Name: Analiza całego genomu przy użyciu ChIP w celu identyfikacji celów genów specyficznych dla izoformy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę ChIP-Seq do identyfikacji celów genomowych demetylazy histonowej KDM5A/RBP2. Technika ta pozwala analizować interakcje białko-DNA i epigenetyczną regulację genów w komórkach ludzkich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant 115347-RSG-08-271-01-GMC z ACS oraz grant CA138631 z NIH.

Protokół został pierwotnie zaadaptowany z pracy B. Ren, 2001. Stanowi on niewielką modyfikację protokołu opracowanego przez Odom i wsp.5, który znajduje się pod adresem <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a>
1. Preblokowanie i wiązanie przeciwciał z kulkami magnetycznymi (Należy przeprowadzić wieczorem w dniu poprzedzającym kolejny etap)
<ol>
 <li> Przemyj 100 μL kulek Dynabeads Protein G (na jedną IP, połącz w przypadku wielu IP) w 1 mL świeżego roztworu BSA/PBS (50 mg BSA w 10 mL PBS – roztwór ten zachowuje stabilność przez jeden tydzień). </li>
 <li>Zbierz kulki za pomocą statywu magnetycznego i powtórz procedurę płukania jeszcze dwa razy. </li>
 <li> Następnie dodaj 10 μg przeciwciała do 250 μl zawiesiny kulek w roztworze PBS/BSA (na jedną IP) i inkubuj przez noc na platformie rotacyjnej w temperaturze 4°C.</li>
 <li> Po zakończeniu przemyj kulki trzy razy w 1 ml roztworu PBS/BSA, a następnie resuspenduj w 10 μl roztworu PBS/BSA (na jedną IP).</li>
</ol>
2. Sieciowanie komórek
<ol>
 <li>Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować około 108 komórek na każdą immunoprecypitację (IP). W tym przypadku zastosowano komórki chłoniaka histiocytarnego U937, których różnicowanie w kierunku monocytarnym indukowano za pomocą TPA przez 96 godzin.</li>
 <li>Po namnożeniu komórek należy dodać roztwór formaldehydu bezpośrednio do pożywki do stężenia końcowego 1%. Następnie krótko zakręcić kolbami i pozostawić je w temperaturze pokojowej na 10 minut. Po tym czasie należy odessać pożywkę i wypłukać komórki 15 mL lodowatego PBS. Czynność tę należy powtórzyć raz.</li>
 <li>Następnie do każdej kolby, znajdującej się w lodzie, należy dodać 6 mL Buforu Lizującego 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolu, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100, zawierającego inhibitory proteaz). Następnie kolby należy inkubować na wytrząsarce przez 20 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Na koniec komórki należy zebrać za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do 15 mL probówek stożkowych. Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze -80°C.</li>
</ol>
3. Sonikacja komórek
<ol>
 <li>Jeśli komórki były zamrożone, należy je rozmrozić. Po rozmrożeniu odwirować komórki przy 3,000 rpm przez 10 minut w 4°C i odrzucić nadsącz. Następnie zawiesić komórki ponownie w 6 mL Buforu Lizującego 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5 mM EGTA, zawierającego inhibitory proteaz). Delikatnie inkubować probówki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
 <li>Powtórzyć wirowanie i zawiesić komórki ponownie w 2,5 mL Buforu Lizującego 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 0,1% dejksykolanu sodu, 0,5% N-lauroylosarkozyny, zawierającego inhibitory proteaz).</li>
 <li>Następnie przygotować zawiesinę do sonikacji, umieszczając ją w zlewce z lodowatą wodą, używając mikrokońcówki sonikatora Branson 450 ustawionego na amplitudę od 50 do 60%.</li>
 <li>Sonikować roztwór w jednym stałym impulsie przez 30 sekund, a następnie chłodzić na lodzie przez 1 minutę. Powtórzyć te cykle od 10 do 15 razy. Następnie pipetować zawartość probówki w górę i w dół, a potem przenieść ją do nowej probówki. Kontynuować pulsacyjne sonikowanie i chłodzenie roztworu jeszcze 5 razy.</li>
 <li>Po sonikacji dodać 10% Triton X-100 w ilości odpowiadającej 1/10 objętości roztworu. Przenieść lizaty do probówek wirówek o pojemności 1,5 mL i odwirować resztki komórkowe w mikrowirówce. Następnie przenieść lizat komórkowy do nowej probówki.</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja chromatyny
<ol>
 <li>Przed immunoprecypitacją chromatyny, czyli ChIP, należy odstawić 50 μL lizatu komórkowego jako próbkę wejściową (input). Następnie oczyszczony lizat komórkowy należy połączyć z Dynabeads uprzednio związanymi z przeciwciałem, przygotowanymi zgodnie z powyższym opisem. Mieszaninę, a także próbkę wejściową 50 μL, należy inkubować na wytrząsarce w temperaturze 4°C przez noc.</li>
 <li>Kuleczki należy przemyć 1 mL Buforu do Mycia (50 mM HEPES-KOH, pH 7.6, 0.5 M LiCl, 1mM EDTA, 0.7% deoksycholan sodu, 1% NP-40). Następnie, przy użyciu statywu magnetycznego, należy zebrać kuleczki i usunąć nadsącz. Czynność tę należy powtórzyć od 6 do 8 razy.</li>
 <li>Należy przeprowadzić końcowe przemycie przy użyciu 1 mL TE-plus-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Kuleczki należy wirować w mikrowirówce przy 3,000 rpm przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Po wirowaniu należy odessać resztki buforu TE.</li>
 <li>Następnie do próbek należy dodać 100 μL Buforu do Elucji (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Bezpośrednio po tym próbki należy inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 do 15 minut. Co 2 minuty należy potrząsnąć probówkami o statyw do probówek 1,5 mL, aby utrzymać kuleczki w zawiesinie.</li>
