Name: Obrazowanie pojedynczych cząsteczek transportu jądrowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Poznaj mikroskopię pojedynczych cząsteczek do badania transportu jądrowego w komórkach HeLa. Ta metoda fluorescencyjna pozwala wizualizować dynamikę przemieszczania się cząsteczek przez kompleksy porów jądrowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten był wspierany przez Research Capacity Enhancement Grant (Bowling Green State University).

1. Przygotowanie układu komórkowego do eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami
<ol>
<li>Przynajmniej tydzień wcześniej należy rozpocząć hodowlę świeżej kultury linii komórkowej HeLa z zapasu poprzez rozmrożenie w 37°C i umieszczenie w 25 cm2 kolba hodowlana z 5 ml pożywki, inkubować komórki w 37°C w atmosferze 5% CO2 inkubować przez 24 godziny i pasażować co najmniej 3 razy, aby zapewnić komórkom optymalne warunki. Komórek nie należy jednak pasażować więcej niż 20 razy ze względu na tendencję do znacznego spowolnienia tempa ich wzrostu. Komórki HeLa zostały wcześniej zmodyfikowane genetycznie tak, aby GFP (białko fluorescencyjne zielone) było połączone z białkiem membrany porów otoczki jądrowej POM 121. Jest to niezbędne do precyzyjnej lokalizacji otoczki jądrowej.</li>
<li>Na dzień przed eksperymentem komórki przeznaczone do eksperymentu z pojedynczą cząsteczką należy wysiać na autoklawowaną lamellkę umieszczoną w sterylnej szalce Petriego. Lamellkę należy zanurzyć w DMEM (pożywka Eagle’a modyfikowana przez Dulbecco, Grand Island, NY) uzupełnionej o 4,5 g/L glukozy, 862 mg/L GlutaMAX-I, 15 mg/mL czerwieni fenolowej, 100 U/mL penicyliny, 100μg/mL streptomycyną i 10% płodową surowicą z noworodka cielęcia. Objętość hodowli powinna wynosić 1 ml na szkiełko nakrywkowe, rozmieszczoną równomiernie na całej powierzchni. Płytki Petri ze szkiełkami nakrywowymi są następnie umieszczane w CO2 inkubatorze i przechowywano przez 24 godziny przed eksperymentem. Aby hodowla komórkowa nadawała się do eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami, konfluencja komórek na szkiełku podstawowym nie powinna przekraczać 70%, co zapewnia odpowiednią swobodę przepływu buforów płuczących oraz białek zainteresowania podlegających transportowi jądrowemu.</li>
<li>W dniu eksperymentu przygotowano komory przepływowe, dodając szkiełko nakrywkowe oraz dwie linie smaru silikonowego pełniące funkcję dystansów. Należy upewnić się, że komórki nie wyschną podczas przygotowania. Zazwyczaj preferujemy wykonanie dwóch komór na jednym szkiełku nakrywowym, aby umożliwić zastosowanie dwóch różnych warunków eksperymentalnych. Górne szkiełka nakrywkowe — małe fragmenty szkła wycięte nożem diamentowym o powierzchni około 6 mm² — umieszczono odwrócone stroną górną do dołu na chusteczce Kimwipe. Dwie linie smaru silikonowego nanieśliśmy precyzyjnie wzdłuż krawędzi szkiełek nakrywek za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml, do której szczelnie przymocowano za pomocą Parafilmu końcówkę do pipety, aby kontrolować wielkość kropel smaru.</li>
<li>Prześlizg pokryty komórkami HeLa został następnie wysuszony poprzez odparowanie kropel i zamontowany za pomocą smaru pełniącego rolę kleju w samodzielnie wykonanej aluminiowej ramce hartowanej, która służyła do utrzymania prześlizgu w uchwycie na próbki mikroskopu.</li>
<li>Przykrywkę z dwiema liniami smaru podniesiono pęsetą z ostrym końcem, a następnie odwrócono i nałożono na szkiełko z naniesioną warstwą komórek, tworząc komorę przepływową. Stabilne mocowanie uzyskano poprzez delikatne dociśnięcie krawędzi przykrywki w miejscach nałożenia smaru.</li>
<li>Ponieważ na jednym szkiełku pokrytym komórkami przygotowano dwie oddzielne komory, niezbędne jest zapewnienie szczelności w celu zapobiegania kontaminacji krzyżowej. W tym celu między komorami, od górnej do dolnej krawędzi szkiełka, nanieś kilka linii smaru silikonowego, aby je od siebie odizolować. Kilka linii smaru należy nanieść również na zewnętrzne krawędzie komór.</li>
<li>Następnie do komory przepływowej dodano pożywkę DMEM, aby zapobiec wysychaniu komórek. Przepływ roztworu wymuszono za pomocą niewielkiego kawałka papieru filtracyjnego, który absorbował ciecz z wylotu komór przepływowych. Przy zachowaniu stabilności dłoni roztwór można było dodawać mikropipetą do jednej strony komory przepływowej jedną ręką, jednocześnie absorbując go papierem filtracyjnym z drugiej strony. </li>
