Name: Wykrywanie aktywności sialidazy Neu1 w regulacji aktywacji receptora TOLL-podobnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę wykrywania aktywności sialidazy Neu1 w makrofagach w odpowiedzi na wiązanie ligandu z receptorem TLR. Technika fluorescencyjna umożliwia monitorowanie zmian aktywności enzymatycznej w czasie rzeczywistym na powierzchni żywych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Częściowe wsparcie grantowe dla MRS pochodzi z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), Harry Botterell Foundation for Neuroscience Research, ARC oraz Garfield Kelly Cardiovascular Research and Development Fund. S.R.A. jest laureatem Queen's University Research Award oraz Robert J. Wilson Fellowship. P.J. jest laureatem Queen's Graduate Award oraz Robert J. Wilson Fellowship. A.G. i S.A. są laureatami Queen's Graduate Award. S.F. był laureatem Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology (OGSST). A.G. jest laureatem Queen's Franklin Bracken Graduate Scholarship. S.A. jest laureatem Queen's R.S. McLaughlin Graduate Scholarship.

1. Reanimacja zamrożonych makrofagów
<ol>
<li>Przed rozmrożeniem zamrożonych komórek z zamrażarki -80°C należy przygotować pożywkę hodowlaną, wykorzystując sterylnie filtrowaną pożywkę DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 5 μg/mL plasmocyny. Plasmocyna jest roztworem antybiotyku stosowanym w naszych badaniach w celu eliminacji i zapobiegania kontaminacji kultur komórkowych mycoplasma.</li>
<li>Dla jednej fiolki zamrożonych komórek dodaje się 4 mL pożywki hodowlanej do kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm2 w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Po wyjęciu fiolki z zamrożonymi komórkami z zamrażarki -80°C, są one szybko rozmrażane poprzez ogrzewanie w dłoniach w sterylnej komorze, co zajmuje około 2-3 min.</li>
<li>Niezwłocznie po rozmrożeniu komórki są szybko przenoszone do kolby zawierającej pożywkę za pomocą sterylnej pipety 1 mL.</li>
<li>Kolba z komórkami zostaje umieszczona w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.</li>
<li>Wzrost i adhezja komórek są sprawdzane codziennie przy użyciu mikroskopu odwróconego, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie od 75% do 90%.</li>
<li>Podczas inkubacji hodowli komórkowej, okrągłe szkiełka przedmiotowe o średnicy 12 mm są sterylizowane poprzez zanurzenie ich w 70% etanolu w dużej szklanej szalce Petriego na 1 h w komorze z laminarnym przepływem powietrza; następnie alkohol jest usuwany i przechowywany do ponownego użycia, a wilgotne szkiełka są pozostawione pod działaniem sterylnie filtrowanego strumienia powietrza w komorze pod lampą UV przez 24 h lub do całkowitego wyschnięcia.</li>
</ol>
2. Wysiewanie komórek do testu sialidazy
<ol>
<li>	Przed wysianiem komórek, pojedyncze sterylną okrągłe szkiełko przedmiotowe umieszcza się ostrożnie w jednym dołku 24-dołkowej płytki BD Falcon z płaskim dnem i pokrywką, wykonanej z polistyrenu do hodowli tkankowych, używając do tego sterylizowanej przez opalanie, pełnej, zakrzywionej, 4-calowej ząbkowanej pęsety ze stali nierdzewnej. W przypadku jednej kolby komórek przy 75% konfluencji, zazwyczaj wykorzystuje się 12 dołków płytki hodowlanej.</li>
<li>	W przypadku adherentnych komórek makrofagów, warunkowane podłoże DMEM usuwa się z kolby za pomocą sterylnej pipety 5 mL w sterylnej komorze laminarnej. Adherentne komórki przemywa się raz 1x sterylnym roztworem soli w buforze Tris o pH 7.4, aby usunąć wszelkie pozostałości podłoża zawierającego surowicę, a następnie dodaje się 1 mL fosforanowego roztworu buforowanego (PBS) bez wapnia i magnezu (CMF) o pH 7.4, w ilości wystarczającej do przykrycia komórek. Komórki umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C na około 10 min lub do momentu, aż komórki zaczną odrywać się od ścianek kolby. Kolbę można delikatnie kołysać lub potrząsać, aby poluzować pozostałe adherentne komórki.</li>