 <li>Kuleczki należy zebrać poprzez wirowanie i przy użyciu statywu magnetycznego, a nadsącz przenieść do probówki PCR. Następnie należy pobrać wcześniej odstawioną próbkę wejściową i dodać do niej 3 objętości Buforu do Elucji.</li>
 <li>Na koniec próbki IP i wejściowe należy umieścić w termocyklerze na noc w temperaturze 65 °C w celu odwrócenia wiązań krzyżowych.</li>
 <li>Następnego dnia do próbek należy dodać 1 objętość buforu TE. Następnie należy dodać RNazę A do stężenia końcowego 0.2 μg/μL. Próbki należy inkubować w termocyklerze przez 1 do 2 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Po inkubacji należy dodać proteinazę K do stężenia końcowego 0.2 μg/μL. Następnie próbki należy inkubować w termocyklerze w temperaturze 55 °C przez 2 godziny.</li>
 <li>W kolejnym kroku próbki należy poddać jednokrotnej ekstrakcji jedną objętością fenolu. Próbki należy ekstrahować po raz drugi jedną objętością mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy. Na koniec próbki należy ekstrahować jeszcze raz jedną objętością mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy.</li>
 <li>Następnie do każdej próbki należy dodać 30 μg glikogenu. Należy również dodać NaCl do stężenia końcowego 0.2 M oraz dwie objętości etanolu. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze -80 °C. Po inkubacji próbki należy odwirować, a nadsącz odlać. Osady należy przemyć 500 μL 75% etanolu. Następnie osady należy wysuszyć i resuspenderować w 40 μL wody.</li>
 <li>Aby sprawdzić wielkość fragmentów DNA powstałych w wyniku sonikacji, należy nałożyć 5 μg oczyszczonej próbki wejściowej na żel agarozowy 1.8% i przeprowadzić elektroforezę. Procedura sonikacji powinna generować fragmenty w zakresie 150-350 par zasad. Jeśli jednak fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, należy skorygować parametry sonikacji, zmieniając liczbę impulsów oraz amplitudę.</li>
 <li>Aby sprawdzić powtarzalność i swoistość ChIP, należy ocenić wzbogacenie w kontrolnych regionach wiązania, przeprowadzając genowo-specyficzną PCR z użyciem 1 μl próbek IP oraz serii rozcieńczeń próbki wejściowej. W celu przetestowania jakości próbek IP i wejściowych należy wybrać od dwóch do trzech regionów „związanych” oraz jeden niezwiązany region kontrolny.</li>
</ol>
5. Amplifikacja DNA genomowego
<ol>
 <li> Rozpoczynając od 34 μl próbki IP lub 200 ng próbki wejściowej (input), przeprowadzić naprawę końców, dodanie ogona 'A' oraz ligację adapterów do fragmentów DNA przy użyciu zestawu Genomic DNA Sample Prep Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc., San Diego, CA). </li>
 <li> Oczyścić DNA za pomocą zestawu MinElute PCR Purification Kit, a następnie eluować je w buforze EB (10 mM Tris Cl, pH 8.5) uprzednio podgrzanym do 50 °C. Na przykład użyć odpowiednio 23 μL i 46 μL do końcowej elucji próbek DNA IP oraz wejściowych.</li>
 <li> Przygotować reakcję PCR, używając 23 μL DNA z adapterami, 25 μL polimerazy DNA Phusion z zestawu, 1 μL 20 μM Sol_PCR_1 oraz 1 μL 20 μM Sol_PCR_2. Reakcję PCR przeprowadzić w następujący sposób: 1) 30 sekund w 98°C; 2) 10 sekund w 98°C; 3) 30 sekund w 65°C; 4) 30 sekund w 72°C; powtarzać kroki 2-4 18 razy, następnie 5 minut w 72°C i na koniec inkubować w 4°C.</li>
 <li> Po amplifikacji PCR oczyścić DNA za pomocą zestawu QIAGEN MinElute PCR Purification Kit. Podgrzać 15 μL buforu EB do 50 °C i eluować DNA. Rozcieńczyć 0,5 μL próbki w stosunku 1:4 i wykonać pomiar spektrofotometrem Nanodrop.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie produktów amplifikacji za pomocą żelu
<ol>
 <li>Aby oczyścić produkty amplifikacji, przygotuj 50 mL 1,8% żelu agarozowego, używając wody klasy HPLC. Po roztopieniu agarozy dodaj bufor TAE oraz bromek etydyny. Następnie wlej żel do formy. Po dodaniu 4 μL buforu do ładowania do próbek wejściowych (input) oraz IP, nałóż je na żel. Następnie prowadź elektroforezę przy napięciu 120 V przez 45 minut.</li>
 <li>Przeanalizuj żel po zakończeniu elektroforezy. Na żelu powinny być widoczne fragmenty w zakresie od 150 do 350 par zasad. Reprezentują one fragmenty DNA genomicznego o długości od 50 do 250 par zasad oraz adapter.</li>
 <li>Za pomocą skalpela wytnij z żelu obszar zawierający materiał w zakresie od 150 do 350 par zasad. Należy uważać, aby nie wyciąć prążka adapter-adapter, który znajduje się na poziomie około 120 par zasad. Odzyskaj DNA za pomocą zestawu QIAquick Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami producenta. W szczególności użyj jednej kolumny z zestawu QIAquick Gel Extraction Kit dla fragmentu żelu o masie 400 mg lub mniej. Aby rozpocząć proces ekstrakcji, dodaj 3 objętości buforu QG do 1 objętości żelu. Dodaj 1 objętość izopropanolu i nałóż mieszaninę na kolumnę. Do przemycia kolumny użyj 0,5 ml buforu QG, a następnie postępuj zgodnie ze standardową procedurą opisaną w instrukcji zestawu. Do elucji DNA użyj H2O wstępnie podgrzanej do 50°C. Inkubuj kolumnę z 30 μl H2O przez 5 minut w temperaturze 37°C przed wirowaniem.</li>
 <li>Odparuj próbkę w Speedvacu bez użycia ciepła do objętości dokładnie 11 μL. Pobierz 1 μL próbki i zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop.</li>
