Wykrywanie aktywności sialidazy Neu1 w regulacji aktywacji receptorów Toll-podobnych

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ocena indukcji komórkowej aktywności nowej sase w odpowiedzi na wiązanie ligandu z jego specyficznym receptorem. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę komórek na okrągłych szkiełkach przedmiotowych o średnicy 12 mm w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek przez 24 godziny. W drugim kroku żywe komórki przylegające do szkiełka przedmiotowego są doprowadzane do bezpośredniego kontaktu z wcześniej przygotowaną mieszaniną substratu sase i ligandu receptorowego, z dodatkiem lub bez dodatku specyficznych inhibitorów, na kolejnym szkiełku mikroskopowym.

Przeszkło podstawne należy niezwłocznie umieścić pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu wizualizacji i cyfrowej rejestracji obrazów fluorescencyjnych. W czasie uzyskuje się wyniki, które wykazują zmiany w aktywności nowej sase na powierzchni komórek w żywych komórkach traktowanych ligandem, na podstawie intensywności niebieskiej fluorescencji wokół komórek w mikroskopii epifluorescencyjnej.

Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza spektrofotometryczna, jest mniejsze zużycie odczynników. Możliwe jest również obserwowanie i utrwalanie obrazów aktywności sase w żywych komórkach. Metodę tę można wykorzystać do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak badanie potencjalnie nowych interakcji ligand-receptor, a także analiza wpływu specyficznych inhibitorów enzymów lub białek na aktywację receptorów.

Procedurę zaprezentują dr Ray Amit i dr PT Gath, byli doktoranci z mojego laboratorium, którzy wykorzystują ten test w swoich badaniach naukowych. Przed rozmrożeniem zamrożonych makrofagów należy przygotować pożywkę hodowlaną, używając sterylnie filtrowanego DMEM (modified eagle's medium) uzupełnionego o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 5 µg/mL antybiotyku penicyliny i streptomycyny. Następnie do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm² należy dodać 4 mL pożywki na każdą fiolkę zamrożonych komórek, wyjąć fiolkę z zamrażarki o temperaturze -80 °C i szybko rozmrozić ją, ogrzewając w dłoniach w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przeznaczonej do materiałów biologicznie niebezpiecznych.

Zajmie to około dwóch do trzech minut. Natychmiast po rozmrożeniu komórek należy za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 mL szybko przenieść je do kolby hodowlanej zawierającej pożywkę kondycjonowaną. Kolbę z komórkami należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, korzystając z mikroskopu odwróconego.

Codziennie sprawdzać wzrost i adhezję komórek, aż osiągną one 75% do 90% konfluencji na kilka dni przed wysianiem komórek do analizy SASE. Przygotować 12 milimetrowe okrągłe szkiełka przedmiotowe, na których zostaną wysiane komórki. Czynność tę należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Umieść preparaty na dużym szklanym spodku Petriego i wysterylizuj je, zanurzając w 100% etanolu na jedną godzinę. Usuń alkohol i pozostaw mokre szkiełka wystawione na sterylny, filtrowany przepływ powietrza w komorze pod działaniem promieniowania UV przez 24 godziny lub do momentu wyschnięcia przed wysiewaniem. Następnie wysterylizuj pełną, zakrzywioną, czterocalową ząbkowaną pęsetę ze stali nierdzewnej poprzez opalenie płomieniem.

Następnie za pomocą pęsety ostrożnie umieść pojedyncze sterylne okrągłe szkiełko przedmiotowe w każdej studni 24-dołkowej płytki polistyrenowej o płaskim dnie, przeznaczonej do hodowli tkanek. Używając sterylnej pipety o pojemności 5 ml, usuń DMEM z medium warunkowanym z kolby z adherentnymi makrofagami. Przemyj komórki raz 1x sterylnym roztworem buforu TRIS-saline pH 7.4, aby usunąć wszelkie pozostałości medium zawierającego surowicę.

Następnie dodaj 1 mL fosforanowego buforu solnego (PBS) z dodatkiem wapnia, pozbawionego fosforanów, o pH 7.4. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na około 10 minut lub do momentu, aż komórki zaczną odrywać się od ścianek kolby. Po ododerwaniu się komórek dodaj do zawiesiny 3 mL kondycjonowanej pożywki DMEM.

Następnie przenieś 0,5 ml zawiesiny zawierającej około 0,5 miliona komórek na każde 12 mm okrągłe szkiełko przedmiotowe w płytce 24-dołkowej. Inkubuj płytkę hodowlaną z komórkami makrofagów w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 24 godziny, aby umożliwić przyleganie komórek do okrągłych szkiełek przedmiotowych. Analiza aktywności sase zostanie przeprowadzona w trzech różnych warunkach na trzech oddzielnych szkiełkach mikroskopowych. Pierwsze szkiełko służy jako próba negatywna.

