Name: Obrazowanie pionowe zarodków Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Poznaj metodę montażu zarodków Drosophila w pozycji pionowej do obrazowania przekrojów poprzecznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia precyzyjne pomiary wielkości zarodków i ilościowe określenie poziomów ekspresji białek oraz RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są szczególnie wdzięczni Deborah Harris i Danielle MacKay. Wsparcie dla niniejszej pracy zapewnił Departament Biologii oraz College of Arts and Sciences CWRU, a także grant HHMI numer 52005866 przeznaczony na wsparcie edukacji studiów licencjackich w zakresie nauk biologicznych.

1. Metodyka obrazowania
<ol>
	<li>Rozpuść galaretkę glicerynową w kąpieli wodnej o temperaturze 55° C przez 20-30 minut, aż stanie się jednorodnym płynem. Delikatnie zakręć butelką, ale nie wstrząsaj nią, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Podczas rozpuszczania galaretki nanieś cienką warstwę glicerolu na czyste szkiełko przedmiotowe za pomocą chusteczki Kimwipe (opcjonalnie).</li>
	<li>Nanieś 1 do 1,5 mL rozpuszczonej galaretki glicerynowej za pomocą przyciętej końcówki pipety P1000 na powierzchnię szkiełka, aby utworzyć cienką pierwszą warstwę. Pipetuj ostrożnie, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
	<li>Pozostaw galaretkę do stężenia przez 5 min na poziomej powierzchni, następnie umieść szkiełko w temperaturze -20°C na 5 min i przystąp do ustawiania zarodków. Alternatywnie, przykryj szkiełko folią Saran Wrap i przechowuj w temperaturze 4°C do 5 dni.</li>
	<li>Nanieś małą kroplę zabarwionych zarodków w 70% glicerolu/PBS lub innym glicerolowym medium montażowym zapobiegającym zanikaniu fluorescencji (np. Slowfade lub Vectashield) obok podłoża z galaretki.</li>
	<li>Rozpocznij wstępne ustawianie zarodków, przenosząc je pojedynczo z kropli na powierzchnię galaretki. Do przenoszenia użyj skośnej igły hipodermicznej, wykorzystując jej skośną stronę jako łyżeczkę.</li>
	<li>Rozmieść zarodki orientacyjnie w 2 do 3 kolumnach. Jeśli zarodek utknie w igle, zamieszaj go w kropli z pozostałymi zarodkami, aby go uwolnić. Na tym etapie nie poświęcaj czasu na precyzyjne wyrównywanie. Zachowaj odstępy między kolumnami.</li>
	<li>Wyrównaj zarodki, przesuwając je poziomo po medium galaretkowym za pomocą igły hipodermicznej. Podczas przesuwania skieruj głowy i ogony w tym samym kierunku. Ustaw je równolegle względem siebie wzdłuż kolumny. Usuń nadmiar PBS z glicerolem, który pozostał w formie śladu, za pomocą skręconej chusteczki Kimwipe. Uwaga: Nadmiar glicerolu spowoduje, że zarodki będą luźno osadzone w żelu, co doprowadzi do rozdzielenia dwóch warstw galaretki, utrudniając wycinanie i montaż. Z kolei usunięcie zbyt dużej ilości glicerolu doprowadzi do wyschnięcia i spłaszczenia zarodków.</li>
	<li>Używając przyciętej żółtej końcówki, rozprowadź cienką warstwę galaretki nad zarodkami (50-150 μL, w zależności od liczby ustawionych zarodków).</li>
	<li>Umieść szkiełko w zamrażarce -20°C na 10-20 min lub przechowuj w temperaturze 4°C przez noc. Upewnij się, że galaretka jest całkowicie sztywna przed wycinaniem. W przeciwnym razie blok zarodków będzie bardzo trudny do wycięcia. Najlepsze wyniki wycinania uzyskuje się następnego dnia.</li>