 <li>Na koniec zidentyfikuj wzbogacone produkty genowe przy użyciu Illumina Genome AnalyzerIIe, zgodnie z opisem w <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf</a> 6.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Schemat procesu immunoprecypitacji chromatyny, etapy od sieciowania do analizy wiązania genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zidentyfikowanie celów genomicznych demetylazy histonowej KDM5A/JARID1A/RBP2.
(P1) Osiąga się to poprzez przygotowanie sieciowo powiązanej chromatyny, która jest poddawana sonikacji w celu uzyskania fragmentów DNA o odpowiedniej wielkości. (P2) W drugim kroku fragmenty DNA związane z RBP2 są immunoprecypitowane przy użyciu przeciwciał przeciwko RBP2. (P3) Następnie odzyskane fragmenty DNA są naprawiane na końcach, a do końców DNA genomicznego ligowane są adaptery w celu przygotowania bibliotek DNA genomicznego do analizy w komórkach przepływowych w systemie Illumina Cluster Station. Biblioteki DNA są amplifikowane metodą PCR z wykorzystaniem niewielkiej liczby cykli. (P4) Na koniec krótkie odczyty sekwencjonowane w systemie Illumina są jednoznacznie mapowane do genomu ludzkiego, a następnie identyfikowane są istotne piki i przypisywane im najbliższe geny w celu zidentyfikowania regionów wzbogaconych w RBP2. (P5) Wyniki pozwalają na określenie funkcji molekularnych związanych z genami docelowymi RBP2 na podstawie ogólnogenomowej identyfikacji regionów wzbogaconych w RBP2.
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Wynik elektroforezy żelowej, rozdział DNA, drabinka 100 bp, próbka U937, kontrola, prążek 350 bp." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Kontrola wyników sonikacji chromatyny W celu sprawdzenia wielkości fragmentów DNA powstałych w wyniku procedury sonikacji, na żel agarozowy 1,8% naniesiono 5 μg (1/10) oczyszczonej próbki wejściowej. Zgodnie z oczekiwaniami, zastosowana procedura sonikacji doprowadziła do powstania fragmentów w zakresie 150-350 bp. Jeżeli jednak fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, należy odpowiednio skorygować procedurę sonikacji, zmieniając liczbę cykli oraz amplitudę.
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Żel elektroforetyczny pokazujący fragmenty DNA; markery wielkości, prążek adapter-adapter, próbki IP." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Oczyszczanie produktów amplifikacji za pomocą żelu. Produkty PCR są rozdzielane w żelu w celu usunięcia adapterów i wyselekcjonowania zakresu wielkości matryc dla platformy generowania klastrów. Żel ten pokazuje, że powstały fragmenty o wielkości od 150 do 350 par zasad. Reprezentują one fragmenty genomowego DNA o długości od 50 do 250 par zasad oraz adapter. Wycinamy wybrany obszar żelu za pomocą skalpela. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć prążka adapter-adapter, który znajduje się na wysokości około 120 par zasad.
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Schemat izoform RBP2; domeny białkowe, regiony aminokwasowe, przeciwciała do analizy dużych i małych izoform." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Przeciwciała specyficzne dla izoform pozwalają na rozróżnienie dużych i małych izoform RBP2. Struktura białka RBP2 przedstawiona jest w widoku domen. RBP2 zawiera kilka domen: katalityczną domenę JmjC odpowiedzialną za demethylację histonów wraz z powiązaną domeną JmjN, domenę ARID zdolną do swoistego wiązania sekwencji DNA, palec cynkowy C5HC2, który może potencjalnie oddziaływać z DNA lub innymi białkami, oraz liczne domeny PHD. Dwa przeciwciała anty-RBP2, które umożliwiają rozróżnienie izoform RBP2, zostały opracowane przeciwko fragmentom RBP2 wskazanym pogrubionymi liniami.
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Mapowanie chromosomowe; schemat; chromosom 10; lokalizacje genów; izoformy; analiza genetyczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5a"> 
 Rycina 5a. Przegląd regionów wiązania RBP2 wraz z chromosomem i genami Ensembl. Współrzędne genomiczne zidentyfikowanych wzbogaconych regionów wiązania RBP2 (wszystkie izoformy oraz izoforma długa) przedstawiono w układzie chromosomowym. Położenie genów Ensembl (wersja 54; hg18) w chromosomach (na tym obrazku chromosom 10) przedstawiono w formie czarnych pasków (górny panel). Każdy region wiązania RBP2 jest reprezentowany przez linię pionową, gdzie panel środkowy pokazuje regiony wiązania wszystkich izoform RBP2 na chromosomie 10, a panel dolny pokazuje regiony wiązania długiej izoformy RBP2. Panele środkowy i dolny zapewniają przegląd nakładających się i specyficznych obszarów zajmowania chromosomu 10 przez izoformy RBP2.
 <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Diagram ontologii genów funkcji izoform RBP2, z wyróżnieniem wiązania nukleotydów i transkrypcji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5b"> 
 Rycina 5b. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego genów docelowych RBP2. Mapa ciepła przedstawiająca istotnie (p-value ≤0.05) wzbogacone kategorie GO Molecular Function po korekcie FDR wśród genów wiązanych przez RBP2 (wszystkie izoformy oraz izoformy duże; geny położone najbliżej regionu wiązania RBP2). Kolory w stronę czerwieni wskazują wysoką istotność statystyczną, żółty wskazuje niską istotność statystyczną, a szary brak istotności statystycznej. Analiza wzbogacenia pokazuje wspólne oraz specyficzne dla danej izoformy funkcje molekularne genów docelowych RBP2.