<li>	Do 1 mL zawiesiny komórek w kolbie dodaje się 3 mL warunkowanego podłoża DMEM. Pobiera się 0.5 mL zawiesiny komórek i sterylnie przenosi do płytki do hodowli tkankowej zawierającej 12-milimetrowe okrągłe szkiełka przedmiotowe. Na okrągłe szkiełka przenosi się około 0.5 x 106 komórek.</li>
<li>	Płytkę do hodowli tkankowej z komórkami inkubuje się w temperaturze 37°C w 5% CO2 przez 24 h, aby umożliwić adhezję komórek do okrągłych szkiełek przedmiotowych.</li>
</ol>
3. Analiza aktywności sialidazy
1. Przygotowanie kontroli
<ol>
<li>	Umieścić szkiełko przedmiotowe (matowe: 1 koniec, 1 szkiełko, 25 x 75 x 1 mm) w komorze ochronnej lub na blacie laboratoryjnym i dodać, mieszając w następującej kolejności, poniższe związki: 1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA oraz na koniec + 3 μL soli buforowanej triss pH 7.4 (TBS).</li>
<li>	Po usunięciu medium z jednej studni zawierającej komórki, delikatnie przesunąć okrągłe szkiełko za pomocą 4-calowej pęsety do narożnika studni. Ostrożnie wyjąć szkiełko pęsetą i położyć je komórkami skierowanymi do dołu na roztwór mieszaniny znajdujący się na szkiełku przedmiotowym.</li>
<li>	Natychmiast przenieść szkiełko przedmiotowe do mikroskopu epifluorescencyjnego, który został ustawiony na filtr UV i jest wyposażony w kamerę cyfrową do rejestracji obrazów fluorescencyjnych.</li>
<li>	Ustawić ostrość mikroskopu w kontraście fazowym, aż do momentu widoczności komórek, a następnie przełączyć na tryb fluorescencji. Wykonać zdjęcia komórek w fluorescencji w 1 min, 2 min i 3 min. Wykonać pojedyncze zdjęcie komórek w kontraście fazowym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie testu pozytywnego
<ol>
<li>	Nanieś następujące związki w podanej kolejności na inny szkiełko przedmiotowe: 1 μL DAKO + 1 μL 4-MUNANA + 2 μL LPS + 1 μL TBS.</li>
<li>	Powtórz kroki od 3.1.2 do 3.1.4 opisane powyżej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie testu pozytywnego wraz z inhibitorem neuraminidazy Tamiflu
<ol>
<li>	Nanieś następujące związki w podanej kolejności na kolejny szkiełko przedmiotowe: 1μL DAKO + 1μL 4-MUNANA + 2 μL LPS + 1 μL Tamiflu.</li>
<li>	Stężenia Tamiflu zostały wcześniej przygotowane w 1x buforze Tris-NaCl pH 7.4; końcowe stężenie związków w kontakcie z żywymi komórkami na okrągłym szkiełku przedmiotowym będzie miało czynnik rozcieńczenia równy 5.</li>
<li>	Powtórz kroki od 3.1.2 do 3.1.4 opisane powyżej.</li>
</ol>
4. Wyznaczenie stężenia inhibitora niezbędnego do zahamowania 50% aktywności sialidazy (IC50)
<ol>
<li>	Aby określić ilość fluorescencji wokół komórek, obrazy analizuje się za pomocą programu ImageJ 1.38x z wtyczką analyze do pomiaru RBG. Wykonuje się 50 pomiarów w losowych punktach fluorescencji otaczającej komórki, a następnie oblicza średnią całkowitej fluorescencji.</li>
<li>	Wartość IC50 wyznacza się na podstawie wykresu, w którym na osi x naniesiono stężenie inhibitora przekształcone na jednostki logarytmiczne (np. log ng/mL), a na osi y średnią fluorescencję, stosując regresję nieliniową.</li>
</ol>
5. Klucze do sukcesu
<ol>
<li>Upewnij się, że hodowane komórki są wolne od zanieczyszczeń mycoplasma. W celu kontroli tego parametru rutynowo stosujemy Plasmocin w pożywce hodowlanej.</li>
<li>Sztuczny substrat neuraminidazy, 4-MUNANA, należy stosować świeżo przygotowany. Przygotowany substrat może być wykorzystany do testu sialidazy w ciągu tygodnia.</li>
<li>Jeśli linia komórkowa wykazuje niską ekspresję receptorów na powierzchni komórek, do stymulacji można zastosować wyższą dawkę ligandu.</li>
<li>Zaobserwowaliśmy również, że komórki poddane więcej niż 6 pasażom mogą utracić swój fenotyp receptorowy. Należy hodować świeżo rozmrożone komórki.</li>
</ol> 
6. Reprezentatywne wyniki
Animowany protokół testu sialidazy wraz z reprezentatywnymi wynikami znajduje się w załączonym <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2142/szewczuk_JoVE_sialidase_assay.pptx">pliku Powerpoint</a>.