	<li>Pod stereomikroskopem, za pomocą żyletki, przetnij galaretkę całkowicie po obu stronach ustawionych zarodków. Trzymaj żyletkę pod kątem 90°, aby wykonać proste cięcia. Cięcia powinny być wykonane bardzo blisko bieguna przedniego i tylnego zarodków, aby uniknąć nadmiaru galaretki, która mogłaby utrudniać obrazowanie.</li>
	<li>Dodaj 100-200 μL zimnego PBT (4°C, PBS+0,1% Tween 20) obok nacięć i ostrożnie zeskrob galaretkę między zarodkami za pomocą szpatułki. Uwaga: Detergent w PBT ułatwia usuwanie galaretki ze szkiełka bez uszkadzania zarodków.</li>
	<li>Za pomocą igły przenieś blok galaretki z zatopionymi zarodkami na czyste szkiełko w celu dalszego wycinania. Wytnij mniejsze bloki zawierające 5-7 zarodków. Użyj PBT, aby łatwiej przesuwać blok galaretki. Alternatywnie, umieść blok na suchej powierzchni szklanej, aby przylgnął do szkła, co zapewni większą stabilność przy precyzyjnym przycinaniu galaretki, jeśli jest to konieczne.</li>
	<li>Odwróć zarodki zatopione w galaretce do pozycji pionowej za pomocą żyletki i igły. W celu wizualizacji pod mikroskopem wykonaj jeden z dwóch poniższych kroków, w zależności od rodzaju statywu mikroskopowego.</li>
	<li>Mikroskop odwrócony: umieść gotowe bloki zarodków na długim szkiełku nakrywkowym, z zarodkami w pozycji pionowej. Upewnij się, że strona zarodka z najmniejszą ilością galaretki znajduje się w bliższym kontakcie z obiektywem.</li>
	<li>Mikroskop prosty: przygotuj dwa stosy z czterech szkiełek nakrywkowych nr 1 sklejonych superglue, które będą służyć jako „podpory”, i umieść blok zarodków w glicerolu pomiędzy „podporami”. Połącz stosy za pomocą długiego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Do analizy konfokalnej sprawdź odległość roboczą używanych obiektywów, aby dowiedzieć się, czy można obrazować cały zarodek, czy tylko częściowo. Na przykład zarodki D. melanogaster mają długość ok. 0,55 mm i mogą być w całości obrazowane przy użyciu obiektywu Zeiss 20x Plan-Apo lub 40x LD Neo-Fluor. Poniższa strona internetowa zawiera informacje o dostępnych obiektywach Zeiss i umożliwia wyszukiwanie obiektywów według odległości roboczych: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki
Ponieważ embriony pozostają w całości, metodę tę można wykorzystać do dokładnych pomiarów wielkości embrionów oraz odległości między wzorami ekspresji genów. Na rysunku 1 przedstawiamy embriony w stadium blastodermy zabarwione barwnikiem jądrowym DAPI (niebieski), przeciwciałem anty-Dorsal (czerwony), mRNA sog (żółty) oraz mRNA sna (zielony). Za pomocą tej metody można również wizualizować procesy morfologiczne, takie jak inwagynacja mezodermy (rysunek 2A, B) i migracja komórek mezodermalnych (rysunki 3 i 4). Różne pozycje Z wzdłuż osi DV można uzyskać poprzez zmianę płaszczyzny ogniskowania, co pokazano na rysunkach 2-4.
<img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna zarodka Drosophila; rozkład mRNA, białek i jąder komórkowych; analiza ekspresji genów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Pionowy przekrój optyczny nienaruszonego zarodka w stadium blastodermy. Podwójne barwienie na mRNA i białko. Na rysunku wskazano docelowe mRNA dla sond in situ (sog oraz sna) oraz białko barwione przeciwciałem pierwszorzędowym (anty-Dorsal). DAPI zastosowano do znakowania jąder komórkowych. Należy zauważyć, że ekspresja sog i sna znajduje się apikalnie w cytoplazmie, natomiast ekspresja Dorsal ma charakter jądrowy. Przy tym powiększeniu widoczne są również silne sygnały z nowo powstałych transkryptów sog zlokalizowanych w jądrach.
