Wyciszanie genów oparte na odwrotnej transfekcji siRNA in vitro: procedura dostarczania małego interferującego RNA do hodowanych komórek w celu inaktywacji ekspresji genu docelowego

W celu odwrotnej transfekcji małego interferującego RNA lub siRNA, klasy dwuniciowego RNA, do nieprzylegających adipocytów lub komórek tłuszczowych, należy przygotować zawiesinę siRNA ukierunkowaną na określony gen kodujący białko w adipocytach. Dodać odpowiedni odczynnik do transfekcji na bazie kationowych lipidów. Inkubować mieszaninę, aby utworzyć kompleksy transfekcyjne poprzez oddziaływania elektrostatyczne.

Przenieść mieszaninę do pokrytych kolagenem studzienek na płytce wielodołkowej. Kompleksy transfekcyjne unieruchamiają się na powłoce płytki przez niespecyficzne interakcje. Pipetować zawiesinę adipocytów do studzienek zawierających unieruchomione kompleksy transfekcyjne. Adipocyty luźno przylegają do powłoki płytki, zwiększając kontakt fizyczny między komórkami i kompleksami.

Kompleks transfekcyjny łączy się z błoną komórkową i dostarcza siRNA do cytoplazmy. SiRNA, składające się z nici antysensownej z sekwencją komplementarną do docelowego mRNA i nicią sensacyjną, jest rozpoznawane przez wielobiałkowy kompleks wyciszający indukujący RNA lub RISC. SiRNA wiąże się z RISC, a nici rozdzielają się, przy czym nić antysensowna pozostaje związana z kompleksem.

Aktywowany kompleks siRNA-RISC rozpoznaje i wiąże się z komplementarnymi miejscami na docelowym mRNA. Prowadzi to do specyficznego dla sekwencji rozszczepienia mRNA przez białko argonautu kompleksu RISC. Rozszczepione mRNA jest dalej degradowane przez maszynerię komórkową, wyciszając w ten sposób ekspresję docelowego genu.