Name: Wzrost i różnicowanie dorosłych nerwowych komórek macierzystych wiewiórki arktycznej hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę hodowli i różnicowania komórek macierzystych nerwowych z hipokampa dorosłej wiewiórki arktycznej. Technika umożliwia uzyskanie zrównoważonej kultury neuronów i komórek glejowych do badań neurogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana z grantu nr 05178001 przyznanego przez US Army Medical Research and Materiel Command oraz z grantu NS041069-06 z The National Institute of Neurological Disorders and Stroke. Dziękujemy Joelowi Vonnahme za pomocne uwagi dotyczące protokołu.

1. Przygotowanie neuralnych komórek macierzystych AGS oraz pożywek
<ol>
<li>Neuralne komórki macierzyste (NSC) z hipokampa dorosłego wiewiórkasa syberyjskiego (AGS), izolowane w sposób opisany wcześniej9, są obecnie dostępne w sprzedaży jako fiolki kriokonserwowane. Komórki są transportowane w ciągu jednej doby w izolowanych opakowaniach z suchym lodem, aby zapewnić ich utrzymanie w stanie kriokonserwowanym. W celu zachowania integralności komórek, należy je rozpakować natychmiast po otrzymaniu i przechowywać w temperaturze poniżej -150°C lub w fazie parowej ciekłego azotu w naczyniu Dewara.</li>
<li>Przygotować podłoże podstawowe agsNSC + 5% FBS, dodając 5 mL FBS (LS-1012) do 95 mL podłoża podstawowego agsNSC.</li>
<li>Przygotować podłoże ekspansyjne agsNSC, dodając 500 μL suplementu B-27 (Invitrogen) do 50 mL podłoża podstawowego agsNSC. Pozostałą część suplementu B27 podzielić na aliquoty po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20°C do czasu użycia.</li>
<li>Podgrzać 25 mL podłoża podstawowego agsNSC + 5% FBS oraz 20 mL podłoża ekspansyjnego agsNSC w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.</li>
<li>Pokryć flaszki używane do ekspansji poli-L-ornityną:
<ol>
<li>Rozmrozić roztwór roboczy poli-L-ornityny (10 μg/mL). Po rozmrożeniu przechowywać roztwór w temperaturze 2-8°C przez maksymalnie jeden miesiąc.</li>
<li>Do jednej wentylowanej flaszki T-75 dodać 8 mL roztworu roboczego poli-L-ornityny i równomiernie rozprowadzić go po całej powierzchni hodowlanej flaszki. (Dostosować ilość roztworu roboczego do innych używanych naczyń hodowlanych. Stosować 0,5 - 1,0 mL roztworu roboczego poli-L-ornityny na każde 10 cm2 powierzchni hodowlanej).</li>
<li>Inkubować flaszki w temperaturze 37°C przez minimum 24 godziny. (Do inkubacji naczyń hodowlanych pokrytych poli-L-ornityną zaleca się stosowanie inkubatora bez dodatku CO2). Pokryte flaszki można przechowywać w inkubatorze do dwóch tygodni.</li>
<li>Przed użyciem odessać roztwór roboczy poli-L-ornityny z flaszki i dwukrotnie przemyć ją sterylną wodą klasy do hodowli tkanek. Odessać ciecz tak, aby przed użyciem flaszka była prawie sucha.</li>
</ol>
</li>
<li>Wyjąć fiolkę z naczynia Dewara i sprawdzić, czy korek jest szczelnie zamknięty. Trzymając fiolkę za górną część, zanurzyć dolną połowę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez około 60-90 sekund lub do momentu, gdy fiolka zostanie niemal całkowicie rozmrożona; wciąż powinna być widoczna niewielka ilość lodu. Aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia, nie zanurzać korka fiolki w wodzie. Nie rozmrażać nadmiernie, ponieważ może to uszkodzić komórki.</li>
<li>Spryskać zewnętrzną stronę fiolki 70% etanolem lub izopropanolem, a następnie umieścić fiolkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie zdjąć korek, aby uniknąć zanieczyszczenia lub rozprysków.</li>
<li>Delikatnie resuspendować komórki w fiolce, dodając za pomocą sterylnej pipety 1 mL podłoża podstawowego agsNSC + 5% FBS. Przenieść resuspendowane komórki do 25 mL ciepłego podłoża podstawowego agsNSC + 5% FBS w probówce wiriórce o pojemności 50 mL.</li>
<li>Jednokrotnie przepłukać kriofiolkę rozcieńczoną zawiesiną komórkową. Wirować komórki przy 150 x g przez 6 minut. Dla uzyskania najlepszych rezultatów należy obliczyć prędkość dla każdego konkretnego typu wirówki.</li>
<li>W czasie wirowania dodać 10 mL podłoża ekspansyjnego agsNSC do suchej, pokrytej poli-L-ornityną flaszki T-75 oraz dodać 40 μL rh FGF-basic (40ng/mL). Po wirowaniu odessać supernatant, uważając, aby nie odessać osadu komórkowego. Resuspendować komórki w 10 mL podłoża ekspansyjnego agsNSC. Przenieść resuspendowane komórki w podłożu ekspansyjnym agsNSC do podłoża we flaszce T-75.</li>
<li>Delikatnie kołysać naczyniem hodowlanym z boku na bok, aby równomiernie rozmieścić komórki w naczyniu.</li>
<li>Umieścić zasiałe naczynie hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2. Komórki powinny przytwierdzić się do flaszki i zacząć tworzyć wypustki w ciągu dwóch godzin od zasiaania. Jeśli komórki pozostają w zawiesinie i tworzą skupiska w podłożu, należy ponownie odwirować komórki w 5% FBS i powtórzyć kroki 1.8-1.10 z użyciem świeżego podłoża i flaszki.</li>
</ol> 