<img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna ekspresji genów; schemat; geny sog, sna, ind; barwienie DAPI; płaszczyzny ogniskowania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Obrazowanie w pozycji pionowej nienaruszonego zarodka w fazie gastrulacji. Na rysunku wskazano użyte sondy mRNA oraz odpowiadające im kolory. A) Należy zauważyć, że na tym etapie trzy geny barwiono tym samym fluoroforem (Analiza sieci społecznościowych (SNA), SOG i dpp, w kolorze zielonym), są wyrażane w przestrzennie oddzielonych domenach. Inwaginujące mezodermum wyraża SNA, warstwa neuroblastów wykazuje ekspresję ind a ektoderma wykazuje ekspresję dpp, podczas gdy SOG (ang. *Statement of Goals* – Deklaracja celów) ekspresja jest nadal obecna w obszarach brzusznych układu nerwowego. B) W głębszej płaszczyźnie konfokalnej tego samego zarodka zauważamy, że podstawa ulegającego ewaginacji mezodermy wykazuje silną ekspresję SNA, ale w jego regionie apikalnym poziomy te są niższe.
<img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Schemat procesu gastrulacji; obrazy z różnych płaszczyzn ogniskowania A i B; pokazujące neuroektodermę i warstwy mezodermy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Obrazowanie w pozycji pionowej nienaruszonego zarodka z rozciągniętym pasmem zarodkowym. RNA sog (żółty); mRNA snail, ind oraz dpp (zielone), białko Dorsal (czerwone). Jądra komórkowe zabarwiono DAPI (niebieski). A) Płaszczyzna ogniskowania w pobliżu głowy zarodka. B) Inna płaszczyzna ogniskowania w obszarze tułowia tego samego zarodka. Zwróć uwagę na skupisko komórek mezodermalnych przed migracją boczna (porównaj z Rysunkiem 4), położone blisko brzusznej linii środkowej po obu stronach zarodka z rozciągniętym pasmem zarodkowym. Delaminujące neuroblasty są zaznaczone na zielono (ind i sna).
<img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii konfokalnej, regiony tułowia i środkowo-tylne, fluorescencyjne znakowanie struktur komórkowych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Obrazowanie pionowe nienaruszonego zarodka podczas wydłużania pasma zarodkowego. RNA sog (żółty); mRNA snail, ind oraz dpp (zielony), białko Dorsal (czerwone). A) Zwrócono uwagę na delaminujące neuroblasty z nabłonka (strzałka), zabarwione na tym etapie zarówno dla ind, jak i sna (zielony). Zwrócono również uwagę na ograniczoną ekspresję sog do brzusznej linii środkowej (żółty). Ekspresja dpp na tym etapie jest widoczna po bokach zarodka (gwiazdka). B) Przekrój optyczny w tym samym zarodku co w A, w pobliżu końca długości zarodka, co odpowiada regionowi środkowo-tylnemu. Komórki brzusznej linii środkowej są zabarwione dla sog.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Wykonywanie obrazów przekrojów poprzecznych embrionów Drosophila może być trudne, ponieważ wymaga albo starannego ręcznego preparowania plastrów2, albo zastosowania mediów zatapiających do obróbki mikrotomem, co zazwyczaj jest niekorzystne dla barwień fluorescencyjnych. Alternatywnie, do stworzenia rekonstrukcji 3D obrazów przekroju poprzecznego można wykorzystać stosy Z (Z-stacks) wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Jednakże wykonanie wielu cienkich warstw konfokalnych w celu uzyskania dokładnej rekonstrukcji 3D jest czasochłonne, a problematyczny staje się fotobieling. Kolejną kwestią przy obrazowaniu embrionów zamocowanych wzdłużnie jest rozproszenie światła występujące przy docieraniu do głębszych sekcji embrionu, co utrudnia również dokonywanie precyzyjnych pomiarów sygnałów fluorescencyjnych w celu kwantyfikacji poziomów ekspresji białek lub mRNA1. Nawet przy użyciu dwufotonowego mikroskopu konfokalnego rozproszenie światła nadal stanowi problem ze względu na nieprzezroczystość materiału żółtka w środkowej części embrionu, co ogranicza wybór mediów montażowych zapewniających optymalną przejrzystość próbki.