<ol><li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li>
<li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li>
<li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li>
<li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li>
<li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Różnice funkcjonalne między izoformami RBP2 nie zostały jeszcze określone. Zastosowaliśmy kompleksowe podejście w celu zidentyfikowania regionów genomicznych związanych z izoformami RBP2 oraz zdefiniowania kategorii funkcjonalnych reprezentowanych przez te regiony. Osiągnięto to poprzez analizę ChIP-Seq, a następnie bioinformatyczną analizę uzyskanych odczytów sekwencji.

RBP2 modyfikuje zmetylowane reszty lizyny w ogonach histonów. Stwierdziliśmy, że duża izoforma RBP2, zawierająca moduł rozpoznawania zmetylowanej lizyny histonowej, oraz mała izoforma RBP2, pozbawiona tego modułu, wiążą się z różnymi regionami w ludzkim genomie (Rycina 5A). Co istotne, regiony specyficzne dla danych izoform oraz regiony nakładające się należą do genów o różnych funkcjach molekularnych (Rycina 5B). Na przykład funkcje „wiązania chromatyny” oraz „wiązania czynników transkrypcyjnych” można przypisać genom będącym celami małej izoformy RBP2, ale nie dużej izoformy RBP2 (Rycina 5B). Porównując rzeczywiste zestawy genów wygenerowane dla wszystkich izoform oraz dla dużej izoformy RBP2 (dane nie pokazano), możemy również określić, czy duża izoforma jest specyficznie rekrutowana do określonych genów.

