Wirowanie w gradiencie gęstości: metoda izolowania komórek PBL z krwi obwodowej

0 views • 3:40 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- U pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową lub PBL, limfocyty komórek B znacznie zwiększają się w szpiku kostnym i krwi. Aby wyizolować te komórki PBL z próbki krwi, najpierw potraktuj próbkę ludzkim koktajlem wzbogacającym komórki B, który oddziela komórki B za pomocą selekcji negatywnej. Przeciwciała w koktajlu specyficznie rozpoznają i sieciują antygeny wyrażane przez limfocyty inne niż B i erytrocyty, tworząc gęste kompleksy.

Następnie ułóż próbkę na podłożu o gradiencie gęstości o gęstości optymalnej do izolacji limfocytów. Po kolejnym odwirowaniu różne składniki krwi rozdzielają się na podstawie zmian ich gęstości w stosunku do podłoża gradientowego. Kompleksy RBC-non-B-cell o większej gęstości osiadają w pożywce, tworząc osad. Najmniejsza frakcja osocza tworzy najwyższą warstwę. Mniej gęste komórki CLL tworzą białą warstwę na granicy faz ośrodka o dużej gęstości osocza.

Ostrożnie przenieś białą warstwę do świeżej tuby. Ponownie odwirować, aby uzyskać osad zawierający oczyszczone komórki CLL. W poniższym protokole pokazujemy izolację komórek przewlekłej białaczki limfocytowej z próbek krwi pacjenta.

- Pobranie próbek krwi obwodowej od pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową, którzy wcześniej wyrazili zgodę, w probówkach do pobierania krwi EDTA wraz z liczbą białych krwinek.

- Próbki krwi ludzkiej należy traktować jako niebezpieczne, ponieważ mogą zawierać wirusy przenoszone przez krew. Upewnij się, że te próbki są obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i że użytkownik przez cały czas nosi fartuch laboratoryjny i rękawice. Pozbądź się materiałów skażonych krwią i zdezynfekuj je.

- Jeśli liczba białych krwinek jest równa lub większa niż 40 milionów komórek na mililitr, rozcieńczyć próbkę w stosunku 1 do 1 za pomocą buforu płuczącego RT CLL. Następnie podwielokrotną pożywkę gradientu gęstości RT do stożkowej probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości dla próbki. Ostrożnie ułożyć próbkę warstwami na wierzchu pożywki i odwirować w temperaturze 400 razy G przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Za pomocą plastikowej pipety Pasteura delikatnie zbierz białą warstwę komórek jednojądrzastych, które zebrały się na granicy pożywki gradientu gęstości i buforu płuczącego CLL. Przenieś tę izolowaną monowarstwę do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Aby umyć komórki, dodaj 40 mililitrów buforu do płukania CLL do tej monowarstwy i odwiruj w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Wyrzuć supernatant, przesuń dolną część probówki, aby ponownie zawiesić osad i powtórz to pranie. Wyrzuć supernatant, ponownie strzepnij dno probówki, a następnie ponownie zawiesić osad komórek w ustalonej objętości bufora płuczącego CLL, w zależności od wielkości osadu. Po zliczeniu komórek i po zastosowaniu cytometrii przepływowej w celu sprawdzenia czystości komórek, umieść komórki na płytkach do hodowli tkankowych o wymaganej gęstości komórek, gotowych do stymulacji lub leczenia farmakologicznego.

07:11

Izolacja naciekających leukocytów ze skóry myszy za pomocą trawienia enzymatycznego i separacji gradientowej

Related Videos

0 Views

10:21

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Related Videos

0 Views

03:28

Pobieranie nasienia o zróżnicowanej jakości za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Related Videos

0 Views

05:23

Izolowanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej w celu wytworzenia myszy z ludzkim układem odpornościowym

Related Videos

0 Views

14:04

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Related Videos

0 Views

09:09

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Related Videos

0 Views

09:52

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Related Videos

0 Views

07:39

Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

Related Videos

0 Views

11:39

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Related Videos

0 Views

08:12

Izolacja ludzkich neutrofili z krwi pełnej i kożuchów

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026