Aby rozwiązać te problemy, opracowano niedawno nową technikę obrazowania tzw. „End-on”, polegającą na pionowym pozycjonowaniu embrionów, która umożliwia obrazowanie próbek żywych oraz utrwalonych 4. W niniejszej pracy opracowaliśmy nowy protokół dla embrionów zamontowanych pionowo, który pozwala na prostą preparatykę i wizualizację utrwalonych embrionów lub tkanek o dowolnym rozmiarze i kształcie, zabarwionych wieloma sondami in situ 3. Nasza metoda polega na zastosowaniu medium montażowego o konsystencji żelowej, w którym zamyka się wyrównane embriony. Wycięte bloki tego medium montażowego zawierające zatopione embriony można ustawić pionowo przed obrazowaniem w dowolnym typie mikroskopu konfokalnego.
Poprzez osadzenie embrionów w galaretce i ustawienie ich pionowo, jesteśmy w stanie wykonać poziome przekroje poprzeczne przy użyciu mikroskopii konfokalnej, w których komórki wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej embrionu są prezentowane jednocześnie. Stanowi to istotną poprawę w celach ilościowych, ponieważ wyeliminowano problemy z rozpraszaniem światła i fotowyblakaniem barwników fluorescencyjnych, które występują podczas konwencjonalnej rekonstrukcji Z-stack embrionów zamontowanych podłużnie. W związku z tym ilościowe określanie ekspresji genów lub poziomów białek wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej jest dokładne, ponieważ komórki znajdujące się w przeciwnych pozycjach grzbietowo-brzusznych są obrazowane w tym samym czasie i w tej samej konfokalnej pozycji Z. Dodatkowo opisana metoda pozwala nam uzyskać kompletny obraz 2-D w poprzek osi grzbietowo-brzusznej z embrionu 3-D bez konieczności stosowania złożonych komputerowych metod rozwijania (unrolling) w celu wizualizacji komórek w różnych pozycjach wzdłuż osi DV 6.
Do krytycznych etapów należy usunięcie nadmiaru glicerolu po ustawieniu zarodków, aby zapobiec rozwarstwieniu dwóch warstw galaretki. Jednakże, jeśli próbka zostanie zbyt mocno odwodniona, uzyskany obraz będzie zniekształcony i będzie charakteryzować się nieprawidłową morfologią. Ponadto, jeśli medium galaretkowe wokół zarodka zostanie odcięte pod kątem zamiast prostopadle, uzyskany obraz może wydawać się mniej okrągły i bardziej owalny, co wynika z nieprawidłowego ustawienia zarodków pod kątem innym niż 90 stopni. Wreszcie, jeśli galaretka nie zostanie odcięta wystarczająco blisko zarodka na końcach przednim/tylnym, nie będzie możliwe uzyskanie właściwego obrazu, ponieważ odległość robocza obiektywu byłaby wykorzystana głównie do ustawienia ostrości na galaretce, a nie na zarodku.
Kolejnym ważnym krokiem, który może być konieczny podczas obrazowania embrionów w późnej fazie gastrulacji, jest staranna selekcja interesujących nas stadiów pod mikroskopem przed ich ustawieniem. Zazwyczaj stadia embrionów określa się na podstawie cech morfologicznych, które są najłatwiejsze do rozpoznania w pozycji podłużnej.