<li>Po przygotowaniu preparatu spód szkiełka przedmiotowego przemyto zwilżonym patyczkiem bawełnianym – dwukrotnie wodą, a następnie dwukrotnie 100% etanolem.</li>
<li>Po umieszczeniu preparatu na mikroskopie, komórki przemyto 2 X 25 μL bufor importujący (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3). Następnie komórki permeabilizowano przez ok. 2 minuty za pomocą 2 X 25 μL 40 μg/mL digitonin w buforze do importu i ponownie przemyto 2 x 25 μL bufor importowy (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) uzupełniony o 1,5% poliwinilopirolydonu (PVP; 360 kDa). Może być konieczne monitorowanie permeabilizacji w czasie rzeczywistym przy użyciu jasnego pola. PVP dodawano do wszystkich roztworów buforu importowego po zastosowaniu digitoniny, aby zapobiec osmotycznemu pęcznieniu jąder. Nienaruszone jądro, wraz z kontrolowanym środowiskiem cytoplazmatycznym, stanowi znacznie uproszczony system transportowy, który pozwala na krokowe wyjaśnienie skomplikowanego transportu jądrowego. Wcześniejsze eksperymenty zespołowe oraz jedno cząsteczkowe przeprowadzone w tym systemie dostarczyły cennych informacji na temat transportu jądrowego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kluczowych białek do eksperymentu transportu jądrowego
<ol>
<li>Za pomocą konwencjonalnej transformacji bakteryjnej zmodyfikowano specjalne szczepy E.coli (JM109) w celu nadekspresji genów odpowiedzialnych za produkcję wspomnianych białek docelowych; szczepy te przechowywane są w temperaturze -80°C. (W przypadku NLS-2xGFP zastosowano wektor pTrcHisB firmy Invitrogen). Pętlę lub ok. 50 μL zamrożonych kultur komórek E.coli eksprymujących białka fluorescencyjne lub cargo przeniesiono do 5 mL pożywki LB z dodatkiem 5 μL ampicyliny (U 1000) i inkubowano tlenowo z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 37°C przy 225 rpm.
</li>
<li>Po 24 godzinach 500 μL nasyconej kultury przeniesiono do 500 mL pożywki LB i inkubowano w inkubatorze w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez 5-6 godzin po dodaniu 250 μL IPTG (izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozyd), a następnie inkubowano przez kolejne 5-6 godzin. Jest to konieczne, ponieważ IPTG jest metabolitem laktozy, który wyzwala transkrypcję operonu lac, w którym gen lacZ został zastąpiony genem docelowym, a IPTG służy następnie do indukcji ekspresji genu.</li>
<li>Kulturę wirowano następnie w chłodzącej wirówce wysokoobrotowej przy 12000 rpm przez 15 minut, po czym odrzucono nadsącz. Komórki resuspendowano w 40 mL roztworu CelLytic B (CelLytic B zapewnia szybką i wydajną ekstrakcję białek nadających się do oczyszczania powinowactwem i analizy). Objętość powinna wynosić 10 mL na 1 gram osadu. W celu rozbicia mostków dwusiarczkowych dodano 28 μl merkaptoetanolu oraz 400 μl fluorku fenylometanosulfonylowego, aby dezaktywować proteazy zapobiegając trawieniu białek docelowych po lizie komórek. Dodano również „koktajl proteazowy” (400 μL pepstatyny A 0,2 mg/mL, 400 μL leupeptyny 0,2 mg/mL, 400 μL inhibitora trypsyny 2 mg/ml), aby zapewnić, że ekstrakty białkowe nie ulegną degradacji przed analizą białek docelowych. Następnie dodano 400 μL 1M imidazolu, stosowanego do elucji białek z etykietą związanych z jonami Ni przytwierdzonymi do powierzchni kulek w kolumnie chromatograficznej, oraz 1 mM DNazy I, stosowanej do degradacji niepożądanego jednoniciowego i dwuniciowego DNA do fragmentów 5'-fosfodinukleotydowych i oligonukleotydowych.</li>
<li>Mieszaninę mieszano w ciemności na lodzie przez 30 minut, aby zapewnić odpowiedni czas reakcji, a następnie wirowano przy 10000 rpm przez 60 minut w chłodzącej wirówce. Zebrano nadsącz i w celu przygotowania do chromatografii przeprowadzono infuzję z Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid Superflow firmy Qiagen), wirowując w probówkach do mikrowirówki z maksymalną prędkością przez 3 minuty i przemywając buforem do lizy; powtarzano wirowanie i przemywanie, aż mieszanina straciła niebieski odcień. Uzyskaną mieszaninę mieszano powoli w ciemnym pojemniku na lodzie przez 60 minut.</li>