<table><tbody><tr><td>37% roztwór formaldehydu</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>10852</td><td></td></tr><tr><td>chloroform/alkohol izoamylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania próbek genomowego DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-102-1001</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>glikogen</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Marker wielkości DNA o niskiej masie cząsteczkowej</td><td>New England Biolabs</td><td>N3233S</td><td></td></tr><tr><td>deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroilosarkozyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>194008</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>mt21040cv</td><td></td></tr><tr><td>fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540S</td><td></td></tr><tr><td>proteinaza K</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25530-049</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAquick PCR purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Invitrogen</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>bufor TE (z zestawu endofree do maxi-prep)</td><td>Qiagen</td><td>19048</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Agarose, certyfikowana o niskim zakresie rozdzielczości</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sekwencje oligonukleotydów 2006 Illumina, Inc. Wszelkie prawa zastrzeżone.&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt;Sol_PCR_1&lt;br/&gt;Sekwencja 5&amp;rsquo;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3&amp;rsquo;&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sol_PCR_2&lt;br/&gt;Sekwencja 5&amp;rsquo;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3&amp;rsquo;&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody chip w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Rekrutacja czynników transkrypcyjnych i epigenetycznych do ich celów jest kluczowym etapem ich regulacji. Istotną rolę w rekrutacji odgrywają domeny białkowe wiążące specyficzne modyfikacje histonów. Jedną z takich domen jest domena homeodomeny roślinnej (PHD), występująca w kilku białkach wiążących chromatynę. Czynnik epigenetyczny RBP2 posiada wiele domen PHD, jednak pełnią one różne funkcje (Rycina 4). W szczególności domena PHD C-końcowa, występująca w onkogennej fuzji RBP2 w białaczce u ludzi, wiąże trimetylowaną lizynę 4 w histonie H3 (H3K4me3)1. Transkrypty odpowiadające izoformie RBP2 zawierającej C-końcową domenę PHD kumulują się podczas różnicowania promonocytowych komórek U937 pochodzących z chłoniaka w monocyty2. Zgodnie z obydwoma zestawami danych, analiza w skali całego genomu wykazała, że w zróżnicowanych komórkach U937 białko RBP2 lokalizuje się w regionach genomowych silnie wzbogaconych w H3K4me33. Lokalizacja RBP2 w jego celach koreluje ze spadkiem poziomu H3K4me3 wynikającym z aktywności demetylazy histonowej RBP2 oraz ze spadkiem aktywności transkrypcyjnej. W przeciwieństwie do niej, dwie pozostałe domeny PHD białka RBP2 nie są w stanie wiązać H3K4me3. Co istotne, C-końcowa domena PHD białka RBP2 nie występuje w mniejszej izoformie RBP24. Można przypuszczać, że mała izoforma RBP2, której brakuje oddziaływania z H3K4me3, różni się od większej izoformy pod względem lokalizacji genomowej. Różnica w lokalizacji genomowej izoform RBP2 może wyjaśniać obserwowaną różnorodność funkcji RBP2. Konkretnie, RBP2 jest kluczowym elementem różnicowania komórkowego pośredniczonego przez białko retinoblastomy (pRB). Zgodnie z tymi danymi, wcześniejsza analiza w skali całego genomu, bez rozróżnienia na izoformy, zidentyfikowała dwie odrębne grupy genów docelowych RBP2: 1) geny wiązane przez RBP2 w sposób niezależny od różnicowania; 2) geny wiązane przez RBP2 w sposób zależny od różnicowania.
W celu zidentyfikowania różnic w lokalizacji między izoformami przeprowadziliśmy analizę lokalizacji w całym genomie za pomocą metody ChIP-Seq. Używając przeciwciał wykrywających obie izoformy RBP2, zlokalizowaliśmy wszystkie cele RBP2. Dodatkowo dysponujemy przeciwciałami, które wiążą się wyłącznie z dużą, a nie z małą izoformą RBP2 (Rycina 4). Po zidentyfikowaniu celów dużej izoformy można je odjąć od wszystkich celów RBP2, aby ujawnić cele małej izoformy. Dane te wykazują wpływ domeny oddziałującej z chromatyną na rekrutację białka do jego miejsc wiązania w genomie.

