JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:14 min • April 30th, 2023
Aby przygotować cienkie odcinki nerki myszy, najpierw zdobądź świeżo pobraną nerkę myszy. Przenieś nerkę na bibułę filtracyjną i wysusz ją, aby zapewnić optymalną przyczepność do uchwytu próbki wibratomowej.
Następnie zamontuj nerkę moczowodem do dołu, używając cienkiej warstwy kleju cyjanoakrylowego nałożonego na podstawę uchwytu próbki wibratomowej, zabezpieczając nerkę w pozycji pionowej. Przenieść uchwyt próbki na tacę buforową.
Napełnij tacę odpowiednim buforem, aby całkowicie zanurzyć górną powierzchnię nerki. Wanna otoczona jest łaźnią lodową, która zapobiega uszkodzeniom tkanek w wyniku gromadzenia się ciepła podczas krojenia. Ustaw ostrze wibratomu pod odpowiednim kątem, prędkością i amplitudą. Dostosuj parametr grubości, aby uzyskać skrawki tkanki o pożądanej grubości.
Podczas pracy ostrze wibruje na boki i przesuwa się, przenikając przez próbkę tkanki. Wibrujące ostrze umożliwia cięcie z mniejszym naciskiem i minimalizuje deformację tkanki, generując jednolite odcinki tkanki nerkowej przy jednoczesnym zachowaniu morfologii tkanki.
W międzyczasie należy zmontować płytkę wielodołkową zawierającą odpowiedni schłodzony roztwór buforowy, aby naśladować warunki fizjologiczne tkanki. Teraz przenieś pokrojone skrawki tkanki do buforu. Na koniec przechowuj skrawki tkanki w niskiej temperaturze do czasu dalszej analizy.
Użyj tępo zakończonych kleszczyków, aby delikatnie chwycić i wyjąć przygotowaną nerkę z lodowatego roztworu KRB. Natychmiast umieść nerkę na bibułie chłonnej na około 2 do 4 sekund, aby usunąć nadmiar wilgoci zewnętrznej. Delikatnie przetoczyć nerkę po bibule chłonnej, aby upewnić się, że wszystkie boki miąższu wyschły, aby zapewnić optymalne przyleganie nerki do etapu wibratomu.
Natychmiast nałóż cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na podstawę płytki próbki wibratomu i za pomocą szczypiec umieść nerkę, moczowodem do dołu, na obszarze pokrytym klejem. Delikatnie uciskaj w dół górną część nerki płaską krawędzią kleszczy przez około 10 do 20 sekund, aby wysuszyć klej.
Mocno przymocować płytkę z próbką do dna tacki buforowej i wyregulować poziom roztworu KRB tak, aby górna część nerki była całkowicie zanurzona. W przypadku automatycznego cięcia wibratomu wybierz pozycję początkową i końcową cyklu cięcia ostrza wibratomu, w odległości od 0.5 do 1 centymetra od nerki, aby upewnić się, że cała płaszczyzna nerki zostanie przecięta.
Rozpocznij automatyczny proces cięcia, upewniając się, że ostrze styka się z nerką. Za pomocą kleszczy zbierz skrawki, które są uwolnione z nerki i natychmiast przenieś je do poszczególnych studzienek.