Jedną z alternatywnych modyfikacji, które można wprowadzić w tej metodzie, jest dodanie odczynnika zapobiegającego blaknięciu (np. p-fenylenodiaminy lub PPD) do drugiej warstwy galaretki, aby pomóc chronić barwniki fluorescencyjne przed fotobleakowaniem.

<table><tbody><tr><td>Medium montażowe Glycerin Jelly</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Zawiera niskie stężenie fenolu jako konserwantu i powinno być stosowane w dygestorium lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Przepis na samodzielne przygotowanie medium opisano w Zander, 1997.</td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop Zeiss LSM 700</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Użyto następujących obiektywów: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny z 0.1% Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane preparaty mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Szklane laminki</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>Rozmiar 1 &amp;#189; (specyficzne dla obiektywów użytych w tej pracy).</td></tr><tr><td>Szklane laminki (do tworzenia podpórek)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Należy użyć czterech laminek sklejonych superglue.</td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td></td><td></td><td>Stalowe jednoostrzniowe ostrza przemysłowe</td></tr><tr><td>Spatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Igły hipodermiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>Rozmiar 26 Gauge</td></tr><tr><td>Pipety</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w układzie pionowym embrionów drosophila

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej występuje kilka dobrze znanych gradientów morfogenetycznych oraz ruchów komórkowych w obrębieDrosophilazarodka. Jednakże obecnie stosowane techniki obrazowania takich procesów są w pewnym stopniu ograniczone. Poniższy protokół opisuje nową technikę montowania utrwalonych i znakowanychDrosophilazarodki do obrazowania w płaszczyźnie czołowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Metoda ta polega na zatopieniu zarodków pomiędzy dwiema warstwami medium montażowego z galaretki glicerynowej i obrazowaniu pionowo ustawionych pasków galaretki. Pierwszym krokiem przygotowania takiej „kanapki” z zarodkami jest nałożenie cienkiej warstwy galaretki glicerynowej na szkiełko podstawowe. Następnie zarodki są ostrożnie ustawiane na tej powierzchni i przykrywane drugą warstwą galaretki. Po zestaleniu się drugiej warstwy wycina się paski galaretki i ustawia je pionowo do obrazowania. W zależności od rodzaju używanego statywu mikroskopu opisano alternatywne sposoby wizualizacji zarodków. Ponieważ wszystkie komórki wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej są obrazowane w jednej płaszczyźnie Z mikroskopu konfokalnego, nasza metoda umożliwia precyzyjny pomiar i porównanie sygnałów fluorescencyjnych bez fotobielenia lub rozpraszania światła, które są powszechne w rekonstrukcjach 3D zarodków zamontowanych podłużnie.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół montowania barwionych zarodków Drosophila w pozycji pionowej, co umożliwia obrazowanie przekrojów poprzecznych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej zarodka Drosophila zachodzi kilka dobrze znanych gradientów morfogenetycznych oraz ruchów komórkowych. Jednakże obecne ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest uzyskanie obrazów przekroju czołowego nienaruszonych embrionów oph przy użyciu mikroskopii konfokalnej, które mogą zostać wykorzystane do precyzyjnego pomiaru wielkości embrionów oraz ilościowego określenia poziomów ekspresji białek i RNA. Osiąga się to poprzez zastosowanie medium montażowego o konsystencji żelowej, w którym zamyka się embriony i ustawia je w pozycji