2. Namnażanie AgsNSC
<ol>
<li>Dwa dni (~48 godzin) po rozmrożeniu i wysianiu komórek należy przeprowadzić pełną wymianę medium, używając 20 mL agsNSC Expansion Medium z dodatkiem 40 μL rh FGF-basic.</li>
<li>W dniu następującym po inokulacji należy dodać do kolb 40 μL rh FGF-basic. Komórki będą gotowe do trypsynizacji, gdy osiągną 75-80% konfluencji w trzecim lub czwartym dniu po inokulacji. Nie zaleca się hodowli nieróżnicujących się komórek macierzystych przez więcej niż 4 dni po inokulacji, ponieważ dłuższa inkubacja może doprowadzić do rozpoczęcia różnicowania komórek w neurony, które mogą ulec uszkodzeniu podczas trypsynizacji w kroku 3. rh FGF-basic można przechowywać w temperaturze 4°C do jednego tygodnia bez utraty aktywności. W razie potrzeby rh FGF-basic może zostać poddany jednemu dodatkowemu cyklowi zamrażania i rozmrażania w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
3. Trypsynizacja komórek
<ol>
<li>Pasaż agsNSC należy przeprowadzić od 3 do 4 dni po inokulacji. Jeśli agsNSC mają być ponownie namnażane, należy przygotować kolbę powleczoną poli-L-ornityną od 24 godzin do jednego tygodnia przed pasażem.</li>
<li>Odssać medium z naczynia hodowlanego. Dodać do naczynia 2,5 mL 0,05% trypsyny/0,02% EDTA (CM-0017) na każde 75 cm2 powierzchni. Delikatnie zamieszać kołysząc naczyniem, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem trypsyny/EDTA. Komórki zazwyczaj zaczynają odrywać się od powierzchni w ciągu 60 sekund, w zależności od stopnia konfluencji. Nie należy nadmiernie trypsynizować, ponieważ może to uszkodzić komórki. Delikatne opukiwanie naczynia hodowlanego z kilku stron ułatwi odrywanie się komórek.</li>
<li>Po odłączeniu się komórek dodać do kolby 10 mL podstawowego medium agsNSC + 5% FBS. Delikatnie zamieszać kołysząc naczyniem, aby zneutralizować cały roztwór trypsyny. Stosując aseptyczne techniki laboratoryjne, przenieść komórki pipetą do sterylnej probówki do wirowania zawierającej 10 mL podstawowego medium agsNSC + 5% FBS. Powtórzyć czynność, płucząc kolbę ponownie 10 mL podstawowego medium agsNSC + 5% FBS i połączyć z pierwszą porcją wypłuczyn.</li>
<li>Wirować komórki przy 150 x g przez 6 minut zgodnie z powyższym opisem. Po wirowaniu komórki powinny utworzyć wyraźny, luźny pellet. Odssać zneutralizowaną trypsynę i medium z probówki do wirowania, a pellet komórkowy resuspender w 10 mL (na każdą kolbę T-75) uprzednio ogrzanego podstawowego medium agsNSC + 5% FBS, delikatnie pipetując w górę i w dół 2 razy za pomocą pipety 10 mL. Wykonać zliczanie komórek zgodnie z poniższym opisem.</li>
</ol>
4.	Standardowe obliczenia wysiewu komórek
<ol>
<li>Stosując technikę aseptyczną, wymieszać zawiesinę komórkową i przenieść 15 μL zawiesiny do probówki do mikrowirowania. Dodać 15 μL 0,4% Trypan Blue. Delikatnie wymieszać i nanieść 10 μL zawiesiny komórkowej do każdej z komór czystego hemacytometru, takiego jak Bright Line Counting Chamber (katalog #1490: Hausser Scientific, <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a>).</li>
<li>Policzyć komórki w minimum 4 kwadratach hemacytometru. Komórki zabarwione na niebiesko, wykazujące pozytywną reakcję z Trypan Blue, są martwe i nie powinny być liczone. Dla uzyskania dokładnego wyniku, optymalna liczba komórek na kwadrat powinna wynosić od 25 do 75 komórek.</li>
<li>Po policzeniu komórek obliczyć średnią z 4 kwadratów. Pomnożyć średnią liczbę komórek przez 10 000 oraz przez czynnik rozcieńczenia (2 w przypadku zastosowania zalecanych objętości), aby wyznaczyć liczbę komórek na mL. Należy pamiętać, że jeśli całkowity procent żywotności jest mniejszy niż 92%, może to mieć kilka przyczyn. Jednym z powodów niskiej żywotności może być zbyt długa trypsynizacja przed neutralizacją trypsyny za pomocą FBS. Inną przyczyną może być zbyt niskie stężenie surowicy (FBS) w stosunku do trypsyny, przez co komórki są nadal poddawane działaniu trypsyny. Po trzecie, komórki mogły osiągnąć zbyt wysoką konfluencję, co mogło spowodować różnicowanie się komórek macierzystych w wyniku kontaktu międzykomórkowego, prowadząc do uszkodzeń podczas trypsynizacji. Ścisłe przestrzeganie tej metody pozwala oczekiwać uzyskania 3 lub więcej podwojeń, co daje populację &gt;4 000 000 komórek z początkowej liczby ~500 000.</li>
</ol>
5.	Inokulacja kolejnego kolby do amplifikacji
<ol>
<li>Aby określić całkowitą liczbę komórek potrzebną do zaszczepienia jednego naczynia, należy pomnożyć żądaną gęstość wysiewu (6 600 komórek na cm2 lub 500 000 komórek na kolbę T-75) przez powierzchnię (w cm2) naczynia przeznaczonego do zaszczepienia. W przypadku zaszczepiania więcej niż jednego naczynia należy pomnożyć liczbę komórek na naczynie przez całkowitą liczbę naczyń. Aby określić objętość (mL) zawiesiny komórkowej niezbędną do zaszczepienia każdego naczynia, należy podzielić liczbę komórek wymaganą do zaszczepienia jednego naczynia przez liczbę żywych komórek/mL w zawiesinie komórkowej. W przypadku zaszczepiania więcej niż jednego naczynia należy obliczyć całkowitą objętość potrzebnej zawiesiny komórkowej, mnożąc objętość wymaganą dla jednego naczynia przez całkowitą liczbę naczyń do zaszczepienia.</li>
