Name: In vivo (in vivo) Obrazowanie nienaruszonych larw Drosophila w rozdzielczości subkomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Poznaj metodę obrazowania in vivo nienaruszonych larw Drosophila melanogaster z użyciem desfluranu. Protokół umożliwia uzyskanie obrazów subkomórkowych zachowań synaptycznych przy 95% przeżywalności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Andreasowi Schönle z Instytutu Maxa Plancka ds. Chemii Biofizycznej w Niemczech oraz Davidowi J. Sandstromowi z Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego (National Institute of Mental Health), Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health) w Bethesda, MD, USA za pomoc techniczną. Dziękujemy Frankowi Köttingowi z Europejskiego Instytutu Neuronauki w Giecieńcu za skonstruowanie komory obrazowej oraz urządzenia do anestezji. Praca ta była wspierana grantami z Alzheimer Forschung Initiative dla T.M.R. Y.Z. otrzymał stypendium od China Scholarship Council, a S.B.H. stypendium od Graduate School for Cellular and Molecular Neuroscience na Uniwersytecie w Tübingen.

A) Montaż komory obrazowania
<ol>
	<li>Wybierz larwę na wybranym etapie rozwoju (np. wczesne larwy 3rd stadium, pozostawiając odstęp obserwacyjny około 24 godzin w 25°C do momentu przejścia w stadium wędrowne).</li>
	<li>Opłucz larwę wodą, aby oczyścić ją z pożywki, a następnie osusz ją delikatnie.</li>
	<li>Pokryj środek dolnego elementu komory, w miejscu, gdzie znajdzie się larwa, cienką warstwą oleju halowęglowego.</li>
	<li>Umieść larwę w komorze stroną brzuszną skierowaną w stronę obiektywu mikroskopu (umożliwia to obrazowanie złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ) 26 i 27) (Rycina 1 A-E).</li>
	<li>Połóż plastikowy dystans na warstwie oleju, kierując otwory powietrzne siatki do góry (Rycina 1 A).
Proszę zweryfikować na tym etapie:
Wysokość dystansora wynosi w przybliżeniu połowę średnicy larwy, a szerokość szczeliny powinna być około dwukrotnością średnicy larwy.</li>
	<li>Umieść komorę obrazującą na mikroskopie</li>
</ol>
B) Znieczulenie larwy
<ol start="7">
	<li>Podłącz dwa wloty komory do odpowiedniego urządzenia do znieczulania/vaporyzatora. Prosimy o wcześniejszą weryfikację: Efektywne stężenie desfluranu w powietrzu w pomieszczeniu nigdy nie powinno przekraczać wartości określonych przez przepisy bezpieczeństwa! Do znieczulenia larw potrzebna jest tylko bardzo mała całkowita objętość desfluranu. Zastosowanie 15% (v/v) desfluranu1 okazało się dobrym punktem wyjścia do wyznaczenia optymalnego stężenia do zastosowania w eksperymencie. Ze względów bezpieczeństwa sugerujemy, aby vaporyzator nigdy nie zawierał więcej desfluranu, niż jest to wymagane do 2-4 godzin obrazowania in vivo.</li>
	<li>Zanurz drugi koniec rurki przymocowanej do wylotu komory w szklance z wodą, a następnie otwórz zawory kontrolujące przepływ środka znieczulającego do komory na około pięć sekund. Prosimy o weryfikację na tym etapie: Czy w wodzie pojawiają się pęcherzyki powietrza? Jeśli nie, komora jest nieszczelna.</li>
	<li>Zamknij zawory na około trzy sekundy.</li>
	<li>Monitoruj pozostałe ruchy larwy pod mikroskopem. Sprawdź zarówno tętno, jak i ruchy mięśni. W razie potrzeby otwieraj i zamykaj zawory zgodnie z opisem w krokach 8 i 9, aż do pełnego znieczulenia larwy, a następnie zamknij wszystkie zawory i rozpocznij obrazowanie. Prosimy o weryfikację na tym etapie: Pozostałe ruchy mięśni lub tętno wskazują, że larva nie jest odpowiednio znieczulona. Pełne znieczulenie jest kluczowe dla uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości. Larwa zazwyczaj nie powinna być znieczulona przez więcej niż 15-20 minut w jednym czasie.</li>
</ol>
C) Obrazowanie
<ol start="11">
	<li>Zidentyfikuj właściwą pozycję i wykonaj obrazowanie interesującej struktury (Rysunek 2-4).</li>
