Przygotowanie serca Drosophila: technika badania fizjologii serca u dorosłej muchy

- W przeciwieństwie do kręgowców, serce Drosophila jest częścią otwartego układu krążenia. Serce dorosłej muchy to rurkowata struktura zbudowana z kardiomiocytów, która jest połączona z naskórkiem za pomocą mięśni alary i osadzona w macierzy zewnątrzkomórkowej. Komora serca znajduje się na tylnym końcu muchy i pompuje hemolimfę do aorty, z której spływa do otwartej jamy ciała.

U owadów hemolimfa służy zarówno jako krew, jak i płyn śródmiąższowy, przenosząc składniki odżywcze, cząsteczki sygnałowe i komórki odpornościowe. Dodatkowe punkty orientacyjne serca to ostia, które są otworami wzdłuż rurki i zastawki wewnątrzsercowe. Komórki osierdzia są zlokalizowane wzdłuż rurki serca i są częścią układu wydalniczego muchy.

W eksperymentalnym preparacie serca sztuczna hemolimfa naśladuje warunki fizjologiczne, aby zachować funkcję tkanki. Chociaż naturalna hemolimfa nie jest odpowiedzialna za wymianę gazową, sztuczna hemolimfa musi być dobrze natleniona, aby zastąpić brak funkcjonalnego systemu tchawicy. W poniższym eksperymencie demonstrujemy częściowo nienaruszone przygotowanie serca od dorosłej muchy do obrazowania na żywo lub elektrofizjologii.

- Zanim zaczniemy, najpierw przygotowujemy sztuczny roztwór hemolimfy. Roztwór ten zawiera sacharozę i trehalozę, które należy dodać do sztucznej hemolimfy ze schłodzonych roztworów podstawowych tuż przed użyciem, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu. Doprowadź sztuczną hemolimfę do temperatury pokojowej i natlenić roztwór przez bulgotanie powietrzem przez co najmniej 15 minut.

Następnie wyciągnij kilka drobnych naczyń włosowatych za pomocą standardowego ściągacza do pipet, który będzie potrzebny do usunięcia ciałek tłuszczowych w rozporku.

Gdy wszystko zostanie przygotowane, dorosłe muchy muszą zostać znieczulone. Można to zrobić, używając krótkiej ekspozycji na drzemkę muchy przez dwie do pięciu minut, ale należy uważać, aby nie pozostawiać much w drzemce muchy dłużej niż pięć minut. Krótkotrwała ekspozycja na zimno może być również wykorzystana do znieczulenia much, ale dwutlenek węgla nie jest zalecany, ponieważ ma długotrwały wpływ na tętno i rytmiczność.

Następnie znieczulone muchy umieszcza się grzbietem do dołu na szalce Petriego pokrytej cienką warstwą wazeliny. Hydrofobowy naskórek na skrzydłach i tułowiu powinien odwracalnie przylegać do galaretki, ale w razie potrzeby muchę można przestawić. Wstępne cięcie wykonuje się za pomocą zakrzywionych nożyczek sprężynowych. Odbywa się to poprzez umieszczenie ostrzy nożyczek pod nogami muchy i skierowanie ich pod kątem w dół w kierunku grzbietowej powierzchni klatki piersiowej w pobliżu szyi.

Głowa, brzuszny rdzeń nerwowy i nogi są usuwane jednym cięciem. Po przecięciu preparat zanurza się w natlenionym roztworze sztucznej hemolimfy. Za pomocą nożyczek sprężynowych tylny koniec brzucha, który składa się z segmentów brzusznych 7 i 8, usuwa się jednym cięciem. Zapewnia to dostęp do wykonywania bocznych nacięć wzdłuż obu krawędzi brzucha i służy do przerwania połączenia między tylnym jelitem a naskórkiem brzucha.

Włóż ostrza nożyczek do małego otworu w końcówce brzucha i odetnij naskórek na boki. To uwalnia jedną krawędź naskórka brzusznego. Chwyć klapę kleszczami i wykonaj podobne cięcie wzdłuż przeciwległej bocznej krawędzi brzucha. Uwolniony płat brzusznego naskórka brzusznego brzusznego można teraz usunąć.

Jelita i inne narządy jamy brzusznej można zwykle usunąć jako pojedynczą masę za pomocą jubilerów, kleszczy i delikatnego szarpania. Usunięcie narządów wewnętrznych odsłania bijącą rurkę serca, która nadal jest przymocowana do naskórka grzbietowego za pomocą małych mięśni alaryzowych i jest otoczona ciałami tłuszczowymi. Wyciągnięte kapilary są umieszczane w plastikowej rurce 1/16 cala przymocowanej do źródła podciśnienia. Siła ssania jest proporcjonalna do średnicy końcówki, dlatego nie należy używać pipet z końcówkami o średnicy większej niż 40 mikronów.

Po ustawieniu ten system ssący służy do odsysania nadmiaru tłuszczu z okolic rurki serca. Może być również stosowany do usuwania pęcherzyków powietrza, które gromadzą się wokół naskórka i wszelkich zanieczyszczeń. Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć dotykania samego serca, a ponieważ tylna część serca jest bardzo delikatna, należy całkowicie unikać tego obszaru. Dorosła rurka serca Drosophila jest teraz odsłonięta i powinna bić.

W razie potrzeby naskórek i przyczepione serce można zmienić, delikatnie podnosząc naskórek z wazeliny i ostrożnie ubijając go z powrotem, ponownie unikając kontaktu z tkanką serca. W tym momencie roztwór kąpiący preparat należy zastąpić świeżym, sztucznym hemolimfą. Preparat ten należy pozostawić do zrównoważenia przez 20 do 30 minut z natlenieniem przed jakimikolwiek manipulacjami. Jeśli preparat ma być przechowywany dłużej niż 60 minut, należy go ponownie przetworzyć świeżą sztuczną hemolimfą. Preparat ten jest teraz gotowy do użycia do zapisu optycznego i może być również używany do zapisu elektrofizjologicznego lub do manipulacji histologicznych.