<li>Odwirować żądaną objętość komórek w agsNSC Basal Medium + 5% FBS, aż do uzyskania luźnego osadu. Zazwyczaj 500 000 komórek doprowadza się do całkowitej objętości 25 mL w agsNSC Basal Medium + 5% FBS, zgodnie z wcześniejszym opisem. Odessać ciecz i zawiesić ponownie luźny osad w 10 mL agsNSC Expansion Medium. Ten dodatkowy etap wirowania jest wymagany w celu usunięcia FBS przed zaszczepieniem. Do kolby T-75 dodać 10 mL uprzednio ogrzanego agsNSC Expansion Medium. Do kolby T-75 dodać 10 mL ponownie zawieszonej zawiesiny komórkowej, a następnie dodać do kolby 40 μL rh FGF-basic. Decydując o maksymalnej liczbie kolb, z którymi można pracować jednocześnie, należy wziąć pod uwagę, że trypsynizacja i szczepienie nie powinny trwać dłużej niż 1,5 h. Należy również zapewnić wystarczającą ilość pożywki do całkowitej wymiany medium w przypadku użycia wielu kolb.</li>
<li>Delikatnie kołysać kolbą z boku na bok, aby równomiernie rozłożyć komórki, a następnie umieścić naczynia hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2, zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
</ol>
6. Rozcieńczanie komórek w celu inokulacji płytek do różnicowania
<ol>
<li>Można zastosować dowolny format wielodołkowy, jednak inokulację należy przeprowadzić w płytkach BD Biocoat Poly-LW niniejszym rozdziale opisano zastosowanie płytek 96-dołkowych pokrytych lizyną. Oblicz objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do przeprowadzenia eksperymentu, mnożąc liczbę dołków przeznaczonych do inokulacji przez 0,2 ml na dołek dla płytki wielodołkowej typu 96, a następnie dodaj około 10% zapasu, aby zrekompensować ewentualne straty objętości podczas inokulacji. Oblicz rozcieńczenie tak, aby uzyskać gęstość komórek na poziomie 75 000 komórek/ml. Określ ilość FBS, którą należy dodać do medium różnicującego, aby osiągnąć stężenie końcowe 2% FBS (Tabela 1). Wymieszaj FBS z medium różnicującym. Ostrożnie połącz komórki z obliczoną objętością medium różnicującego z dodatkiem FBS. (Uwaga: podczas wirowania komórki znajdują się w medium podstawowym agsNSC + 5% FBS. Chociaż FBS chroni komórki podczas wirowania i ułatwia ich adhezję, hamuje on jednocześnie różnicowanie. Rozcieńczenie FBS do poziomu 2% umożliwi adhezję komórek do powierzchni płytki wielodołkowej. Następnie 2% FBS ulega dalszemu rozcieńczeniu, aby wspomóc różnicowanie. W skład medium różnicującego wchodzi również insulina-transferyna-selen (ITS-e) w celu stymulacji procesu różnicowania).</li>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza nalać 200 µl rozcieńczonej zawiesiny komórkowej ze sterylnego zbiornika combitip do każdej studzienki płytki 96-dołkowej pokrytej poli-L-lizyną, używając pipety wielokanałowej z końcówkami o szerokim wylocie. Inkubować płytki przez 1,5–2 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO22Po przywierceniu komórek, po około 90 do 120 minutach, ostrożnie usunięto 50% (100 μL (dla płytek 96-dołkowych) medium z każdego dołka, używając końcówek do pipet o szerokim otworze. Usuniętą objętość ostrożnie zastąp ciepłym medium do różnicowania agsNSC (agsNSC Differentiation Medium), ponownie używając końcówek do pipet o szerokim otworze. (Stosowanie standardowych końcówek może uszkodzić komórki).</li>
<li>Dwa dni po inokulacji (~ 48 godzin) należy wymienić 50% pożywki, używając pożywki do różnicowania agsNSC Differentiation Medium oraz końcówek do pipet z szerokim otworem.</li>
</ol>
7.	Utrzymanie neuronów
<ol>
<li>Przygotować pożywkę do utrzymania neuronów (Neuronal Maintenance Medium), wykorzystując NeuraLife, glutaminę oraz B27 zgodnie z instrukcją. Pożywkę do utrzymania neuronów należy przygotowywać co tydzień.</li>
<li>Dwa dni po ostatniej wymianie pożywki różnicującej agsNSC (agsNSC Differentiation Medium), zazwyczaj w 4. dniu po inokulacji, przeprowadzić 50% wymianę pożywki, stosując pożywkę do utrzymania neuronów.</li>
<li>Kontynuować 50% wymiany pożywki na pożywkę do utrzymania neuronów co 2 do 3 dni. Wypustki neuronalne powinny pojawić się w ciągu kilku dni od przejścia na pożywkę do utrzymania neuronów. Komórki należy wykorzystać w ciągu 3 tygodni od przeniesienia do pożywki do utrzymania neuronów. Neurony można zidentyfikować przy użyciu szeregu dostępnych komercyjnie markerów neuronalnych. Zawsze będą obserwowane również astrocyty.</li>
<li>Populacje hodowlane zazwyczaj wykazują stosunek neuronów do całkowitej liczby komórek powyżej 40%. Stosowanie innych pożywek do utrzymania neuronów niż NeuraLife może skutkować uzyskaniem komórek o gorszych parametrach, które nie wykazują dojrzałości morfologicznej i mogą nie przetrwać tak długo w hodowli.</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki:
Dorosłe komórki macierzyste neuronów wiewiórki arktycznej będą podwajać swoją liczbę co 24 hrs przez okres od 3 do 5 dni w ciągu co najmniej dwóch pasaży, przy wysiewie 500,000-600,000 komórek/75mm flask. Komórki te łatwo ulegają różnicowaniu po usunięciu basicFGF i B27 oraz w obecności 1-2% FBS i 1% Insulin/Transferrin/Selenium, stając się neuronami pozytywnymi pod kątem TUJ1 (Covance) w ciągu 14-21 dni (patrz Rysunek 2). Stosunek neuronów do całkowitej liczby komórek będzie mieścić się w przedziale 40-60%, w zależności od wieku hodowli (Rysunek 3). Neurony mogą być wykorzystywane do eksperymentów od 12 dnia po wysiewie przez co najmniej 21 dni po wysiewie.