</ol>
D) Wybudzanie z narkozy
<ol start="12">
	<li>Po zakończeniu obrazowania dopuść powietrze do komory. Prosimy zweryfikować na tym etapie: Sprawdź tętno i skurcze mięśni larwy za pomocą przechodzącego światła halogenowego. Gdy mięśnie zaczną się kurczyć, można bezpiecznie wyjąć larwę z komory obrazowania.</li>
	<li>Odłącz komorę od urządzenia do anestezji i zdejmij ją z mikroskopu. Ostrożnie rozmontuj komorę i umieść larwę w pożywce do hodowli much.</li>
	<li>Przechowuj szalkę w inkubatorze w odpowiedniej temperaturze.</li>
</ol>
E) Serie czasowe
<ol start="15">
	<li>Powtórzyć kroki 2-14, aż do uzyskania wystarczającej liczby punktów czasowych. Protokół alternatywny: Jeśli larwa ma być obrazowana częściej niż raz w odstępie 30 minut, praktycznym rozwiązaniem może być pozostawienie jej w komorze obrazowania do następnego punktu czasowego znieczulenia. Powtórzyć kroki 7-14, aż do uzyskania wystarczającej liczby punktów czasowych. Proszę zweryfikować na tym etapie: Larwy nie należy pozostawiać w komorze obrazowania przez więcej niż dwie godziny jednorazowo, ani znieczulać jej przez dłużej niż 15-20 minut jednorazowo.</li>
</ol>

<img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Sekwencyjny układ eksperymentalny do badania absorpcji optycznej; schemat z elementami analizy fotonicznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1 Montaż komory obrazowania. (A) Umieść larwę i plastikowy dystans na warstwie oleju. (B) Połóż szkiełko podstawowe 22 x 22 mm na dystansie i włóż pleksiglasowy pierścień prowadzący do komory, następnie (C) ustal pozycję larwy za pomocą metalowego pierścienia i (D) zamknij komorę. (E) Komora jest teraz gotowa do zamontowania na mikroskopie.
<img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, analiza struktury komórkowej, porównanie wzorów fluorescencji zielonej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2 Mięśnie ściany ciała w larwach Drosophila. Mięśnie i NMJ zostały zwizualizowane poprzez ekspresję białka fuzyjnego CD8-GFP-Sh8. Mięśnie przedstawiono w widoku przy ogniskowaniu na stronie brzusznej, przez kutykulę do wnętrza larwy. Na zdjęciach (A-C) pokazano najbardziej powierzchowny mięsień, 27, a na zdjęciach (K-L) najbardziej wewnętrzne mięśnie, 6 i 7. Pasek skali: 100 μm, ΔZ między przekrojami wynosi 2 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii kolokalizacyjnej ukazujące sygnały fluorescencyjne w przekrojach fioletowych i zielonych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3 Tożsamość mięśni ściany ciała w larwach Drosophila. Przedstawiono tożsamość mięśni w larwach Drosophila w stadium L3, segment A3. Mięśnie i złącza nerwowo-mięśniowe (NMJ) zwizualizowano poprzez ekspresję białka fuzyjnego CD8-GFP-Sh8. Mięśnie ukazano tak, jak są obserwowane podczas ogniskowania na stronie brzusznej przez kutykulę do wnętrza larwy. Na panelach A-C pokazano najbardziej powierzchowny mięsień, 27, a na panelach K-L najbardziej wewnętrzne mięśnie, 6 i 7. Pasek skali: 100 μm, ΔZ między przekrojami wynosi 2 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Proces segmentacji naczyń na obrazach mikroskopowych; schematy E-F pokazują wyniki analizy sekcji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4 Identyfikacja złączy nerwowo-mięśniowych larw Drosophila. (A-D) Złącza NMJ zwizualizowano poprzez ekspresję białka fuzyjnego DGluRIIA-mRFP1. Złącza NMJ przedstawiono w widoku podczas ogniskowania na stronie brzusznej przez kutykulę do wnętrza larwy. Na obrazach (A-B) pokazano najbardziej powierzchowne złącze NMJ, 27, a na C-D najbardziej wewnętrzne złącza NMJ, 6 i 7. Pasek skali: 100 μm, ΔZ pomiędzy przekrojami wynosi 5 μm. (E) i (F) dla odniesienia podano identyfikację powierzchownych (E) i bardziej wewnętrznych (F) złączy NMJ.