<li>Przeprowadzono chromatografię kolumnową, zbierając 12 frakcji w następujący sposób: pierwsza frakcja to przelot 10 mL nadsączu zmieszanego z Ni-NTA w poprzednim kroku; druga to 10 mL buforu do lizy (50 mM fosforanu sodu, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8,0); trzecia to 10 mL buforu (10 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 8,0); czwarta i pozostałe to po 0,5 mL buforu elucyjnego (250 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 8,0).</li>
<li>Przygotowano żel poliakryloamidowy do SDS-PAGE oraz przygotowano próbki, mieszając 4 μL frakcji i 1 μL 5X SB (300 mM Tris 6,8, 25% BME, 10% SDS, 50% glicerolu). Jako standardu użyto drabinki DNA 100 kb firmy Invitrogen. Przed nałożeniem próbki gotowano przez 5 minut. Po nałożeniu elektroforezę prowadzono przy 120 V przez 60 minut. Następnie żel barwiono, odbarwiano i ostatecznie suszono w specjalnej suszarce do żeli przez 2 godziny w temperaturze 80°C.</li>
<li>Następnie przeanalizowano wyniki na żelu i zlokalizowano frakcje, które dały najlepszy rezultat. W zależności od białka docelowego, prążki powinny znajdować się zgodnie z wielkością białka. Frakcję tę należy wybrać do dalszego oczyszczania białek za pomocą MonoQ i Superdex 200 (Amersham Pharmacia).</li>
<li>Koncentrację przeprowadzono poprzez wirowanie najbardziej stężonych frakcji w filtrach Nanosep o rozmiarze porów 10K przy 14 rpm przez 5 minut, przemywając je za każdym razem buforem elucyjnym. Konieczne jest określenie końcowego stężenia białka za pomocą testu BSA w celu przeprowadzenia dalszej procedury znakowania białek.</li>
<li>Wewnętrzna zielona fluorescencja NLS-2xGFP nie może być wykorzystana do obrazowania pojedynczych cząsteczek transportu jądrowego ze względu na niską fotostabilność i nakładanie się widma z autofluorescencją komórki. Dlatego znakujemy cząsteczki cargo nadmiarem organicznego barwnika reaktywnego wobec cysteiny (maleimid Alexa555 lub Alexa 647 firmy Molecular Probes) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w 50 mM fosforanie sodu i 150 mM NaCl, po redukcji za pomocą TCEP tris (2-karboksyetylu) przez 20 minut. Reakcje zatrzymano za pomocą 2-merkaptoetanolu, a roztwory białek poddano dializie w celu usunięcia wolnego barwnika.</li>
</ol>
3. Mikroskopia pojedynczych cząsteczek
<ol>
<li>Nasz zestaw mikroskopowy obejmuje Olympus IX81 wyposażony w obiektyw imersyjny olejowy 100x o aperturze numerycznej 1.4 NA (UPLSAPO 100XO, Olympus), laser He-Ne 633 nm o mocy 35 mW (Melles Griot), lampę rtęciową z zestawem filtrów GFP, kamerę CCD z wzmocnieniem mnożnikowym na chipie (Cascade 128+, Roper Scientific) oraz pakiet oprogramowania Slidebook (Intelligent Imaging Innovations) do akwizycji i przetwarzania danych. Do generowania trybu włącz/wyłącz wzbudzenia laserowego użyto przerywacza optycznego (Newport). Fluorescencję GFP i Alexa647 wzbudzano odpowiednio lampą rtęciową oraz laserem 633 nm. Emisję fluorescencji zielonej i czerwonej zbierano tym samym obiektywem, filtrowano za pomocą filtra dichroicznego (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) oraz filtra emisyjnego (NF01-405/488/561/635-25X5.0, Semrock), a następnie obrazowano za pomocą identycznej kamery CCD.</li>
<li>W eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami zapewniamy, aby czas fotowybielania fluorescencji pojedynczej cząsteczki ładunku był dłuższy niż czas transportu. Aby określić czas fotowybielania, cząsteczki ładunku o stężeniu 0.1 nM naniesiono na szklaną lamellkę, gdzie po 30 minutach stały się nieruchome w wyniku niespecyficznej adsorpcji. Następnie zmierzono przebieg czasowy fluorescencji. W zależności od badanego białka czasy fotowybielania będą się różnić w zależności od liczby cystein zdolnych do reakcji z maleimidami, dlatego natężenie i obszar oświetlenia należy dostosować tak, aby nie wywołać przedwczesnego fotowybielania i zapewnić, że cząsteczki ładunku znakowane Alexa 647 wykazują fluorescencję przez czas dłuższy niż interakcja ładunków z NPC.</li>