<img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej; badanie proliferacji komórek; badania biologiczne; analiza wzrostu tkanki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Fotomikrografia dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa AGS. 
Fotomikrografia w kontraście fazowym dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa AGS po 3 dniach wzrostu w pożywce podstawowej agsNSC w kolbach pokrytych poli-L-ornityną. Podwajanie liczby komórek następuje w przybliżeniu co 24h. Zdjęcie przy powiększeniu 100X.
<img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej; wizualizacja sieci neuronów; zielone mikrotubule, niebieskie barwienie jąder." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Mikrofotografia fluorescencyjna zróżnicowanych dorosłych komórek macierzystych hipokampa AGS 
Komórki macierzyste AGS poddano działaniu pożywki do różnicowania przez 4 dni, a następnie utrzymywano w Neuralife przez kolejne 17 dni przed utrwaleniem. Komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie, a neurony zidentyfikowano przy użyciu przeciwciała pierwszorzędowego TUJ1 (Covance) oraz przeciwciała wtórnego Alexa Fluor 568 (kolor zielony) z firmy Invitrogen. W celu zabarwienia wszystkich jąder (kolor niebieski) dodano barwnik Hoechst 33343. Liczbę komórek, liczbę neuronów oraz stosunek neuronów określono przy użyciu oprogramowania do analizy wypustek neurytowych oraz instrumentu Arrayscan firmy Cellomics. Zdjęcie to reprezentuje około 57% neuronów. Powiększenie 10X
<img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Wykres analizy wzrostu neuronów: średnia liczba, stosunek procentowy w czasie; dni 16, 19, 21." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Liczba neuronów i stosunek neuronów w zróżnicowanych neuralnych komórkach macierzystych AGS w trzech okresach hodowli 
Neuralne komórki macierzyste AGS poddano działaniu pożywki różnicującej przez 4 dni, a następnie utrzymywano w Neuralife przez 12, 15 i 17 dni przed utrwaleniem. Komórki utrwalono, a neurony zidentyfikowano za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego TUJ1 (Covance). Dodano barwnik Hoechst w celu zabarwienia wszystkich jąder dla identyfikacji całkowitej liczby komórek. Liczbę komórek, liczbę neuronów i procentowy stosunek neuronów określono przy użyciu oprogramowania do analizy wypustek neurytów oraz instrumentu Arrayscan firmy Cellomics. Wartości reprezentują średnią z 15 studni na warunek + SD.