<ol><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li>
<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+vivo+imaging+of+long-term+changes+in+the+Drosophila+neuromuscular+system+%5B%5D%22">In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]</a>. , Georg-August-University Göttingen. (1988).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &amp, Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Przedstawiona metoda została opracowana początkowo w celu badania synaps glutaminergicznych w mięśniach ściany ciała larw Drosophila melanogaster. Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) Drosophila charakteryzuje się stereotypową cytoarchitekturą mięśni i neuronów, przez co idealnie nadaje się do obrazowania in vivo. Opisany protokół znieczulania nie ogranicza się jednak wyłącznie do obrazowania NMJ; przejrzystość larw Drosophila ułatwia adaptację opisanego protokołu do badania rozwoju narządów, migracji komórek, transportu ładunku aksonalnego oraz reorganizacji wewnątrzkomórkowej.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Odczynniki:&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;li&gt; Desfluran (Suprane, Baxter, Unterschlei)&amp;#223;heim, Niemcy)&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Olej halocarbonowy (np. olej Voltalef H10S / Atofina, Puteaux, Francja)&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Pożywka do hodowli muszek&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;Sprzęt:&lt;/p&gt;&lt;$\mu$l&gt;&lt;li&gt; Odwrócony mikroskop konfokalny&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Mikroskop binokularny (np. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Niemcy)&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Mały pędzelek stosowany do sortowania much&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Inkubator&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Dedykowana komora obrazująca (rysunki techniczne dostępne w Ref. 3)&lt;/li&gt;&lt;li&gt; Parownik/urządzenie do anestezji (Szczegóły znajdują się w Ref. 3)&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

obrazowanie in vivo nienaruszonych larw drosophila z rozdzielczością podkomórkową

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Niedawne usprawnienia w obrazowaniu optycznym, fluorofory kodowane genetycznie oraz narzędzia genetyczne umożliwiające efektywne tworzenie pożądanych transgenicznych linii zwierząt pozwoliły na badanie procesów biologicznych w kontekście żywego, a w niektórych przypadkach nawet wykazującego określone zachowania organizmu. W niniejszym protokole opiszemy, jak znieczulać nienaruszone larwy Drosophila, używając lotnego środka znieczulającego desfluranu, aby śledzić rozwój i plastyczność populacji synaptycznych z rozdzielczością podkomórkową1-3. Chociaż wcześniej opisano inne użyteczne metody znieczulania larw Drosophila melanogaster4,5,6,7,8, protokół przedstawiony w niniejszej pracy wykazuje znaczną poprawę dzięki następującym połączonym kluczowym cechom: (1) bardzo wysokiemu stopniowi znieczulenia; zatrzymywane jest nawet bicie serca, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości bocznej do 150 nm1, (2) wysokiemu wskaźnikowi przeżywalności wynoszącemu &gt; 90% na cykl znieczulenia, co umożliwia rejestrację danych w więcej niż pięciu punktach czasowych w okresie od kilku godzin do wielu dni2 oraz (3) wysokiej czułości, która w dwóch przypadkach pozwoliła nam badać dynamikę białek ekspresowanych na poziomach fizjologicznych. Szczegółowo, udało nam się zwizualizować postsynaptyczną podjednostkę receptora glutaminianu GluR-IIA ekspresowaną za pomocą promotora endogennego1 w stabilnych liniach transgenicznych oraz linię pułapki eksonowej FasII-GFP1. (4) W przeciwieństwie do innych metod4,7 larwy mogą być obrazowane nie tylko na żywo, ale także w stanie nienaruszonym (tzn. bez sekcji), co pozwala na prowadzenie obserwacji przez wiele dni1. Towarzyszące wideo szczegółowo opisuje funkcje poszczególnych części komory do obrazowania in vivo2,3, prawidłowy montaż larw, procedurę znieczulania, sposób ponownej identyfikacji określonych pozycji wewnątrz larwy oraz bezpieczne usuwanie larw z komory obrazowania.

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Ostatnie ulepszenia w obrazowaniu optycznym, fluorofory kodowane genetycznie oraz narzędzia genetyczne umożliwiające efektywne tworzenie pożądanych zwierząt transgenicznych ...