<ol><li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+desialylation+of+sialyl+alpha-2%2C3-linked+beta-galactosyl+residues+of+TOLL-like+receptor+4+is+essential+for+receptor+activation+and+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling.</a> Cell Signal. 22, 314-324 (2010).</li>
<li>Amith, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+pathogen+molecule-induced+Toll-like+receptor+activation+and+cell+function+on+Neu1+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase.</a> Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).</li>
<li>Woronowicz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+neurotrophic+factor+activation+of+Trk+tyrosine+kinase+receptors+on+cellular+sialidase%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase.</a> Glycobiology. 17, 10-24 (2007).</li>
<li>Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neu1+Sialidase+and+Matrix+Metalloproteinase-9+Cross-talk+is+Essential+for+Neurotrophin+Activation+of+Trk+Receptors+and+Cellular+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling.</a> Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).</li>
<li>Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymoquinone+from+nutraceutical+black+cumin+oil+activates+Neu4+sialidase+in+live+macrophage%2C+dendritic%2C+and+normal+and+type+I+sialidosis+human+fibroblast+cells+via+GPCR+G%CE%B1i+proteins+and+matrix+metalloproteinase-9%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9.</a> Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).</li>
<li>Seyrantepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Phagocytosis+in+Macrophages+by+Neuraminidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).</li>
</ol>

S.R.A. i P.J. przyczynili się w równym stopniu jako pierwsi autorzy.

Wykorzystując nowo opracowany test do wykrywania aktywności sialidazy w żywych komórkach makrofagów 2, zastosowaliśmy tę technologię do wykrycia aktywności sialidazy indukowanej ligandem w żywych komórkach makrofagów BMC-2 w sposób zależny od dawki, a także w żywych komórkach dendrytycznych DC-2.4, HEK-TLR4/MD2, HEK293, komórkach gruczolakoraka piersi SP1 oraz ludzkich komórkach fibroblastów typu dzikiego (WT) i z sjalidozą typu I (1140F01 i WG0544). Inhibitory neuraminidazy, takie jak Tamiflu (fosforan oselta...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-MUNANA</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowe serum cielęce</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation, Fluorescencyjne medium do montowania</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Tamiflu (fosforan oseltamiwiru)</td><td>Hoffmann-La Roche AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie aktywności sialidazy neu1 w regulacji aktywacji receptorów toll-podobnych

