Kokultura 2D komórek białaczkowych z BMSC: metoda uzyskiwania subpopulacji komórek białaczkowych

- W systemie kohodowli 2D wiele typów komórek jest hodowanych razem na płaskich płytkach hodowlanych. Ten system hodowli ułatwia badanie interakcji i zachowań komórek in vitro. Aby ustalić kohodowlę komórek białaczkowych z komórkami zrębu szpiku kostnego lub BMSC, dodaj zawiesinę komórek białaczkowych do przylegającej monowarstwowej hodowli BMSC. Inkubuj płytkę w odpowiednich warunkach hodowli. Utrzymuj kokulturę, wymieniając 90% pożywki co czwarty dzień.

Podczas tej kohodowli 2D komórki białaczkowe oddziałują z BMSC i lokalizują się w różnych regionach hodowli, tworząc trzy subpopulacje. Mikroskopia z kontrastem fazowym pozwala na wizualne rozróżnienie trzech subpopulacji. Pierwsza grupa komórek białaczkowych, które wydają się swobodnie unosić w pożywce, jest klasyfikowana jako komórki zawieszone. Druga grupa komórek białaczkowych, które przylgnęły do powierzchni monowarstwy BMSC, wydaje się jasna i jest klasyfikowana jako komórki jasne fazowo.

Trzecia grupa komórek białaczkowych, które migrowały pod monowarstwą, wydaje się przyciemniona i jest klasyfikowana jako komórki przyciemnione fazowo. W poniższym protokole przeprowadzamy kohodowlę ostrej białaczki limfoblastycznej lub komórek ALL z ludzkimi komórkami zrębu szpiku kostnego.

- Zacznij od wysiewu od 5 do 20 razy 10 do szóstych komórek białaczkowych w 10 mililitrach pożywki hodowlanej specyficznej dla nowotworu na 100-milimetrowej płytce zawierającej od 80% do 90% zlejących się komórek zrębu szpiku kostnego lub osteoblastów. Co czwarty dzień przechylać płytkę na bok i odsysać wszystko oprócz 1 mililitra pożywki, uważając, aby nie naruszyć przylegającej warstwy komórek. Następnie ostrożnie dodaj 9 mililitrów świeżej pożywki do hodowli komórek białaczkowych kroplami w róg płytki wzdłuż boku, aby zapewnić minimalne zakłócenie przylegających komórek.

Po 12 dniu kohodowli delikatnie pipetować pożywkę hodowlaną w górę iw dół po płytce około 5 do 10 razy, aby zebrać pływające komórki białaczkowe i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie ponownie zasiaj komórki na nowej płytce składającej się w 80% do 90% ze zlewającymi się komórkami zrębu szpiku kostnego lub osteoblastami, jak właśnie pokazano. Do 4 dnia uformują się trzy subpopulacje komórek białaczkowych, z zawieszonymi komórkami białaczkowymi swobodnie unoszącymi się w pożywce, komórkami białaczkowymi jasnymi fazowo przylegającymi do powierzchni monowarstwy komórek adherentnych, a komórkami białaczkowymi o ciemnej fazie migrowały pod monowarstwą.