Przełomy w obrazowaniu optycznym oraz w zastosowaniu genetycznie kodowanych czujników siły umożliwiły naukowcom badanie interesujących ich procesów biologicznych w żywych, a w niektórych przypadkach nawet w wykazujących aktywność behawioralną organizmach. Podczas gdy wiele uwagi poświęcono badaniom mózgu ssaków in vivo, nasz zespół wykorzystuje dość prosty układ modelowy – złącze nerwowo-mięśniowe, a w poniższym materiale wideo wyjaśnimy, jak znieczulać i obrazować larwy muszki owocówki, aby śledzić rozwój poszczególnych synaps w czasie, od wielu godzin aż do kilku dni. Choć istnieją różne metody badania rozwoju u Drosophila, zaprezentowany protokół znieczulania charakteryzuje się następującymi kluczowymi cechami.Po pierwsze, dzięki bardzo wysokiemu stopniowi analizy, zatrzymywany jest nawet rytm serca, co jest niezbędne dla uzyskania wysokiej jakości obrazu. Po drugie, dzięki przeżywalności na poziomie 95% oraz możliwości pozyskiwania obrazów o wysokiej czułości. Poniższy protokół pozwala nam na przykład badać dynamikę receptorów glutaminianu znakowanych GFP i ekspresywnych na poziomie fizjologicznym pod kontrolą ich endogennych promotorów.Dowiedzą się Państwo teraz, jak umieścić larwy w komorze obrazowej, jak znieczulić larwy muszek owocówek, jak zlokalizować konkretną pozycję w obrębie larwy w celu obrazowania struktur oraz jak następnie wyłowić larwy z komory. Przed obrazowaniem in vivo ważne jest umycie larw. Choć proces ten jest prosty, należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić larw, dlatego do ich przenoszenia nigdy nie używa się pincety.Zamiast tego decydujemy się na delikatne ruchy pędzlem. Do mycia używamy wody w temperaturze pokojowej; jest to zwykła woda z kranu, niedestylowana i niezawierająca żadnych detergentów. Możemy to zobaczyć.Larwy są delikatnie przenoszone z pożywki do świeżej wody z kranu w celu uzyskania dobrych wyników. Kluczowe jest również, aby larwy przebywały w wodzie jak najkrócej. Zapobiegnie to przedostaniu się wody do tchawek, co utrudnia oddychanie, a także proces znieczulania.Następnie przygotowujemy komorę obrazowania. Najpierw rozprowadzamy bardzo cienką warstwę oleju na dolnym elemencie komory. Następnie umieszczamy larwy na tej warstwie oleju.Należy tutaj zadbać o to, aby końce rurek nie dotykały oleju. Po ich ustawieniu kładziemy na larwach kratkę dystansową. Ważne jest, aby trzy kanały były skierowane ku górze, co umożliwi dopływ powietrza do larw i zapobiegnie ich zatkaniu przez olej.Następnie nakładamy szkiełko nakrywkę na dystans i sprawdzamy, czy larwa jest odpowiednio ułożona. Oznacza to, że strona brzuszna musi być skierowana w dół, a końcowa strona grzbietowa, na której widoczne są tchawki, powinna być skierowana do góry. Teraz nakładamy plastikowy pierścień adaptacyjny oraz pierścień metalowy, aby zapewnić gładkie dociśnięcie larwy pomiędzy dwiema szkiełkami przedmiotowymi.Następnie zamykamy komorę obrazującą i przenosimy ją do mikroskopu konfokalnego w celu rozpoczęcia obrazowania. Teraz umieszczamy komorę obrazującą z zamocowanymi larwami na górze naszego mikroskopu konfokalnego.Z komory obrazującej wychodzą trzy rurki. Jedna jest podłączona do środka znieczulającego, difluorynu. Druga to rurka odpływowa, a trzecia umożliwia dopływ świeżego powietrza do larw.Po podłączeniu komory dla larw do urządzenia do znieczulania należy upewnić się, że larwa jest prawidłowo ustawiona. Następnie Yao dopuszcza powietrze do systemu znieczulającego za pomocą pompy. W tym momencie ważne jest, aby upewnić się, że ciśnienie w komorze nie przekracza wartości maksymalnej zalecanej.Następnie wprowadza rurkę wylotową do wody, aby upewnić się, że występuje przepływ powietrza. Pęcherzyki powietrza w butelce z wodą świadczą o tym przepływie. Teraz powoli otwiera zawór, pozwalając