<li>W eksperymentach z importem w komórkach permeabilizowanych ładunek i niezbędne kofaktory transportowe dodawano razem. Typowe reakcje importu ładunku zawierały 1 mM GTP, 0.5 μM Importyny-, 0.5 μM Importyny- 1, 2 μM Ran oraz 1 μM NTF2 dla transportu ułatwionego oraz 0.1 nM Dekstranu 10KDa dla transportu pasywnego. Stężenia fluorescencyjnego ładunku wynosiły &gt; 100 nM w eksperymentach zbiorczych i ~ 100 pM w analizach pojedynczych cząsteczek. Przy tych stężeniach oczekiwano, że &gt;99% ładunku utworzy kompleksy z Importyną i Importyną. Szybkość transportu monitorowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (jeśli istotne były tylko szybkości względne) lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (jeśli pożądane były szybkości bezwzględne).</li>
<li>Najpierw pozycję otoczki jądrowej określono za pomocą szerokopolowej mikroskopii epifluorescencyjnej, używając lampy rtęciowej HBO z zestawem filtrów GFP do wykonania zdjęcia NE. Intensywności pikseli w rzędzie lub kolumnie znajdujących się w przybliżeniu prostopadle do NE dopasowano do rozkładu Gaussa. Pozycje szczytowe funkcji Gaussa dla danego zestawu intensywności pikseli uznano za pozycję NE dla tego rzędu i kolumny. Pozycje szczytowe serii takich funkcji Gaussa dopasowano następnie wielomianem drugiego stopnia, co pozwoliło wyznaczyć przebieg NE w całym obrazie.</li>
<li>Po zlokalizowaniu NE niezbędne jest usunięcie całej autofluorescencji za pomocą lasera He-Ne 633 nm aż do jej całkowitego fotowybielenia; zazwyczaj wystarczające jest 60 sekund.</li>
<li>Cząsteczki próbek należy następnie przechowywać w 1.5% roztworze PVP, a mieszaninę dodać do komory przepływowej w objętości 25 L, a następnie przeciągnąć przez komorę, stosując knot z papieru filtracyjnego. Należy zachować szczególną ostrożność podczas dodawania białek ładunku importowego do permeabilizowanych komórek bezpośrednio po lokalizacji otoczki jądrowej, ponieważ ostrość może zostać łatwo zaburzona przez każdy gwałtowny ruch.</li>
<li>Niezwłocznie po dodaniu cząsteczek ładunku użyto lasera He-Ne 633 nm do oświetlenia trajektorii transportu przechodzących cząsteczek. Przerywacz optyczny (Newport) należy ustawić na około 5 Hz, aby uniknąć fotowybielania spowodowanego wysoką gęstością mocy lasera, a także aby umożliwić nowej porcji niefotowybielonych pojedynczych cząsteczek zbliżenie się do NE. Serię filmów z translokacjami pojedynczych cząsteczek należy zarejestrować za pomocą szybkiej kamery CCD, która może pracować z częstotliwością do 2500 Hz.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym wykonaniu nasz protokół pozwolił na zarejestrowanie serii filmów demonstrujących translokację pojedynczych cząsteczek ładunku oddziałujących z kompleksem porów jądrowych w permeabilizowanych komórkach HeLa POM 121 (Rys. 1). Naszym celem było obrazowanie i śledzenie przejściowych etapów transportu cząsteczek dekstranu przez NPC w komórkach HeLa permeabilizowanych digitoniną, stabilnie eksponujących GFP-POM121. Komórki inkubowano z niskimi stężeniami znakowanych cząsteczek dekstranu. Płaszczyznę równikową jądra ustawiono w ostrości, uzyskując wyraźny obraz zielonego pierścienia fluorescencji GFP wzbudzanej światłem lampy rtęciowej o długości fali 488 nm. Długi czas ekspozycji GFP-NE umożliwia uzyskanie doskonałego stosunku sygnału do szumu (SNR) w celu zlokalizowania płaszczyzny środkowej NE. Wcześniej stwierdzono, że cząsteczki dekstranu 10 kDa dyfundują przez NE w czasie około 2 ms przy rozdzielczości przestrzennej około 20-40 nm i częstotliwości klatek detekcji wynoszącej 500 lub 1000 Hz. Taka rozdzielczość czasoprzestrzenna pozwala na zarejestrowanie zaledwie jednego do dwóch kroków dyfuzji cząsteczek dekstranu przez NPC, co jest niewystarczające do wyjaśnienia szerszych informacji przestrzennych dotyczących dyfuzji pasywnej. Aby zarejestrować dokładniejsze etapy ruchu cząsteczek dekstranu w obrębie NPC przy lepszej rozdzielczości czasoprzestrzennej, wprowadziliśmy dwie główne ulepszenia: (i) zastosowanie szybszej częstotliwości klatek detekcji 2500 Hz w celu uchwycenia dokładniejszych kroków dyfuzji oraz (ii) zastosowanie wyższej gęstości optycznej oświetlenia, aby wzbudzić więcej fotonów z pojedynczych cząsteczek w celu uzyskania wyższej rozdzielczości przestrzennej. Ulepszenia te umożliwiły nam zarejestrowanie wielu etapów przejściowej dyfuzji cząsteczek dekstranu znakowanych alexa647 przez NE przy użyciu światła lasera 633 nm o natężeniu 100 kW/cm2 z rozdzielczością czasoprzestrzenną 12 nm i 400 ms.