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Ssacze receptory Toll-podobne (TLRs) to rodzina receptorów rozpoznających wzorce molekularne związane z patogenami. TLRs są nie tylko kluczowymi sensorami infekcji drobnoustrojowych (np. wirusowych, bakteryjnych i pasożytniczych), ale odgrywają również istotną rolę w patofizjologii chorób zakaźnych, zapalnych, a być może także autoimmunologicznych. W związku z tym intensywność i czas trwania odpowiedzi TLR przeciwko chorobom zakaźnym muszą być ściśle kontrolowane. Wynika z tego, że zrozumienie integralności strukturalnej receptorów sensorowych, ich oddziaływań z ligandami oraz komponentów sygnałowych jest niezbędne dla późniejszej ochrony immunologicznej. Mogłoby to również stworzyć istotne możliwości modyfikacji chorób poprzez manipulację sensorami. Chociaż szlaki sygnałowe sensorów TLR są dobrze scharakteryzowane, parametry kontrolujące oddziaływania między sensorami a ich ligandami wciąż pozostają słabo zdefiniowane. Niedawno zidentyfikowaliśmy nowy mechanizm aktywacji TLR przez jego naturalny ligand, który nie był wcześniej obserwowany 1,2. Sugeruje on, że indukowana ligandem aktywacja TLR jest ściśle kontrolowana przez aktywację sialidazy Neu1. Zgłosiliśmy również, że Neu1 ściśle reguluje receptory neurotrofinowe, takie jak TrkA i TrkB 3, co wiąże się z interakcją (cross-talk) między Neu1 a metaloproteinazą macierzy-9 (MMP-9) w kompleksie z receptorami 4. Test sialidazy został początkowo wykorzystany do znalezienia nowego liganda, tymochinonu, w aktywacji sialidazy Neu4 na powierzchni komórek makrofagów, komórek dendrytycznych i fibroblastów poprzez białka GPCR Gαi oraz MMP-9 5. W przypadku receptorów TLR nasze dane wskazują, że sialidaza Neu1 znajduje się już w kompleksie z receptorami TLR-2, -3 i -4 i jest indukowana po związaniu liganda z którymkolwiek z tych receptorów. Aktywowana sialidaza Neu1 hydrolizuje reszty sjalilo α-2,3-związane β-galaktozylowe, oddalone od miejsca wiązania liganda, aby usunąć przeszkodę steryczną dla dimeryzacji TLR-4, rekrutacji kompleksu MyD88/TLR4, aktywacji NFkB oraz prozapalnych odpowiedzi komórkowych. W raporcie z badań kolaboracyjnych wykazano, że sialidaza Neu1 reguluje fagocytozę w komórkach makrofagów 6. Podsumowując, test sialidazy dostarczył nam cennych informacji na temat molekularnych mechanizmów indukowanej ligandem aktywacji receptorów. Chociaż dokładna relacja między sialidazą Neu1 a aktywacją TLR i receptorów Trk nie została jeszcze w pełni wyjaśniona, stanowiłaby ona nowe lub pionierskie podejście do szlaków regulacji komórkowej.

Test sialidazy to proste podejście techniczne, które pozwoli wyjaśnić nowe mechanizmy molekularne receptorów TLR w odpowiedzi na infekcje mikrobiologiczne oraz ich udział w chorobach zapalnych na poziomie receptorów na powierzchni komórek żywych makrofagów.

Wykrywanie aktywności sialidazy Neu1 w regulacji aktywacji receptorów Toll-podobnych

Ssacze receptory Toll-podobne (TLRs) stanowią rodzinę receptorów rozpoznających molekularne wzorce związane z patogenami. TLRs są nie tylko kluczowymi sensorami...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ocena indukcji komórkowej aktywności nowej sase w odpowiedzi na wiązanie ligandu z jego specyficznym receptorem. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę komórek na okrągłych szkiełkach przedmiotowych o średnicy 12 mm w 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek przez 24 godziny. W drugim kroku żywe komórki przylegające do szkiełka przedmiotowego są doprowadzane do bezpośredniego kontaktu z wcześniej przygotowaną mieszaniną substratu sase i ligandu receptorowego, z dodatkiem lub bez dodatku specyficznych inhibitorów, na kolejnym szkiełku mikroskopowym.Przeszkło podstawne należy niezwłocznie umieścić pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu wizualizacji i cyfrowej rejestracji obrazów fluorescencyjnych. W czasie uzyskuje się wyniki, które wykazują zmiany w aktywności nowej sase na powierzchni komórek w żywych komórkach traktowanych ligandem, na podstawie intensywności niebieskiej fluorescencji wokół komórek w mikroskopii epifluorescencyjnej.Główną zaletą stosowania tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza spektrofotometryczna, jest mniejsze zużycie odczynników. Możliwe jest również obserwowanie i utrwalanie obrazów ak

detection-neu1-sialidase-activity-regulating-toll-like-receptor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie aktywności Neu1 sjalidazy w regulacji aktywacji receptora podobnego do Tolla