Tabela 1. Przykładowe obliczenia stosowane podczas pasażowania i wysiewania
<ol>
<li>Przy użyciu zawiesiny komórkowej o stężeniu 700 000 cells/mL</li>
<li>Przy zastosowaniu gęstości komórkowej 75 000 cells/mL lub 15 000 komórek na studzienkę o objętości 0,2 mL w każdej studzience.</li>
<li>Zaszczepienie 96 studzienek przy 0,2 mL na studzienkę = 19,2 mL lub pożądana objętość końcowa 21 mL.</li>
<li>(Stężenie końcowe x Objętość końcowa) ÷ Stężenie początkowe = Objętość początkowa 
	(21 mL x 75 000 cells/mL) ÷ 700 000 = 2,25 mL</li>
<li>Objętość FBS w zawiesinie komórkowej: 2,25 mL = 2,25 mL x 0,05 = 0,1125 mL</li>
<li>Objętość FBS potrzebna w 21 mL = 21 mL x 0,02 = 0,42 mL</li>
<li>Objętość FBS do dodania do pożywki różnicującej = 0,42 mL - 0,1125 mL = 0,3075 mL</li>
<li>Objętość pożywki różnicującej = 21 mL - 2,25 mL zawiesiny komórkowej - 0,3075 mL 5% FBS = 18,44 mL.</li>
<li>Połączyć 18,44 mL pożywki różnicującej z 0,308 mL FBS i dodać 2,25 mL zawiesiny komórkowej.</li>
</ol>