Jak pokazano na Rysunku 1, zarejestrowano serię obrazów statycznych typowych zdarzeń transportu cząsteczek dekstranu. Poprzez śledzenie trajektorii przestrzennych poszczególnych przechodzących cząsteczek dekstranu wyróżniono drobne etapy dyfuzji przez NE. Stwierdzono, że około 30% zdarzeń oddziaływania z NE ma rozpoznane przedziały początkowe i docelowe. spośród nich cząsteczki dekstranu przemieszczające się z cytoplazmy do NE mają dwa cele: kończą w jądrze po dyfuzji przez NE lub wracają do cytoplazmy po oddziaływaniu z NE. Podobne sytuacje wystąpiły w przypadku zdarzeń eksportu: cząsteczki dekstranu startujące z jądra przedostają się do cytoplazmy lub dyfundują z powrotem do jądra po oddziaływaniu z NE. Takie serie obrazów zawierają informacje o położeniu przestrzennym pojedynczych cząsteczek względem NPC, a także informacje czasowe dotyczące czasu przebywania cząsteczek w NPC. Poprzez analizę trajektorii cząsteczek dekstranu w obszarze NE można określić czas transportu, wydajność oraz częstotliwość wchodzenia. Czas transportu w naszej pracy można zidentyfikować jako czas importu lub eksportu. Zdefiniowano go jako średni czas przebywania cząsteczek dekstranu w NPC, które podlegają importowi lub eksportowi. Wydajność importu lub eksportu zdefiniowano jako procent pełnych zdarzeń importu lub eksportu w stosunku do sumy zdarzeń pełnych i przerwanych. Częstotliwość wchodzenia w imporcie lub eksporcie odnosi się do liczby cząsteczek oddziałujących z NE w ciągu jednej sekundy.
<img src="/files/ftp_upload/2040/2040fig1.jpg" alt="Obrazy dynamiki cytoplazmatycznej; mikroskopia, dekstran, transport jądro-cytoplazmatyczny; sekwencja time-lapse." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Wybrane klatki wideo typowych zdarzeń transportu cząsteczek dekstranu przez NE. (A) Zdarzenie transportu z cytoplazmy do jądra. Pojedyncza cząsteczka dekstranu (czerwona plamka) rozpoczęła ruch w cytoplazmie, weszła w interakcję z NE (zielona linia pikseli) i zakończyła ruch w jądrze. Trajektorie zdarzenia (niebieskie linie i puste kropki) zostały wyznaczone i nałożone na NE (czarna linia). Zielona i czerwona linie reprezentują odległość 100 nm od NE po stronie cytoplazmy i jądra. C, cytoplazma. N, jądro. Pasek skali: 2 mm. (B) Zdarzenie transportu z cytoplazmy do cytoplazmy. (C) Zdarzenie transportu z jądra do jądra. (D) Zdarzenie transportu z jądra do cytoplazmy.

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Należy zadbać o zapewnienie właściwej kolokalizacji NE oraz pojedynczych cząsteczek podczas eksperymentu. Istotne jest również zapewnienie wysokiego stosunku sygnału do szumu, szczególnie gdy sygnał jest niski z powodu słabego znakowania lub fotoblaknięcia. Precyzja lokalizacji jest ograniczona przez szum tła (wynikający z fluorescencji poza ogniskową, szumu odczytu CCD, prądu ciemnego i innych czynników).

obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Użyteczność metod fluorescencyjnej mikroskopii pojedynczych cząsteczek została w ciągu ostatniej dekady udowodniona jako niezwykle pomocna w zrozumieniu reakcji biologicznych. Badanie oddziaływań molekularnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w głębi komórek pozostawało wyzwaniem ze względu na naturalnie słabe sygnały pochodzące od poszczególnych cząsteczek. Niedawne prace Yang i współpracowników wykazały, że mikroskopia epifluorescencyjna w wąskim polu pozwala na wizualizację transportu nukleocytoplazmatycznego na poziomie pojedynczych cząsteczek. Dzięki podejściu opartemu na pojedynczych cząsteczkach uzyskano istotne dane kinetyczne, takie jak czas i wydajność transportu jądrowego dla cząsteczek ładunku zależnych i niezależnych od sygnału. W niniejszej pracy opisaliśmy protokół podejścia metodologicznego z poprawioną rozdzielczością czasoprzestrzenną wynoszącą odpowiednio 0,4 ms i 12 nm. Poprawiona rozdzielczość umożliwiła nam zarejestrowanie przejściowych zdarzeń aktywnego transportu i dyfuzji pasywnej przez kompleksy porów jądrowych (NPC) w komórkach półzachowanych. Przewidujemy, że metoda ta znajdzie zastosowanie w wyjaśnianiu innych zdarzeń wiązania i transportu wewnątrzkomórkowego.