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Rekrutacja czynników transkrypcyjnych i epigenetycznych do ich celów jest kluczowym etapem ich regulacji. Istotną rolę w procesie rekrutacji odgrywają...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zidentyfikowanie genomowych celów KDM5A (KDM5A), demetylazy histonowej RBB2. Jest to realizowane poprzez przygotowanie sieciowanej chromatyny, która w drugim kroku zostaje poddana sonikacji w celu uzyskania fragmentów DNA o odpowiedniej wielkości. Fragmenty DNA związane z RBB2 są następnie immunoprecypitowane za pomocą przeciwciał przeciwko RBB2.Następnie odzyskano genomowe DNA poddaje się amplifikacji metodą PCR w celu sekwencjonowania. W końcowym etapie krótkie odczyty z sekwencjonowania Illumina są jednoznacznie dopasowywane do genomu ludzkiego, a następnie identyfikuje się istotne piki i przypisuje je do najbliższych genów. Aby zidentyfikować Rbbb dwa geny docelowe, uzyskuje się wyniki wskazujące na funkcje molekularne związane z Rrb B dwoma genami docelowymi na podstawie ogólnogenomowej identyfikacji regionów wzbogaconych w Rbbb dwa.Cześć, jestem Mike. Pochodzę z laboratorium dr Elizabeth Bencia z Katedry Biochemii i Genetyki Molekularnej na University of Illinois w Chicago. A ja jestem Ala z laboratorium genomiki biomedycznej prowadzonego przez dr NGA w BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea.Jestem Danielle Dal. A ja jestem William Richter. Oboje pracujemy również w Benevolence Skill Lab.Dzisiaj przedstawimy procedurę immunoprecypitacji i sekwencjonowania chromatyny. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania miejsc wiązania histonów. Zacznijmy zatem.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować około 10⁸ komórek na każdą immunoprecypitację (ip) chłoniaka osteolitycznego typu rozlanego.Komórki U 9 37 są wykorzystywane i indukowane do różnicowania monocytarnego za pomocą TPA przez 96 godzin po wzroście komórek; do medium dodaje się bezpośrednio roztwór formaldehydu do stężenia końcowego 1%. Następnie krótko zakręć kolbą i pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie odessij medium i wypłucz komórki 15 mililitrami lodowatego PBS. Powtórz to płukanie raz.Następnie do każdej z kolb znajdujących się w lodzie należy dodać 6 ml buforu lizującego 1. Kolby należy inkubować w ruchu obrotowym przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Na koniec komórki należy zebrać za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.Na tym etapie komórki można przechowywać w temperaturze -80 °C. Jeśli komórki zostały zamrożone, należy je rozmrozić. Po rozmrożeniu komórki należy odwirować, a nadsącz usunąć.Następnie komórki resuspenduj w 6 ml buforu lizującego dwa i delikatnie mieszaj probówki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórz wirowanie, a następnie resuspenduj komórki w 2,5 ml buforu lizującego trzy. Następnie przygotuj zawiesinę do sonikacji, umieszczając ją w zlewce z lodowatą wodą, używając mikrokońcówki sonikatora Branson 450 z amplitudą ustawioną w zakresie od 50 do 60%.Poddaj roztwór sonikacji w stałych seriach trwających po 32 s i chłodź na lodzie. Powtarzaj te impulsy od 10 do 15 razy w ciągu jednej minuty, a następnie pipetuj zawartość probówki w górę i w dół i przenieś ją do nowej probówki. Kontynuuj impulsową sonikację i chłodzenie roztworu.Pięć kolejnych razy po sonikacji należy dodać 10% Triton X 100 w ilości odpowiadającej 1/10 objętości roztworu. Następnie lizaty należy przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i odwirować pozostałości w mikrowirówce przed przeprowadzeniem immunoprecypitacji chromatyny lub Chip. 50 µl lizatu komórkowego należy zachować jako próbkę wejściową (input).Następnie oczyszczony lizat komórkowy połączono z kulkami dyna beads związanymi z przeciwciałem, które przygotowano wcześniej zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Mieszaninę, wraz z próbką wejściową o objętości 50 µL, inkubowano w ruchu obrotowym w temperaturze 4 °C przez noc. Kulki przemyto 1 mL buforu do płukania.Następnie należy użyć statywu magnetycznego w celu zebrania kulek i usunąć nadsącz. Płukanie to należy powtórzyć od sześciu do ośmiu razy. Na koniec należy przeprowadzić płukanie końcowe za pomocą 1 mL buforu TE z dodatkiem 50 mM chlorku sodu.Po wirowaniu odwiruj kuleczki w mikrocentry fudze, a następnie odessaj pozostały bufor TE. Następnie dodaj do próbek 100 µL buforu eluującego. Zrób to niezwłocznie.Inkubować próbki w temperaturze 65 °C przez 10 do 15 minut. Co dwie minuty pocierać probówki o statyw do probótek 1,5 ml, aby utrzymać koraliki w zawiesinie. Zebrać koraliki za pomocą wirowania oraz statywu magnetycznego, a następnie przenieść SNAT do probówki PCR.Następnie należy odzyskać wcześniej zapisaną próbkę wejściową i dodać trzy objętości buforu eluującego. Na koniec próbki IP i wejściowe należy umieścić w termocyklerze na noc w temperaturze 65 °C. Aby następnego dnia odwrócić wiązania krzyżowe, do próbek należy dodać jedną objętość buforu TE.Następnie należy dodać RNA A do stężenia końcowego 