<ol><li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+avoidance+in+a+mammal%3A+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li>
<li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li>
<li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li>
<li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li>
<li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arctic+ground+squirrel+%28Spermophilus+parryii%29+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1%2F2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li>
<li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li>
<li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+progenitor+cells%3A+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li>
<li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li>
<li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li>
</ol>

J.A. Kelleher-Andersson jest założycielem firmy Neuronascent oraz wynalazcą w zgłoszeniach patentowych dotyczących wiewiórki arktycznej. Firma Neuronascent otrzymuje tantiemy ze sprzedaży mediów i komórek macierzystych AGS. R.C. McGee jest zatrudniony przez firmę Lifeline, Inc., która dystrybuuje media oraz neuralne komórki macierzyste AGS.

Dorosłe komórki macierzyste neuronów AGS są wytrzymałe i mogą być namnażane przez wiele pasaży, co czyni je doskonałym źródłem komórek macierzystych neuronów do badania podstawowych właściwości tych komórek. Tempo ekspansji wynosi w przybliżeniu jeden podział co dwadzieścia cztery godziny, jednak komórki te muszą być pasażowane przed osiągnięciem konfluencji, ponieważ kontakt między komórkami sprzyja różnicowaniu w astrocyty. Różnicowanie pośredniczone przez kontakt spowoduje zatem gwałtowny spadek stosunku liczby neuron...

<table><tbody><tr><td>agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekspansji agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0008</td><td>Alternatywne źródło dla DMEM/F12, B27 i rhFGFb (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Zestaw do różnicowania agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0009</td><td>Alternatywne źródło dla DMEM/F12 i ITS-x (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Zestaw pożywek do utrzymania NeuraLife</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0012</td><td>Alternatywnymi źródłami są NeuraBasal (LifeLine) lub Neurobasal (Invitrogen), glutamina i B27 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;). Zróżnicowane komórki utrzymuje się do 3 tygodni w NeuroLife, ale nie dłużej niż 2 tygodnie w Neurobasal (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Mikrometr (np. komora licznikowa Bright Line Counting Chamber)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe Biocoat pokryte poli-L-lizyną</td><td>BD Biosciences</td><td>356516</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>Zapobiegają uszkodzeniu komórek neuronalnych podczas pipetowania. &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

wzrost i różnicowanie dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa wiewiórki syberyjskiej

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Wiewiórki amerykańskie z rodzaju Urocitellus (Urocitellus parryii, AGS) wyróżniają się unikalną zdolnością do hibernacji przy temperaturze rdzeniowej ciała bliskiej lub poniżej punktu zamarzania 1. Zwierzęta te wykazują również odporność na uszkodzenia niedokrwienne mózgu in vivo 2,3 oraz na deprywację tlenowo-glukozową in vitro 4,5. Te wyjątkowe właściwości stały się impulsem do izolacji neuronów AGS w celu zbadania wrodzonych cech neuronalnych, które mogłyby wyjaśniać zdolność neuronów AGS do opierania się uszkodzeniom i śmierci komórkowej wywołanej niedokrwieniem oraz ekstremalnie niskimi temperaturami. Identyfikacja białek lub genów odpowiedzialnych za te charakterystyczne właściwości komórek mogłaby pomóc w opracowaniu skutecznych terapii dla szeregu wskazań niedokrwiennych oraz w badaniu tolerancji zimna. Hipokamp dorosłych AGS zawiera komórki macierzyste neuronów, które nadal proliferują, co umożliwia łatwą ekspansję tych komórek w hodowli. Opisujemy tutaj metody, dzięki którym badacze mogą wykorzystać te komórki macierzyste oraz zróżnicowane neurony w wielu celach. Ścisłe przestrzeganie tych kroków pozwala na namnożenie neuralnych komórek macierzystych AGS przez dwa lub więcej pasaże, a następnie ich zróżnicowanie do kultury o wysokiej zawartości neuronów TUJ1-dodatnich (~50%) bez użycia toksycznych chemikaliów w celu zminimalizowania liczby dzielących się komórek. Niedokrwienie indukuje neurogenezę 6, a neurogeneza przebiegająca przez szlaki przeżycia MEK/ERK i PI3K/Akt przyczynia się do odporności na niedokrwienie in vivo7 oraz in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., w przygotowaniu). Dalsza charakterystyka tych wyjątkowych komórek neuralnych może przynieść postępy na wielu polach, przy zastosowaniu niektórych lub wszystkich opisanych metod.