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Użyteczność podejść opartych na fluorescencyjnej mikroskopii pojedynczych cząsteczek okazała się niezwykle pomocna w zrozumieniu reakcji biologicznych w ramach...

Otoczka jądrowa komórki zawiera około 2000 kompleksów porów jądrowych, które umożliwiają transport cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie, takich jak RNA, rybosomy, niektóre białka, węglowodany i cząsteczki sygnałowe. Poprzez dodanie znakowanych cząsteczek ładunku do przepuszczalnych komórek, ruch pojedynczych cząsteczek przez por jądrowy można zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazy time-lapse są niezbędne do określenia lokalizacji, a także charakterystyki przestrzenno-czasowej, takiej jak czas transportu, wydajność importu i eksportu oraz częstotliwość wnikania. Cześć, jestem Alex ov, doktorant z laboratorium mikroskopii pojedynczych cząsteczek w Katedrze Biologii na Bowling Green State University.Jestem Asha P Shema, studentką studiów magisterskich z laboratorium mikroskopii pojedynczych cząsteczek. Jestem Juma. Jestem stypendystą podoktorskim w laboratorium mikroskopii pojedynczych cząsteczek.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania pojedynczych cząsteczek transportu jądrowego przez kompleksy porów jądrowych w komórkach HeLa. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania translokacji różnych cząsteczek przez kompleks porów jądrowych. Zapraszamy do rozpoczęcia.Aby przygotować białka do eksperymentu dotyczącego transportu jądrowego, konwencjonalnie transformuje się szczep JM 1 0 9 E. coli wykazujący ekspresję genów odpowiedzialnych za produkcję białek ładunku jądrowego, a następnie hoduje się je w pożywce LB i indukuje za pomocą IPTG. Gdy komórki osiągną fazę logarytmiczną z gęstością optyczną od 0,7 do 0,8, kulturę wiruje się z prędkością 6 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, odrzuca nadsącz i waży osad. Następnie komórki resuspensuje się w 10 ml buforu Celtic B na gram masy, aby wyekstrahować białko odpowiednie do oczyszczania powinowactwa i analizy.Następnie dodaj odpowiednią ilość koktajlu proteaz do próbki DNA w buforze midsole oraz beta me capto ethanol. Mieszaj mieszaninę w ciemności na lodzie przez 30 minut. Następnie wiruj przy 25 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu przenieś nadsącz do nowej probówki w celu przygotowania do chromatografii. Do czterech probówek do mikrowirówki wlej 400 µL niklu NTA oraz acetonu. Wiruj przy 16 000 ×g przez trzy minuty.Odrzuć supernatant. Następnie dodaj 400 µL buforu do płukania lizatu. Po ostatnim płukaniu powtórz poprzednie etapy płukania trzy razy.Resuspendować nikiel NTA w buforze do lizy i przenieść zawartość wszystkich czterech probówek do butelki zawierającej nadsącz komórkowy. Powstałą mieszaninę mieszać powoli w ciemnym pojemniku na lodzie przez 60 minut. Przygotować kolumnę chromatograficzną ecno pack, owijając ją folią aluminiową, aby zapobiec fotoblaknięciu białek fluorescencyjnych.Umieść również 12 probówek do zbierania w statywie pod kolumną. Po mieszaniu mieszaniny przez 60 minut, nanieś 10 mililitrów mieszaniny SNA nickel NTA i poczekaj, aż całkowicie przepłynie przez kolumnę. Rozpocznij zbieranie frakcji.Następnie dodaj 10 milliliters buforu do płukania lizatu. Pozwól mu całkowicie przepłynąć. Następnie dodaj 10 milliliters buforu IZO i pozwól mu przepłynąć.Kontynuuj zbieranie frakcji. Następnie przepuść 0,5 milliliters buforu elucyjnego; powtarzaj przepuszczanie buforu elucyjnego, aż zostaną zebrane wszystkie 12 frakcji. Aby określić, która frakcja zawiera najwyższe stężenie białka, nałóż cztery microliters każdej frakcji na żel PAGE i przeprowadź barwienie Coomassie.Zgodnie ze standardowymi procedurami, należy połączyć najbardziej stężone frakcje i przenieść 500 µL do filtra nano step o wielkości porów 10 kDa, który został uprzednio przepłukany buforem eluującym. Białko należy zagęścić, wirując z prędkością 16 000 ×g przez pięć minut. Po odlaniu buforu należy wymieszać pozostałą frakcję białka i dodać kolejne 500 µL do wirówki filtracyjnej.Ponownie powtórz czynność dla wszystkich wybranych frakcji. Następnie doprowadź końcową objętość zagęszczonego