na krótki przepływ fluoru przez rurki.Po wstępnym znieczuleniu ważne jest sprawdzenie reakcji larwy. Jeśli serce nadal bije, konieczne jest zastosowanie dodatkowej dawki środka znieczulającego, co można zaobserwować. W następnej sekcji pokażemy larwę pod mikroskopem.Teraz możemy obserwować kluczową część procesu znieczulania pod mikroskopem. Początkowo widoczne są ruchy larw, a ich mięśnie nadal się kurczą. Gdy ruchy zaczynają zwalniać, należy przeskanować wzrokiem larwy w górę i w dół, obserwując zachodzący proces znieczulenia.Ruchy spowalniają i w końcu ustają. Po przyłożeniu wielu impulsów znieczulających widać, że lawa przestała się poruszać, a jedyne zauważalne ruchy wynikają ze zmian w ustawieniach mikroskopu. Aby określić stopień znieczulenia, ważne jest sprawdzenie tętna.He yao skupia ostrość głęboko w lawie, gdzie widoczne jest głównie ciało tłuszczowe. Co istotne, widoczny jest obszar wokół serca i ewidentne jest, że akcja serca została zatrzymana, a zatem larwa jest gotowa do obrazowania. Jednym z głównych problemów w obrazowaniu in vivo jest identyfikacja interesującego nas złącza nerwowo-mięśniowego.Aby w tym pomóc, pokażemy, jak wygląda obraz podczas skanowania larw. Następnie można zobaczyć złącze nerwowo-mięśniowe, które zazwyczaj wykorzystujemy do obrazowania. Teraz zaczynamy powoli ustawiać ostrość na larwach.Zaczynając od powierzchni kutykuli, można zauważyć pojawiające się i znikające mięśnie. Niektóre z nich są wyróżnione. Film przedstawia sztuczny konstrukt fuzyjny zawierający domenę transbłonową CD8, GFP oraz region C-końcowy białka kanału żelazowego Shaker.Konstrukt ten lokalizuje się we wszystkich błonach mięśniowych i wykazuje zwiększoną obecność w złączu nerwowo-mięśniowym. Teraz odtworzymy film w zwolnionym tempie, a z pomocą rysunków dwa i trzy będą Państwo mogli zidentyfikować poszczególne mięśnie w momencie ich pojawiania się i znikania. Choć muchy te są szczególnie przydatne do nauki obrazowania in vivo, zazwyczaj stosujemy larwy wykazujące markery znakujące wyłącznie obszary postsynaptyczne lub presynaptyczne synapsy.Ponieważ nie zaznaczają one całej powierzchni mięśnia, znacznie trudniej jest zidentyfikować tę samą pozycję u larw. W tym filmie pokazujemy receptory glutaminianowe znakowane RFP. Film przedstawia powiększenie etykiety, na której wyróżniliśmy poszczególne złącza nerwowo-mięśniowe.Ponownie wyświetlimy film w wolniejszym tempie, a Państwo będą mogli zidentyfikować poszczególne złącza nerwowo-mięśniowe, korzystając z ryciny cztery. Teraz, gdy omówiliśmy teorię, przejdziemy do demonstracji przykładu praktycznego.Skupimy się teraz na złączu nerwowo-mięśniowym 27 w naszych larwach wykazujących ekspresję MHC CD eight GFP. Po zwiększeniu cyfrowego przybliżenia ponownie ustawiamy złącze nerwowo-mięśniowe, a następnie przemieszczamy się w kierunku C do regionu centralnego, aby upewnić się, że larwa jest odpowiednio ustawiona i że nie występują żadne prześwietlone lub nasycone piksele. Prześwietlone piksele są widoczne na czerwono, natomiast piksele nienasycone są wyświetlane w kolorze niebieskim.Zmniejszamy moc lasera i ponownie skanujemy. Osiągnęliśmy teraz odpowiednią wzmocnienie i siłę lasera, dzięki czemu nie występują już żadne regiony przesycone. W tym momencie ważne jest zaznaczenie pozycji złącza nerwowo-mięśniowego w kierunku C.W pierwszej kolejności zaznaczamy dolną pozycję skanowania, a następnie górną pozycję skanowania, aby umożliwić dokładną rejestrację całego stosu CST. Zazwyczaj stosujemy rozmiar piksela 100 nanometrów na 100 nanometrów, a odległość w osi C wynosi 500 nanometrów. Jeśli nie planujemy przeprowadzenia dekonwolucji po obrazowaniu w celu przetworzenia zdjęć, wzmocnienia ustawia się na odpowiednim poziomie, aby zapobiec szumom, a jednocześnie umożliwić