Neuronalne komórki macierzyste przygotowano z hipokampa dorosłych, niehibernujących, rocznych wiewiórek arktycznych (AGS). Komórki te można namnażać w wielu pasażach, różnicować i utrzymywać jako kulturę neuronów i gleju w stosunku bliskim 50:50.

Wzrost i różnicowanie dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa wiewiórki syberyjskiej

Wiewiórki arktyczne (*Urocitellus parryii*, AGS) są wyjątkowe ze względu na zdolność do hibernacji przy temperaturze wewnętrznej ciała bliskiej punktowi zamarzania lub poniżej niej 1. Te...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wysiew, ekspansja i różnicowanie komórek macierzystych neuronów przygotowanych z hipokampa dorosłych, niehibernujących, rocznych arktycznych wiewiórek gruntowych. Jest to realizowane poprzez wstępny wysiew komórek macierzystych neuronów A GS, a następnie ich ekspansję i wysiew do medium różnicującego.Trzecim etapem procedury jest różnicowanie i utrzymanie neuronów, a na koniec komórki są utrwalane lub poddawane działaniu substancji i utrwalane w celu przeprowadzenia analizy. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że neuronalne progenitory GS nadal dzielą się przez dwa tygodnie różnicowania, utrzymania, a nawet w warunkach niedokrwiennych. Liczbę neuronów określa się za pomocą technik barwienia i mikroskopii fluorescencyjnej, które pozwalają zmierzyć proporcje neuronów.Implikacje tej techniki rozciągają się na odkrywanie terapii udaru mózgu i zatrzymania krążenia. Ponieważ w przypadku wiewiórki obrączkowej neuronsy zróżnicowane są odporne na wszystkie uszkodzenia niedokrwienne. Przed rozpoczęciem tej procedury przygotuj kolbę do ekspansji A-G-S-N-S-C, powlekając ją poliol ornityną. Przygotuj roztwór roboczy poliol ornityny, pozostawiając

growth-differentiation-adult-hippocampal-arctic-ground-squirrel

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wzrost i różnicowanie dorosłych komórek macierzystych mózgu wiewiórki kolczystej arktycznej z hipokampu

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Ten film pokazuje proces powstawania neurosfery i jej ekspansji z tkanki hipokampa. Nerwowe komórki macierzyste i progenitorowe z postnatalnej tkanki zakrętu zębatego myszy proliferują i tworzą pierwotne neurosfery, które są następnie ponownie zasiewane, tworząc neurosfery wtórne.

Tworzenie i rozszerzanie neurosfer z tkanki hipokampa

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Mózg psa jest cennym modelem do badania neurogenezy dorosłych. Przedstawiono tutaj protokoły izolowania i namnażania nerwowych komórek prekursorowych hipokampa dorosłych psów z pierwotnej tkanki mózgowej.

Izolacja i ekspansja prekursorów neuronalnych hipokampa u dorosłych psów

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

Przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych, generowanych przez programowanie neuronalne, może być potencjalnym podejściem do leczenia zaburzeń neurorozwojowych. Protokół ten opisuje wytwarzanie i przeszczepianie prekursorów neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do mózgów nowonarodzonych myszy, umożliwiając długoterminowe badanie przeszczepionych neuronów i ocenę ich potencjału terapeutycznego.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Poznaj metodę hodowli i różnicowania komórek macierzystych nerwowych z hipokampa dorosłej wiewiórki arktycznej. Technika umożliwia uzyskanie zrównoważonej kultury neuronów i komórek glejowych do badań neurogenezy.

Wzrost i różnicowanie dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa wiewiórki syberyjskiej

Przeglądaj więcej filmów