0,2 µg/µL. Próbki należy inkubować w termocyklerze przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37 °C. Po inkubacji dodaje się proteinazę K do stężenia końcowego 0,2 µg/µL.Następnie inkubuj próbki w termocyklerze w temperaturze 55 °C przez dwie godziny. Następnie poddaj próbki jednej ekstrakcji, używając jednej objętości fenolu. Przeprowadź drugą ekstrakcję próbek, używając jednej objętości mieszaniny fenol-chloroform-alkohol izoamylowy.Na koniec ponownie wyekstrahuj próbki, używając jednej objętości chloroformu z alkoholem izoamylowym. Następnie do każdej próbki dodaj 30 µg glikogenu. Dodaj również chlorek sodu do stężenia końcowego 0,2 M oraz dwie objętości etanolu do próbek.Inkubować je przez 30 minut w temperaturze -80 °C. Po inkubacji odwirować próbki i odlać nadsącz. Przemyć osady 500 µL 75% etanolu, a następnie osuszyć osady i zawiesić je ponownie w 40 µL wody.Aby sprawdzić wielkość fragmentów DNA otrzymanych w wyniku procedury SONIKACJI, należy nanieść 5 µg oczyszczonej próbki wejściowej na żel agarozowy 1,8% i przeprowadzić elektroforezę. Procedura sonikacji powinna przynieść fragmenty o długości od 150 do 350 par zasad. Jeśli jednak fragmenty nie mieszczą się w tym zakresie, należy dostosować parametry sonikacji, zmieniając liczbę impulsów oraz amplitudę przed przystąpieniem do amplifikacji DNA genomowego.Sprawdzić wielkość, stężenie i stopień wzbogacenia próbek zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby rozpocząć amplifikację DNA genomowego, pobrać 34 µL próbki IP oraz 200 ng próbki wejściowej (input). Przeprowadzić dodanie ogona, naprawę oraz ligację adapterów do fragmentów DNA, korzystając z zestawu do przygotowania próbek DNA genomowego firmy Illumina, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.Oczyść DNA za pomocą zestawu do mini oczyszczania produktów PCR, a następnie eluuj je w buforze EB uprzednio podgrzanym do 50 °C. Użyj odpowiednio 23 µL i 46 µL dla próbek DNA IP oraz DNA wejściowego. Przygotuj reakcję PCR, używając 23 µL DNA z adapterami oraz 25 µL polimerazy DNA z zestawu.1 µL 20 µM startera PCR 1 oraz 1 µL 20 µM startera PCR 2. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Po amplifikacji PCR oczyścić DNA za pomocą zestawu Qiagen mini loop PCR purification kit.Podgrzej 15 µL buforu EB do 50 °C i rozcieńcz DNA, rozcieńczając 0,5 µL próbki w stosunku jeden do czterech, a następnie wykonaj pomiar za pomocą NanoDrop, aby oczyścić produkty amplifikacji. Przygotuj 50 mL 1,8% żelu AGROS, używając wody klasy HPLC; po stopieniu AGROS dodaj TAE i bromek. Następnie wlej żel do formy i załaduj próbki.Po dodaniu czterech mikrolitrów buforu do nakładania do próbek wejściowych (input) i IP, należy przeprowadzić elektroforezę w żelu przy napięciu 120 V przez 45 minut. Następnie należy przeanalizować żel. Wyniki powinny wykazać powstanie fragmentów o długości od 150 do 350 par zasad.Reprezentują one fragmenty genomowego DNA o długości od 50 do 250 par zasad. Następnie za pomocą skalpela wycina się z żelu obszar zawierający materiał w zakresie od 150 do 350 par zasad. Należy uważać, aby nie wyciąć prążka adaptera, który znajduje się na poziomie około 120 par zasad.Odzyskaj DNA, korzystając z zestawu do szybkiej ekstrakcji z żelu kayak zgodnie z instrukcją producenta. Odparuj próbkę do dokładnie 11 µL w SpeedVac bez użycia ciepła. Pobierz 1 µL próbki i zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop.Na koniec należy zidentyfikować wzbogacone produkty genów przy użyciu analizatora genomu Illumina oraz przeanalizować miejsca wiązania i geny docelowe zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Współrzędne genomiczne zidentyfikowanych wzbogaconych regionów wiązania białka RB dwa lub RBP dwa przedstawiono w formacie z podziałem na chromosomy. Stopień zajętości genów z bazy Ensemble w chromosomach można zwizualizować jako czarne paski VAR.Tutaj przedstawiono obsadzenie chromosomu 10; regiony wiązania RBP2 pokazano jako linie pionowe. Środkowy panel prezentuje wszystkie regiony wiązania izoform RBP2 na chromosomie 10, a dolny panel przedstawia regiony wiązania dużej izoformy RBP2. Informacje te dają przegląd nakładającego się i specyficznego obsadzenia izoform RBP2 na chromosomie 10.Przedstawiono mapę ciepła z kategorii funkcji molekularnej ontologii genów (GO), które wykazują istotne wzbogacenie po korekcie o współczynnik odkryć fałszywych (FDR) wśród genów związanych z rbp. Kolory przechodzące w czerwony wskazują wysoką istotność statystyczną. Kolor żółty oznacza niską istotność statystyczną, a szary brak istotności statystycznej.Analiza wzbogacenia wykazuje nakładające się oraz specyficzne dla izoform funkcje molekularne dwóch genów docelowych R BP. Właśnie pokazaliśmy, jak zidentyfikować miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych podczas tej procedury. Ważne jest, aby uzyskać fragmenty DNA o odpowiednim zakresie wielkości i wydajności.Można to osiągnąć, postępując zgodnie z naszymi wytycznymi podczas etapu SONIKACJI. To wszystko. Powodzenia w eksperymentach i dziękujemy za oglądanie.