pionowej. Jako pierwszy krok.Zarodki ustawiono w jednej linii na cienkiej warstwie galaretki glicerynowej, a następnie przykryto drugą warstwą tego medium. Następnie medium montażowe zawierające zarodki pocięto na bloki, które można odwrócić pionowo w celu ich unieruchomienia. Zarodki w pozycji do obrazowania pozwalają na uzyskanie obrazów przekroju poprzecznego wizualizowanych za pomocą dowolnego rodzaju mikroskopu konfokalnego.Witam, nazywam się Milu. Jestem doktorantką w Meso Lab na wydziale biologii na Case Western Reserve University. Dzisiaj zaprezentujemy protokół montowania embrionów PHI w pozycji bocznej do obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego.Opracowaliśmy tę metodę podczas zajęć laboratoryjnych w ramach kursu biologii rozwojowej tutaj, w Case, we współpracy z Dr. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak technika obrazowania Endon opracowana przez laboratorium Mindin, jest to, że umożliwia ona prosty proces przygotowania i wizualizacji utrwalonych embrionów lub tkanek o dowolnym rozmiarze i kształcie. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy musieliśmy zwizualizować przekroje bardzo małych embrionów innych gatunków gesso, których ręczne krojenie byłoby bardzo trudne. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu biologii rozwojowej, umożliwiając precyzyjną kwantyfikację ekspresji genów i poziomów białek wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej.Zazwyczaj embriony montuje się wzdłużnie. Chociaż możliwe jest uzyskanie rekonstrukcji przekrojów poprzecznych za pomocą oprogramowania Zack, często pojawia się problem fotoblaknięcia fluorescencyjnych oczu oraz rozpraszania światła, a cały proces jest bardzo czasochłonny. Nasza technika minimalizuje te problemy, ponieważ obrazy przekrojów poprzecznych embrionów są wizualizowane wzdłuż pojedynczego punktu konfokalnego.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności podczas wycinania bloków glicerynowych w pobliżu końców embrionów. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ wymaga ona ostrożnego obchodzenia się z materiałem. Przedstawiamy dzisiaj pokaz przygotowany przez nasze studentki, Catherine Chen i Catty, dotyczący przygotowania embrionów drozofili do obrazowania w pozycji pionowej.W pierwszej kolejności rozpuść galaretkę glicerynową w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C przez 20 do 30 minut, aż powstanie jednorodna, płynna zawiesina. Nie wstrząsaj jednak butelką, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Używając przyciętego końcówki pipety P 1000, ostrożnie nanieś 1 mL roztopionej galaretki glicerynowej na szkiełko.Aby utworzyć cienką, równomierną pierwszą warstwę wolną od pęcherzyków powietrza, należy pozostawić żel do zastygnięcia przez pięć minut na poziomej powierzchni. Następnie należy umieścić preparat w zamrażarce o temperaturze -20 °C na pięć minut. Alternatywnie można przykryć preparat folią spożywczą i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez maksymalnie pięć dni.Po zestaleniu się pierwszej warstwy galaretki, przenieś preparat pod mikroskop i przystąp do ustawiania zarodków. Nanieś pipetą niewielką ilość zbarwionych zarodków oraz 70% PBS z glicerolem na bok pierwszej warstwy galaretki. Pod mikroskopem ułóż zarodki obok siebie w trzech lub czterech kolumnach na każdym preparacie.Użyj igły hipodermicznej, aby zebrać je, wykorzystując skośną stronę igły w sposób przypominający łyżeczkę. Ostrożnie zorientuj głowy wszystkich embrionów w tym samym kierunku, przesuwając je poziomo po podłożu galaretkowym za pomocą igły.Końcowa konfiguracja ustawionych zarodków będzie podobna do tej opisanej dla wstrzykiwania DNA. Używając skręconego kawałka chusteczki Kim wipe, usuń nadmiar PBS z glicerolem z zarodków. Ostrożnie nanieś