Analiza całego genomu przy użyciu ChIP w celu identyfikacji celów genów specyficznych dla izoformy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja celów genomowych KDM pięć, Jareda, demetylazy RBB dwóch. Osiąga się to poprzez przygotowanie usieciowanej chromatyny, która jest sonikowana w celu wytworzenia fragmentów DNA o odpowiedniej wielkości w drugim etapie. Dwa związane fragmenty DNA RBB są immunoprecypitowane dwoma przeciwciałami RBB.

Następnie odzyskane genomowe DNA jest amplifikowane metodą PCR w celu sekwencjonowania. Wreszcie, krótkie odczyty sekwencjonowane przez Illumina są jednoznacznie dopasowane do ludzkiego genomu, a znaczące piki są identyfikowane i opisywane do najbliższych genów. W celu identyfikacji rbbb uzyskuje się wyniki dwóch genów docelowych, które pokazują funkcje molekularne związane z Rrb B, dwoma genami docelowymi w oparciu o identyfikację całego genomu Rbbb, dwóch wzbogaconych regionów.

Cześć, jestem Mike. Ona z laboratorium dr Elizabeth Bencia na Wydziale Biochemii i Genetyki Molekularnej Uniwersytetu Illinois w Chicago. A ja jestem ala z laboratorium genomiki biomedycznej prowadzonego przez dr NGA w BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea.

A ja nazywam się Danielle Dal. A ja nazywam się William Richter. Oboje jesteśmy również w Laboratorium Umiejętności Życzliwości.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę chromatyny, immunoprecypitacji i sekwencjonowania. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do zbadania miejsca wiązania jego dermatologa. Więc zacznijmy.

Aby rozpocząć tę procedurę, wyhoduj około 10 do ósmych komórek. Dla każdej immunoprecypitacji lub ip. Tutaj rozlany chłoniak osteolityczny.

U 9 37 komórek stosuje się i indukuje do różnicowania monocytarnego za pomocą TPA przez 96 godzin po wzroście komórek w roztworze formaldehydu bezpośrednio do pożywki do końcowego stężenia 1%Następnie krótko zakręcić kolbą i pozostawić ją w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie odessać pożywkę i przepłukać komórki 15 mililitrami lodowatego PBS. Powtórz to pranie raz.

Następnie dodaj sześć mililitrów buforu do lizy po jednym do każdej z kolb na lodzie. Następnie kołysz kolbami przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na koniec zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieś je do 15-mililitrowych stożkowych probówek.

W tym momencie komórki mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Jeśli komórki były zamrożone, wyrzuć je. Po rozmrożeniu odwiruj komórki i wyrzuć snat.

Następnie ponownie zawieś komórki w sześciu mililitrach drugiego buforu do lizy, delikatnie kołysz probówkami w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórz wirowanie i ponownie zawieś komórki w 2,5 mililitra trzeciego buforu do lizy. Następnie przygotuj zawiesinę do sonikacji, umieszczając ją w zlewce z lodowatą wodą z mikrokońcówką soniera Branson 450 ustawioną na amplitudę od 50 do 60%.

Sonikuj roztwór do 32-giego stałego wybuchu i ostudź na lodzie. Przez minutę powtarzaj te impulsy od 10 do 15 razy, a następnie pipetuj zawartość probówki w górę iw dół i przenieś ją do nowej probówki. Kontynuuj pulsowanie i chłodzenie roztworu.

Dodatkowe pięć razy po sonikacji dodać 10% Triton X 100 do jednej dziesiątej objętości roztworu. Następnie przenieś lizaty do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych i odwiruj zanieczyszczenia w mikrowirówce przed chromatyną, immunoprecypitacją lub chipem. Zaoszczędź 50 mikrolitrów lizatu komórkowego jako próbkę wejściową.

Następnie połączono oczyszczony lizat komórkowy z kulkami dyny związanymi z przeciwciałem, które zostało wcześniej przygotowane zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Przez noc rozbujaj mieszaninę wraz z próbką wejściową o pojemności 50 mikrolitrów w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj koraliki jednym mililitrem buforu do mycia.

Następnie użyj podstawki magnetycznej, aby zebrać koraliki i usunąć supernatant. Powtórz to pranie sześć do ośmiu razy. Wykonaj końcowe płukanie jednym mililitrem TE plus 50 milimolowym chlorkiem sodu.

Po odwirowaniu odwirować kulki w mikrowirówce, odessać resztki buforu TE. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu elu do próbek. Zaraz po tym.

Próbki należy inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Zdrapuj rurki o 1.5-mililitrową rurkę co dwie minuty, aby utrzymać koraliki w zawieszeniu. Zbierz kulki za pomocą wirówki i stojaka magnetycznego i przenieś SNAT do probówki A PCR.

Następnie pobrać wcześniej zapisaną próbkę wejściową i dodać trzy objętości buforu elucyjnego. Na koniec umieść IP i wprowadź próbki do termocyklera na noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Aby odwrócić wiązania krzyżowe następnego dnia, dodać do próbek jedną objętość buforu TE.

Następnie dodaj RNA A do końcowego stężenia 0,2 mikrograma na mikrolitr. Inkubować próbki w termocyklerze przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji dodać proteinazę K do końcowego stężenia 0,2 mikrograma na mikrolitr.

Następnie inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie należy raz wyekstrahować próbki jedną objętością fenolu. Ekstrahować próbki po raz drugi jedną objętością alkoholu izoamylowego fenylochloroformu.

