Northern Blot do wykrywania i ilościowego oznaczania specyficznego mikroRNA w całkowitym ekstrakcie RNA tkanki roślinnej

MikroRNA, miRNA, to małe, jednoniciowe, niekodujące RNA. miRNA włączają się do kompleksu wielobiałkowego i dalej wiążą się z komplementarnymi docelowymi sekwencjami mRNA, aby negatywnie regulować ekspresję genów.

Aby wykryć specyficzne miRNA z całkowitego RNA z tkanek roślinnych, dodaj barwnik ładujący żel zawierający barwniki śledzące i formamid - środek denaturujący RNA. Podgrzej próbkę, aby zdenaturować RNA i zapobiec tworzeniu się struktury drugorzędowej przed elektroforezą.

Załaduj próbkę i standardowe markery RNA do studzienek wstępnie zmontowanego denaturującego żelu poliakrylamidowego. Uruchom elektroforezę, ułatwiając separację fragmentów RNA na podstawie wielkości.

Przenieś żel na wstępnie zwilżone bibuły filtracyjne na kasecie do elektrobibuły. Ułóż nasączoną buforem nylonową membranę bibułową na żelu. Następnie ułóż wstępnie zwilżone bibuły filtracyjne. Wykonaj elektrobloty.

Prąd elektryczny powoduje, że ujemnie naładowany RNA, w tym miRNA, przemieszcza się z żelu na dodatnio naładowaną powierzchnię membrany nylonowej. Wystaw membranę na działanie światła ultrafioletowego; to sieciuje RNA z błoną, zapobiegając w ten sposób utracie RNA.

Inkubować błonę w buforze hybrydyzacyjnym zawierającym środki blokujące, które zajmują niespecyficzne miejsca wiązania w celu zmniejszenia szumu tła.

Dodaj znakowaną radioaktywnie sondę oligonukleotydową RNA komplementarną do docelowego miRNA, aby związać się z nią specyficznie. Umyj membranę buforem, usuwając niezwiązane sondy.

Użyj systemu obrazowania luminoforowego, aby wykryć i określić ilościowo intensywność sygnału hybrydyzacji radioaktywnej. Sygnał o wysokiej rozdzielczości wskazuje na specyficzną ekspresję miRNA w tkance roślinnej.