Zewnątrzkomórkowy metabolizm puryn: test oparty na HPLC do pomiaru wytwarzania i metabolizmu adenozyny w komórkach białaczkowych

- Adenozyna, nukleozyd purynowy obecny w nominalnych stężeniach w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, pomaga kontrolować proliferację komórek w warunkach fizjologicznych. Podczas stanów patologicznych, takich jak białaczka, zewnątrzkomórkowe stężenie adenozyny wzrasta i hamuje odpowiedzi immunologiczne przeciwko komórkom rakowym. Akumulacja adenozyny wynika albo z defosforylacji nukleotydów ATP lub ADP, albo z powodu upośledzonej degradacji adenozyny do nukleozydu inozyny.

Aby zmierzyć wytwarzanie i zużycie adenozyny, hoduj komórki rakowe w obecności substratu nukleotydowego. Aktywność metaboliczna adenozyny w komórkach określa stężenia różnych cząsteczek puryn obecnych w hodowli. Odwirować w celu usunięcia komórek i uzyskania cząsteczek puryn w supernatancie.

Aby oddzielić i określić ilościowo puryny, przenieś próbkę do odpowiednich fiolek. Załaduj je do odwróconej fazy, wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub kolumny RP-HPLC, zawierającej fazę stacjonarną unieruchomioną hydrofobowymi ligandami. Podczas przechodzenia przez kolumnę cząsteczki hydrofobowe adsorbują się do ligandów i są zatrzymywane na podstawie ich hydrofobowości. Najmniej hydrofobowych cząsteczek wypływa jako pierw