Na koniec ponownie wyekstrahować próbki jedną objętością chloroformowego alkoholu izoamylowego. Następnie dodaj 30 mikrogramów glikogenu do każdej próbki. Do próbek należy również dodać chlorek sodu do końcowego stężenia 0,2 mola i dwie objętości etanolu.

Inkubuj je przez 30 minut w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po inkubacji odwirować próbki i zdekantować snat. Umyj granulki 500 mikrolitrami 75% etanolu, a następnie wysusz granulki i ponownie zawieś je w 40 mikrolitrach wody.

Aby sprawdzić rozmiary fragmentów DNA wytworzonych w procedurze SONIKACJI, należy załadować pięć mikrogramów oczyszczonej próbki wejściowej do 1,8% agrożelu i uruchomić żel. Procedura sonikacji powinna wytworzyć fragmenty w zakresie od 150 do 350 par zasad. Jednakże, jeśli fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, procedura sonikacji powinna być dostosowana poprzez zmianę liczby impulsów i amplitudy przed amplifikacją genomowego DNA.

Sprawdź wielkość, stężenie i wzbogacenie próbek zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Aby rozpocząć amplifikację genomowego DNA, należy uzyskać 34 mikrolitry próbki IP i 200 nanogramów próbki wejściowej. Wykonaj i napraw dodawanie i ligację ogona adapterów do fragmentów DNA za pomocą zestawu do przygotowywania próbek genomowego DNA Illumina, jak opisano w pisemnym protokole.

Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania mini lut PCR, a następnie wymyj je w buforze EB, który został wstępnie podgrzany do 50 stopni Celsjusza. Użyj odpowiednio 23 mikrolitrów i 46 mikrolitrów dla IP i wejściowych próbek DNA. Wykonaj reakcję PCR przy użyciu 23 mikrolitrów DNA z adapterami 25 mikrolitrów fuzji, polimerazy DNA z zestawu.

Jeden mikrolitr 20 mikromolowej podeszwy PCR jeden i jeden mikrolitr 20 mikromolowych. Tak więc PCR drugi uruchamia reakcję PCR zgodnie z opisem w pisemnym protokole po amplifikacji PCR. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania Qiagen mini loop PCR.

Rozgrzej 15 mikrolitrów buforu EB do 50 stopni Celsjusza i rozcieńcz DNA, rozcieńcz 0,5 mikrolitra próbki od jednego do czterech i wykonaj odczyt NanoDrop w celu oczyszczenia amplifikowanych produktów. Przygotuj 1,8% żel AGROS o objętości 50 mililitrów, używając wody klasy HPLC, dodaj TAE i bromek po stopieniu agros. Następnie wlej żel, załaduj żel.

Po dodaniu czterech mikrolitrów buforu ładującego do próbek wejściowych i IP, uruchom żel pod napięciem 120 woltów przez 45 minut. Przeanalizuj żel po jego uruchomieniu. Powinno to ujawnić, że wytwarzane są fragmenty w zakresie od 150 do 350 par zasad.

Reprezentują one fragmenty genomowego DNA o długości od 50 do 250 par zasad. A adapter wycina obszar żelu zawierającego materiał w zakresie od 150 do 350 par zasad za pomocą skalpela. Uważaj, aby nie wyciąć pasma adaptera adaptera, który działa przy około 120 parach zasad.

Odzyskaj DNA za pomocą zestawu do szybkiej ekstrakcji żelu kajakowego zgodnie z instrukcjami producenta. Wysuszyć próbkę dokładnie do 11 mikrolitrów z prędkością powrotną bez ciepła. Usunąć jeden mikrolitr próbki i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop.

Na koniec zidentyfikuj wzbogacone produkty genów za pomocą analizatora genomu Illumina i przeanalizuj miejsca wiązania i geny docelowe zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Współrzędne genomowe zidentyfikowanych wzbogaconych regionów wiązania białka RB dwa lub dwóch regionów wiązania RBP przedstawiono w formacie chromosomowym. Zajętość genów zespołowych w chromosomach można zwizualizować jako czarne VAR.

Tutaj zajętość chromosomu 10 jest pokazana rbp, dwa regiony wiązania są pokazane jako pionowe linie. Środkowy panel pokazuje wszystkie rbp dwa regiony wiążące izoformy na chromosomie 10, a dolny panel pokazuje rbp dwa duże regiony wiążące izoformy. Informacje te dają przegląd nakładających się na siebie i specyficznych zajęć dwóch izoform RBP na chromosomie 10.

Tutaj pokazana jest mapa cieplna ze wskaźnikiem fałszywych odkryć lub skorygowanym FDR znacznie wzbogaconą ontologią genów lub kategoriami funkcji molekularnych GO wśród genów związanych przez rbp. Dwa kolory w kierunku czerwonego wskazują na wysoką istotność statystyczną. Kolor żółty oznacza niską istotność statystyczną, a kolor szary oznacza brak istotności statystycznej.

Analiza wzbogacenia pokazuje nakładające się i specyficzne dla izoformy funkcje molekularne dwóch docelowych genów R BP. Właśnie pokazaliśmy, jak zidentyfikować miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego podczas tej procedury. Ważne jest, aby wyprodukować fragmenty DNA o odpowiednim zakresie wielkości i wydajności.

Można to osiągnąć, postępując zgodnie z naszymi wskazówkami na etapie SONIKACJI. Więc to wszystko. Powodzenia w eksperymentach i dziękuję za oglądanie.