pipetą od 50 do 300 µL roztopionej galaretki glicerynowej na zarodki, w zależności od ich liczby, aby utworzyć drugą warstwę galaretki.Na koniec schłodź preparat w temperaturze -20 °C przez 5 do 10 minut lub przechowuj go w temperaturze 4 °C przez noc. Aby usunąć zatopione w glicerolu embriony z szkiełka w celu obrazowania pod mikroskopem stereoskopowym, użyj żyletki, aby przeciąć galaretkę w bezpośrednim sąsiedztwie przedniej i tylnej strony wyrównanych embrionów. Trzymaj żyletkę pod kątem 90 stopni.Aby wykonać proste cięcia, dodaj 100 do 200 µL zimnego PBT obok linii cięcia. Następnie ostrożnie zeskrob galaretkę znajdującą się obok embrionów. Używając szpatułki, PBT pomaga uwolnić blok embrionów.Przenieś blok na suchą lamellę do dalszego cięcia. Najpierw wykonaj cięcia mniejszych bloków zawierających od pięciu do siedmiu embrionów. Następnie odetnij nadmiar żelu glicerynowego, który mógłby utrudnić obrazowanie.Na koniec, przy pomocy żyletki i igły, obróć osadzone zarodki do pozycji pionowej. Aby zwizualizować zarodki drosophila za pomocą konfokalnego mikroskopu odwróconego, umieść blok galaretkowy zawierający zarodki na lamelce. Upewnij się, że miejsce zarodka z najmniejszą ilością galaretki znajduje się w bliższym kontakcie z obiektywem.W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu biologicznego, przygotuj cztery stosy z kleju kropelkowego. Po pierwsze, użyj szkiełek nakrywkowych jako podkładek i umieść blok z zarodkiem w glicerolu pomiędzy tymi podkładkami. Połącz stosy dłuższym szkiełkiem nakrywkowym w celu przeprowadzenia analizy konfokalnej.Umieść preparat na stoliku mikroskopu. Sprawdź odległość roboczą używanych obiektywów, aby ustalić, czy możliwe jest obrazowanie całego zarodka, czy tylko jego części; skonfiguruj ustawienia konfokalne w komputerze, aby rozpocząć obrazowanie, zgodnie z prezentacją. Jeśli protokół zostanie wykonany prawidłowo, można zaobserwować obrazy w przekroju poprzecznym zarodków z nienaruszoną morfologią, ponieważ zarodki pozostają w stanie nienaruszonym.Tę metodę można wykorzystać do precyzyjnego pomiaru rozmiarów embrionów oraz poziomu ekspresji genów wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej. Po opanowaniu techniki czas jej wykonania wynosi od 30 do 45 minut. Ważne jest usunięcie nadmiaru glicerolu przed wylaniem drugiej warstwy galaretki glicerynowej na embriony.W przeciwnym razie dwie warstwy mogą się rozdzielić, co utrudni etap cięcia. Należy również sprawdzić odległość roboczą używanych obiektywów, aby upewnić się, czy możliwe jest obrazowanie całego zarodka, czy tylko jego części, ponieważ odległość robocza ogranicza zakres obrazowania. Należy pamiętać, aby odciąć galaretkę blisko strony zarodka, która będzie skierowana w stronę obiektywu.W przeciwnym razie obrazowanie obejmie jedynie galaretkę zamiast embrionów. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli dobrą wiedzę na temat tego, jak wykonywać obrazy przekrojowe embrionów Joseph. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pionowe obrazowanie zarodków Drosophila

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości do pozyskiwania trójwymiarowych (3D) obrazów embrionów myszy. Ten ulepszony protokół wykorzystuje zmodyfikowaną metodę przygotowania tkanek w celu zwiększenia penetracji barwnika fluorescencyjnego, umożliwiając w ten sposób analizę morfometryczną zarówno małych, jak i dużych próbek.

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Poznaj metodę montażu zarodków Drosophila w pozycji pionowej do obrazowania przekrojów poprzecznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia precyzyjne pomiary wielkości zarodków i ilościowe określenie poziomów ekspresji białek oraz RNA.

Obrazowanie w układzie pionowym embrionów Drosophila

Przeglądaj więcej filmów