genome-wide-analysis-using-chip-to-identify-isoform-specific-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza całej zawartości genomu z wykorzystaniem ChIP w celu zidentyfikowania specyficznych dla izoformy genów docelowych

Nasz algorytm Bayesian Change Point (BCP) opiera się na najnowocześniejszych osiągnięciach w modelowaniu punktów zmiany przy użyciu ukrytych modeli Markowa i stosuje je w analizie danych z sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIPseq). BCP sprawdza się dobrze zarówno w przypadku danych o charakterze szerokim, jak i punktowym, lecz szczególnie wyróżnia się w dokładnej identyfikacji trwałych i powtarzalnych wysp rozproszonego wzbogacenia histonów.

Nowy bajesowski algorytm detekcji punktów zmiany w analizie genomowej zróżnicowanych typów danych ChIP-seq

W tym filmie demonstrujemy technikę immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji miejsc wiązania białek w określonych regionach genomowego DNA komórek prekursorowych oligodendrocytów poprzez selektywną immunoprecypitację fragmentów chromatyny związanych z białkiem. Metoda ta pomaga badać interakcje kilku białek regulatorowych, w tym czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w regulację genów.

Immunoprecypitacja chromatyny w celu identyfikacji docelowych miejsc wiązania białek w genomowym DNA

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Opisano protokół, który wykorzystuje testy Infinium firmy Illumina do przeprowadzania genotypowania na dużą skalę. Testy te mogą niezawodnie genotypować miliony SNP w setkach pojedynczych próbek DNA w ciągu trzech dni. Po wygenerowaniu genotypy te można wykorzystać do sprawdzenia powiązań z wieloma różnymi chorobami lub fenotypami.

Test Infinium do zastosowań genotypowania SNP na dużą skalę

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Protokół ten opisuje procedury przeprowadzania imunoprecipitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP) w celu identyfikacji białek i RNA związanych z określonym regionem genomu.

Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

Czynniki epigenetyczne mogą wchodzić w interakcje z programami genetycznymi, aby modulować ekspresję genów i regulować funkcję komórek B. Łącząc stymulację komórek B in vitro, qRT-PCR oraz wysokoprzepustowe sekwencje mikroRNA i sekwencje mRNA, możemy analizować epigenetyczną modulację miRNA i ekspresję genów w komórkach B.

Analiza całego genomu modulacji mikroRNA i mRNA za pośrednictwem inhibitora HDAC w komórkach B indukowanych do rekombinacji DNA ze zmianą klasy i różnicowania komórek plazmatycznych

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Przedstawiamy protokół do identyfikacji funkcjonalnych implikacji wariantów niekodujących zidentyfikowanych przez badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) przy użyciu trójwymiarowych interakcji chromatyny.

Mapowanie wariantów choroby Alzheimera do ich docelowych genów przy użyciu obliczeniowej analizy konfiguracji chromatyny

Ten artykuł opisuje półautomatyczny, mikroskalowany protokół ChIP-Seq regionów DNA związanych z specyficzną modyfikacją histonu (H3K27ac) przy użyciu platformy ChIP do obsługi cieczy, a następnie przygotowanie biblioteki za pomocą tagmentacji. Procedura obejmuje ocenę kontrolną pod względem jakościowym i ilościowym i może być dostosowana do innych modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych.

Półautomatyczna procedura ChIP-Seq do badań epigenetycznych na dużą skalę

Poznaj metodę ChIP-Seq do identyfikacji celów genomowych demetylazy histonowej KDM5A/RBP2. Technika ta pozwala analizować interakcje białko-DNA i epigenetyczną regulację genów w komórkach ludzkich.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Przeglądaj więcej filmów