białka do około 50 µL za pomocą buforu eluującego. Następnie, delikatnie mieszając mikropipetą i pobierając materiał z powierzchni filtra, przeprowadź oczyszczanie na kolumnach wymiany jonowej oraz wykluczania sterycznego w celu otrzymania superczystego białka, a następnie wyznacz końcowe stężenie białka.Następnie oznacz cząsteczki ładunku nadmiarem pomocniczego reaktywnego barwnika organicznego, takiego jak Alexa 555 lub Alexa 647. Jest to konieczne, ponieważ naturalna zielona fluorescencja GFP nie może być wykorzystana do obrazowania pojedynczych cząsteczek transportu jądrowego ze względu na niską fotostabilność oraz nakładanie się widma z autofluorescencją komórki. Oznaczone białko należy podzielić na kilka frakcji po 25 µL i przechowywać w temperaturze -80 °C dzień przed eksperymentami. Umieść autoklawowaną lamellkę w sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 mm i nanieś na nią pipetą 9 mL DMEM.Następnie za pomocą pipety nanieś 1 mL hodowli komórkowej, rozprowadzając ją równomiernie na szkiełku podstawowym. Wykorzystane komórki zostały wcześniej zmodyfikowane genetycznie w celu ekspresji białka błony porowej POM 1 21 znakowanego GFP. Umieść szalki w inkubatorze z dwutlenkiem węgla na 12 godzin.W dniu eksperymentu należy rozpocząć przygotowywanie komór przepływowych. Następnie należy wyjęć szkiełko pokryte komórkami z inkubatora, osuszyć je, a następnie zamontować za pomocą smaru próżniowego. W ramce aluminiowej wykonanej metodą obrabiarki CNC kluczowe jest upewnienie się, że komórki nie wyschną podczas przygotowań.Za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów nanieś dwie linie silikonu po obu stronach szkiełka nakrywkowego, używając pęsety. Podnieś przygotowane małe szkiełko nakrywkowe z naniesionymi dwiema liniami silikonu, odwróć je i ułóż na szkiełku pokrytym komórkami, a następnie lekko dociśnij, aby utworzyć komorę przepływową. W przypadku przygotowania dwóch oddzielnych komór na jednym szkiełku pokrytym komórkami, niezbędne jest zapewnienie szczelnego zamknięcia, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.Należy zatem nanieść kilka linii smaru silikonowego pomiędzy komorami, od góry do dołu szkiełka, aby je odizolować. Należy również nanieść kilka linii smaru na zewnętrzne ścianki komór. Do komory przepływowej należy dodać DMEM, aby zapobiec wysychaniu komórek.Następnie, używając patyczka z watką, przemyj spód szkiełka dwa razy wodą, a następnie dwa razy 100% ethanol. Zamocuj ramkę w mikroskopie. Przemyj dwa razy 25 µL buforu transportowego, dodając go do komory przepływowej i odsysając go za pomocą knotowania.Używając małego kawałka papieru filtracyjnego przyłożonego do strony wylotowej, przeprowadź permeabilizację komórek raz przez około dwie minuty przy użyciu 25 µL digitoniny; proces permeabilizacji należy monitorować w czasie rzeczywistym w jasnym polu. Na koniec przemyj komórki 25 µL buforu transportowego, uzupełnionego o 1,5% poliwinylopirolidonu (PVP), aby zapobiec osmotycznemu obrzękowi jąder. Zlokalizuj permeabilizowane komórki pod mikroskopem i zidentyfikuj jasny, zielony fluorescencyjny pierścień.Następnie ustaw ostrość na równik komórki i wykonaj zdjęcie przed dodaniem fluorescencyjnych cząsteczek ładunku. Usuń wszelką autofluorescencję, zaznaczając obszar otoczki jądrowej i naświetlając go laserem helowo-neonowym o długości fali 633 nanometrów do czasu całkowitego fotowybielenia. Zazwyczaj wymagane jest ponad dwie minuty.Do komory przepływowej należy wprowadzić 25 µL próbki znakowanego dekstranu rozcieńczonego w buforze transportowym z 1,5% PVP, a następnie przepłukać komorę, przykładając knot z papieru filtrującego. Należy zachować szczególną ostrożność podczas dodawania białek transportowych oraz przepuszczalnych komórek, ponieważ ostrość obrazu może zostać łatwo zaburzona przez każdy gwałtowny ruch. Należy uruchomić przecinkę optyczną z częstotliwością około pięciu herców, aby zapobiec fotoblaknięciu i umożliwić dotarcie nowych porcji niepodlegających fotoblaknięciu pojedynczych cząsteczek do otoczki jądrowej.Należy zarejestrować serię filmów z translokacji pojedynczych cząsteczek natychmiast po dodaniu cząsteczek próbki, aby uchwycić proces translokacji