zastosowanie słabszej mocy lasera w celu zminimalizowania blaknięcia po zakończeniu rejestracji stosu CST.Złącze nerwowo-mięśniowe wykazujące konstrukt shaker GFP M-H-C-C-D-H zostało prawidłowo zarejestrowane. W następnej sekcji przeprowadzimy podobny proces, skupiając się na receptorach glutaminianu. Aby zarejestrować receptory glutaminianu z tagiem RFP, ponownie ustawiamy ostrość przez kutykulę, co pozwala teraz zobaczyć poszczególne złącza nerwowo-mięśniowe w segmencie A3.Po powiększeniu prawego złącza nerwowo-mięśniowego ponownie ustawiamy je w centrum pola widzenia. Podobnie jak poprzednio, musimy upewnić się, że nie występują żadne prześwietlone lub nasycone piksele. Ponownie staje się oczywiste, że niektóre piksele są przesycone, dlatego dostosowujemy ustawienia i wykonujemy kolejny skan próbny.Wzmocnienie mocy lasera zostało teraz odpowiednio dostrojone. Ważne jest teraz ustawienie limitów stosu CST poprzez zidentyfikowanie i zweryfikowanie pozycji górnej, a następnie pozycji dolnej. Możemy teraz rozpocząć skanowanie poszczególnych płaszczyzn złącza nerwowo-mięśniowego.Ważne jest wykonanie kilku skanów pustych obszarów przekrojów bezpośrednio poniżej i powyżej złącza nerwowo-mięśniowego, aby uniknąć pominięcia synaps znajdujących się w tych miejscach. Po zakończeniu skanowania konfokalnego zrzutujemy obraz złącza nerwowo-mięśniowego, aby zobaczyć typowy wynik uzyskany w obrazowaniu in vivo. Należy zachować ten obraz do porównania ze skanami wykonanymi w późniejszych punktach czasowych, co pozwoli na ponowną identyfikację złącza nerwowo-mięśniowego oraz rozpoznanie zmian, takich jak nowe synapsy lub batony synaptyczne.Po pomyślnym wykonaniu obrazowania ważne jest, aby szybko wybudzić larwę i niezwłocznie usunąć ją z komory obrazowania. Yao wykonuje tę czynność, stale monitorując larwę i regulując urządzenie do znieczulenia tak, aby przez system krążyło świeże powietrze, a nie tylko fluor.Następnie umieszcza wylot komory w wodzie, a pęcherzyki powietrza potwierdzają, że powietrze przepływa przez system. Ciągle monitoruje larwy, aby upewnić się, że ich serca znów zaczynają bić i że larwy się budzą. Podobnie jak w procesie znieczulania, najlepiej jest dostarczać larwom powietrze w wielu impulsach, aby zapewnić skuteczne wybudzenie.Możemy teraz zobaczyć, co robi badacz, patrząc przez mikroskop. Widzimy, jak wprowadza powietrze do układu. W komorze powstają zmiany ciśnienia, które wywołują sztuczne ruchy u larw.W pewnym momencie larwa zaczyna poruszać się samodzielnie, co najlepiej objawia się poprzez rozpoczęcie ruchów serca, dlatego przybliżamy obraz do larwy, aby móc wyraźniej zaobserwować te ruchy. Rytmiczne uderzenia świadczą o pomyślnym wybudzeniu larwy. Po skutecznym wybudzeniu larwy ważne jest jej wyjęcie z komory obrazowania.Larwy znajdują się w dolnej części komory, dlatego górna część została przesunięta na bok. Yara usuwa metalowy obciążnik oraz plastikową pokrywę. Następnie wyjmowana jest szkiełko nakrywka, a w dalszej kolejności plastikowy dystanser wraz z larwami.Za pomocą pędzla ostrożnie usuwa larwy z plastikowego dystansera. Następnie krótko zanurza go w wodzie i osusza, aby usunąć nadmiar oleju. Larwa zostaje teraz umieszczona w wcześniej rozdrobnionym pokarmie i pozostawiona tam do czasu ponownego użycia.

in-vivo-imaging-of-intact-drosophila-larvae-at-sub-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vivo Obrazowanie całych larw Drosophila w rozdzielczości subkomórkowej

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Poznaj metodę obrazowania in vivo nienaruszonych larw Drosophila melanogaster z użyciem desfluranu. Protokół umożliwia uzyskanie obrazów subkomórkowych zachowań synaptycznych przy 95% przeżywalności.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Przeglądaj więcej filmów