Komórki kontrolne są poddawane działaniu medium montażowego, substratu neuraminidazy dla ANA oraz soli buforowanej trisem, ale nie ligandu receptora Toll-podobnego LPS. Na drugiej szkiełku komórki są poddawane działaniu medium montażowego dla ANA, ligandu receptora Toll-podobnego LPS oraz soli buforowanej trisem.

Na trzecim szkiełku komórki są eksponowane na medium montażowe dla ANA, LPS Tris, sól fizjologiczną oraz inhibitor neuraminidazy Tamiflu. Zaprezentujemy procedurę tylko dla drugiego testu, ponieważ trzy testy różnią się jedynie mieszaniną związków na szkiełku mikroskopowym. Połóż szkiełko mikroskopowe na blacie laboratoryjnym i dodaj następujące związki w podanej kolejności.

Jeden mikrolitr medium montażowego, następnie jeden mikrolitr formy, dwa mikrolitry LPS i na koniec trzy mikrolitry buforu soli trójsiarczynowej (TBS) o pH 7.4. Następnie usuń medium z jednej studni 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej komórki. Kolejny krok jest najtrudniejszym elementem tej procedury, ponieważ należy usunąć okrągłą szklaną lamelkę ze studni płytki do hodowli tkanek za pomocą cztero calowej pęsety, uważając, aby jej nie stłuc.

Delikatnie przesuń okrągłe szkiełko przedmiotowe do narożnika dołka, a następnie ostrożnie je wyjmij i umieść w mieszaninie roztworów stroną z komórkami skierowaną w dół. Natychmiast przenieś szkiełko przedmiotowe pod mikroskop epifluorescencyjny ustawiony na filtr UV i wyposażony w kamerę cyfrową do rejestracji obrazów fluorescencyjnych. Ustaw ostrość mikroskopu w kontraście fazowym, aż komórki staną się widoczne, a następnie przełącz urządzenie w tryb fluorescencji.

Należy wykonać obrazy komórek w trybie fluorescencyjnym w pierwszej, drugiej i trzeciej minucie. Dodatkowo należy wykonać pojedynczy obraz komórek w kontraście fazowym. Tutaj przedstawiono wyniki eksperymentu z testu sase.

Najpierw, jako kontrolę negatywną, żywe komórki przytwierdzone do szkiełka przedmiotowego umieszczono w bezpośrednim kontakcie z kropelką mieszaniny medium montażowego i substratu w celu wykrycia aktywności fosfatazy zasadowej. Substrat uległby hydrolizie, uwalniając wolny etylluminol, który wykazuje emisję fluorescencyjną przy 450 nanometrach po wzbudzeniu przy 365 nanometrach, mierzona dwie minuty po dodaniu substratu.

Ten obraz fluorescencyjny nie wykazuje aktywności sase wokół komórek. Kolejny obraz przedstawia wyniki pozytywnego testu assay SASE, w którym żywe komórki przytwierdzone do szkiełka przedmiotowego zostały poddane bezpośredniemu kontaktowi z naniesioną mieszaniną medium montażowego, substratu TLR4 oraz liganda TLR4 LPS. Substrat został zhydrolizowany przez enzym sase, co doprowadziło do powstania wolnego ethyl lum beone, a obraz fluorescencyjny wykonany dwie minuty po dodaniu substratu i LPS wskazuje na wysoki poziom aktywności sase wokół komórek.

Jednakże, gdy żywe komórki zostały umieszczone w bezpośrednim kontakcie z mieszaniną nanopodłoża z ligandem TLR4 LPS oraz inhibitorem neuraminidazy Tamiflu, aktywność sase została znacznie zredukowana lub przestała być wykrywalna, w zależności od stężenia inhibitora. Ostatecznie, wykres ten przedstawia stężenie hamujące 50% dla Tamiflu oraz oseltamiwiru w formie karboksylanu, wyznaczone poprzez wykreślenie spadku aktywności sase względem logarytmu stężenia czynnika; zmierzono średnią fluorescencję wokół komórek dla każdej grupy. Wykorzystano do tego oprogramowanie Image J. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o hodowaniu komórek na okrągłych szkiełkach podstawkowych w 24-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej na 24 godziny przed rozpoczęciem testu Sade.

Ponadto wszystkie odczynniki wykorzystywane w tym teście muszą zostać przygotowane przed rozpoczęciem analizy.