przez kompleksy porów jądrowych. Do oświetlenia trajektorii transportu translokujących cząsteczek należy użyć lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nanometrów, jeśli procedura jest wykonywana prawidłowo. Niniejszy protokół umożliwia zgromadzenie serii obrazów demonstrujących translokację pojedynczych cząsteczek ładunku wchodzących w interakcję z kompleksem porów jądrowych.W przykładzie tym pokazano komórki pom 1 21. Poprzez śledzenie trajektorii przestrzennych poszczególnych cząsteczek transportowanego dekstranu można rozróżnić poszczególne etapy dyfuzji przez otoczkę jądrową. Przedstawiono tutaj zdarzenie przejścia z cytoplazmy do jądra, w którym pojedyncza cząsteczka dekstranu, widoczna jako czerwona plamka, wyruszyła z cytoplazmy, weszła w interakcję z otoczką jądrową, przedstawioną jako zielona linia pikseli, i zakończyła ruch w jądrze.Cząsteczka dekstranu wyruszyła z cytoplazmy, weszła w interakcję z otoczką jądrową i powróciła do cytoplazmy. W tym przykładzie cząsteczka dekstranu wyruszyła z jądra, weszła w interakcję z otoczką jądrową i powróciła do jądra. Natomiast tutaj cząsteczka dekstranu wyruszyła z jądra, weszła w interakcję z otoczką jądrową i zakończyła ruch w cytoplazmie.Poprzez śledzenie trajektorii przestrzennych poszczególnych cząsteczek dekstranu, można wyróżnić poszczególne etapy dyfuzji przez otoczkę jądrową. Trajektorie zdarzenia, przedstawione jako niebieskie linie i puste kropki, zostały wyznaczone i nałożone na otoczkę jądrową, zaznaczoną czarną linią. Linie zielona i czerwona reprezentują odległość 100 nanometrów od otoczki jądrowej po stronie cytoplazmy oraz jądra.Właśnie pokazaliśmy, jak wizualizować translokację pojedynczych cząsteczek przez kompleks porowy jądra z rozdzielczością 10 nanometrów w czasie 400 mikrosekund. Podczas tej procedury ważne jest, aby pamiętać o konieczności uzyskania jak najwyższego stosunku sygnału do szumu oraz o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas przeprowadzania eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami, ponieważ ostrość obrazu może zostać łatwo zaburzona. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek transportu jądrowego

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Opisujemy procedurę wykrywania pierwiastków chemicznych obecnych in situ w komórkach ludzkich, jak również ich kwantyfikację in vitro. Metoda ta jest odpowiednia dla każdego typu komórek i jest szczególnie przydatna do ilościowych analiz chemicznych w pojedynczych komórkach po ekspozycji na nanocząstki tlenku metalu in vitro.

In Situ Wykrywanie i kwantyfikacja pojedynczych komórek nanocząstek tlenków metali za pomocą analizy mikrosondy jądrowej

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Protokół ten opisuje, jak efektywnie konfigurować i wykonywać zautomatyzowane analizy danych obrazowania żywych komórek uzyskanych ze śledzenia transportu nukleocytoplazmatycznego za pomocą narzędzi optogenetycznych.

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

Ten protokół przedstawia wydajny proces pracy dla mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek obrazowania izolowanych jąder Arabidopsis, wykorzystując zoptymalizowane izolację, fiksację i etykietowanie, aby osiągnąć niezawodną wizualizację w skali nanometrów chromatyny i RNA Polimerazy II. To podejście można łatwo dostosować do innych białek związanych z chromatyną lub modyfikacji histonów dla wysokiej rozdzielczości obrazowania.

Stworzenie ujednoliconego protokołu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w jądrach Arabidopsis

Funkcja białek błonowych jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej. Niniejszy artykuł wideo szczegółowo opisuje sposób tworzenia łatki za pomocą elektrod do łatki dwuwarstwowej, a także wykorzystanie kanałów gramicydyny jako reporterów zmienionych właściwości błony.

Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

Poznaj mikroskopię pojedynczych cząsteczek do badania transportu jądrowego w komórkach HeLa. Ta metoda fluorescencyjna pozwala wizualizować dynamikę przemieszczania się cząsteczek przez kompleksy porów jądrowych.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Przeglądaj więcej filmów