zazwyczaj wykazuje dwa napady aktywności; jeden skoncentrowany wokół ZT0, określany jako szczyt poranny, a drugi wokół ZT12, określany jako szczyt wieczorny.

Swobodne rytmy aktywności ruchowej są mierzone w stałych warunkach ciemności i temperatury po okresie wyrywania. Ustawienie cyklu światła może być zmienione w dowolnym momencie w ciemnej fazie ostatniego dnia LD, tak aby następny dzień eksperymentu reprezentował pierwszy dzień DD. Siedem dni zbierania danych DD wystarcza do obliczenia okresu okołodobowego i amplitudy lub siły rytmu much.

Ogólnie rzecz biorąc, wielkość próby wynosząca co najmniej 16 much jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych okresów swobodnego przepływu dla danego genotypu. Na zakończenie eksperymentu surowe dane binarne zebrane za pomocą oprogramowania systemowego DAM są pobierane na przenośne urządzenie do przechowywania danych, na przykład klucz USB.

Surowe dane binarne są przetwarzane za pomocą DAM Filescan102X i sumowane do przedziałów 15- i 30-minutowych podczas analizy parametrów okołodobowych lub od 1 do 5 minutowych podczas analizy parametrów snu/odpoczynku. Obecnie pięć kolejnych minut bezczynności to standardowa definicja snu/odpoczynku u Drosophila.