Ten film demonstruje test do zbadania zależnej od receptora toll-like (TLR) aktywności czynników transkrypcyjnych: czynnika jądrowego-kappa-B (NF-κB) i białka aktywatora-1 (AP-1) w makrofagach. TLR uruchamiają prozapalną kaskadę sygnalizacyjną po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP), aktywując NF-κB i AP-1. Zmodyfikowane makrofagi reporterowe wytwarzają embrionalny enzym fosfatazę alkaliczną (SEAP) po aktywacji NF-κB i AP-1, który jest wykrywany w reakcji...

Test sygnalizacji czynnika transkrypcyjnego NF-&kcy;B/AP-1 zależnego od TLR w makrofagach

Ten film demonstruje test oparty na komórkach reporterowych do badania potencjalnych bioaktywnych nanocząstek, które hamują sygnalizację receptora Toll-podobnego (TLR). Test polega na wprowadzeniu lipopolisacharydów (LPS) zmieszanych z hybrydami nanocząstek peptydu i złota do makrofagów reporterowych eksprymujących białka reporterowe - wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną (SEAP) i lucyferazę. Redukcja sygnału TLR indukowanego przez LPS, w którym pośredniczą hybrydy, jest określana przez...

Test do badań przesiewowych bioaktywnych nanocząstek pod kątem hamowania sygnalizacji receptora toll-podobnego

Komórki dendrytyczne (DC) wydzielają IL-1β w odpowiedzi na rozpoznanie TLR8 syntetycznej puryny, R848, a następnie aktywację inflamasomu NLRP3 nigerycyną, dlatego IL-1β może być użyty do pomiaru aktywności inflamasomu NLRP3. Barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych, immunoblotting i ELISA służą do dokładnego pomiaru pobudzania i aktywacji inflamasomu NLRP3 poprzez ekspresję IL-1β.

Aktywacja i pomiar aktywności inflamasomu NLRP3 za pomocą IL-1β w ludzkich komórkach dendrytycznych pochodzących z monocytów

Opisujemy opartą na HPLC metodę oznaczania kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy.

Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH.

Sygnalizacja receptora Toll-podobnego (TLR) odgrywa ważną rolę w patofizjologii wielu chorób zapalnych u ludzi, a regulacja odpowiedzi TLR przez bioaktywne nanocząstki jest korzystna w wielu stanach zapalnych. Komórki reporterowe oparte na komórkach THP-1 stanowią wszechstronną i solidną platformę przesiewową do identyfikacji nowych inhibitorów sygnalizacji TLR.

Badania przesiewowe bioaktywnych nanocząstek w fagocytarnych komórkach odpornościowych pod kątem inhibitorów sygnalizacji receptora toll-podobnego

MALT1 reguluje wrodzoną odporność, ale jak to się dzieje, pozostaje niejasne. Użyliśmy selektywnego inhibitora parakaspazy MALT1 MLT-827, aby rozwikłać wkład MALT1 w sygnalizację wrodzoną za receptorami lektynopodobnymi Toll lub typu C, wykazując, że MALT1 reguluje produkcję cytokin szpikowych i za receptorami lektynopodobnymi typu C, selektywnie.

Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Poznaj metodę wykrywania aktywności sialidazy Neu1 w makrofagach w odpowiedzi na wiązanie ligandu z receptorem TLR. Technika fluorescencyjna umożliwia monitorowanie zmian aktywności enzymatycznej w czasie rzeczywistym na powierzchni żywych komórek.

Wykrywanie aktywności sialidazy Neu1 w regulacji aktywacji receptorów Toll-podobnych

Przeglądaj więcej filmów