Name: Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc od nowonarodzonych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek śródbłonka płuc od nowonarodzonych myszy przy użyciu przeciwciał sprzężonych z kulkami magnetycznymi. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości kultur mikronaczyniowych komórek endotelialnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badanie to było częściowo finansowane z grantu American Heart Association nr 0950118G przyznanego M.C-W.

1. Przygotowanie magnetycznych kulek (Dynabeads) sprzężonych z przeciwciałem anty-PECAM-1
<ol>
<li>Przygotować 0,1% BSA w PBS, mieszając 50 mg BSA w 50 ml PBS za pomocą wortexa do całkowitego rozpuszczenia BSA. Sterylizować poprzez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza przenieść 200 μl dobrze resuspendowanych kulek Dynabeads z przeciwciałami owczymi anty-rat IgG do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml i wyprać kulki: Umieścić probówkę na MPC i pozostawić na około 1 min, aby kulki mogły osadzić się na dnie. Odessać nadsącz, zdjąć probówkę z MPC i resuspender kulki w 1 ml sterylnego 0,1% BSA/PBS. Resuspender kulki, pipetując ciecz w górę i w dół.</li>
<li>Powtórzyć płukanie jeszcze trzy razy, tak aby łącznie wykonać cztery płukania.</li>
<li>Zdjąć probówkę z MPC i resuspender kulki w 500 μl 0,1% BSA/PBS.</li>
<li>Do probówki dodać 10 μl przeciwciał szczurzych anty-mysich PECAM-1 (CD-31).</li>
<li>Inkubować w rotatorze przez noc w temperaturze 4°C w chłodni lub przez 2 h w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Wyprać kulki sterylnym 0,1% BSA/PBS cztery razy, zgodnie z opisem w punkcie 1.2.</li>
<li>Zdjąć probówkę z MPC i resuspender kulki w 200 μl 0,1% BSA/PBS. Przechowywać kulki Dynabeads sprzężone z przeciwciałami anty-PECAM-1 w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.</li>
</ol>
2. Izolowanie komórek śródbłonka płuc myszy z myszy noworodkowych
Przed przystąpieniem do protokołu oczyszczania tkanek wymagana jest zgoda Komisji IACUC na przeprowadzenie procedury.
<ol>
<li>Przygotuj następujące elementy:
<ul>
<li>15 ml roztworu C/D o stężeniu 1 mg/ml w DMEM. Przefiltrować za pomocą 0.22 μm przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego i ogrzać do 37°C.</li>
<li>probówka stożkowa 50 ml z 15 ml DMEM, przechowywać w lodzie</li>
<li>Pożywka do izolacji (IM) zawierająca 20% FBS i 1x penicylinę/streptomycynę w DMEM</li>
<li>2% żelatyna. Wymieszać 2 g żelatyny z skóry bydlęcej ze 100 ml wody dd, autoklawować przez 15 minut i przechowywać w 4°CPodgrzać do 37°C do upłynnienia przed powlekaniem kolb TC.</li>
</ul>
</li>
<li>Zanurzyć trzy szczenięta w wieku 6–8 dni w znieczuleniu, podając dożylnie (IP) ketaminę (100 mg/kg) i ksylazynę (10 mg/kg). Sprawdzić skuteczność znieczulenia, a następnie przeprowadzić sekcję zwierząt pojedynczo w następujący sposób: przytwierdzić szczenięta do podkładki, nasączyć skórę 70% etanolem i usunąć skórę z okolic klatki piersiowej za pomocą sterylnych nożyczek do sekcji. Wyciąć klatkę piersiową, aby odsłonić płuca. </li>
<li>Aseptycznie wycinamy poszczególne płaty płuc, uważając, aby nie przeciąć oskrzeli ani widocznej tkanki łącznej wokół płuc. Wszystkie płuca umieszczamy w schłodzonym w lodzie medium DMEM. Uśmiercamy szczenięta.</li>
<li>Pracując w dygestorium do hodowli tkankowych, wyjąć płaty płuc z medium DMEM, umieścić je w 100 mm szalce hodowlanej i odessać nadmiar medium DMEM.</li>
<li>Za pomocą sterylnych nożyczek drobno posiekaj tkankę, wykonując około 100 cięć. Przenieś ją do 15 ml podgrzanego roztworu C/D w celu trawienia enzymatycznego. Inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37°C na rotatorze.</li>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza odessać zawiesinę trawionej tkanki do strzykawki 20 ml z założoną kaniulą 14 G i poprzez co najmniej 12-krotne przeciskanie rozbić skupki komórek do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
<li>Przepuść zawiesinę tkankową przez 70 μm sitko do komórek, a następnie wypłukać sitko 15 ml IM w celu zatrzymania trawienia.</li>
<li>Zwiruj zawiesinę komórek z prędkością 400x g przez 5 minut w celu uzyskania osadu.</li>
<li>Odssać nadosad i zawiesić osad w 3 ml 0,1% BSA/PBS.</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową do polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml i dodać 22.5 μl kuleczki Dynabeads sprzężone z przeciwciałem anty-PECAM-1. Inkubować w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 12 minut.</li>
<li>Powlec kolbę T75 2 ml 2% żelatyny, a następnie odessać nadmiar żelatyny. Pozostawić żelatynę do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez około 30 minut przed wysianiem komórek.</li>
<li>Po zakończeniu inkubacji z kuleczkami (krok 2.10), podziel zawiesinę komórkową w równych częściach do trzech probówek Eppendorf i zamontuj na MPC.</li>
<li>Po osadzeniu kulek za pomocą MPC (ok. 1 min), należy zebrać nadsącz, wyjąć probówkę z MPC, przemyć kulki ok. 1 ml 0,1% BSA/PBS, a następnie ponownie umieścić ją w MPC. </li>
<li>Powtórzyć płukanie cztery razy (łącznie 5 płukań)</li>
<li>Resuspender kuleczki w 1 ml medium VascuLife z zestawem EnGS-Mv Life Factors Kit oraz 1x penicyliną/streptomycyną (VL) na probówkę, dokładnie mieszając.</li>
<li>Wysiać komórki na uprzednio powleczoną kolbę T75 i uzupełnić całkowitą objętość w każdej kolbie do 10 ml za pomocą VL.</li>
<li>Następnego dnia należy wymienić medium, pozostawić komórki do wzrostu na jedną pełną dobę, a następnie wymieniać połowę medium co drugi dzień. Gdy komórki są &gt;Gdy osiągną konfluencję na poziomie 70–80% lub więcej (zazwyczaj po 3–4 dniach hodowli), można je wyselekcjonować za pomocą kulek Dynabeads z przeciwciałem anty-ICAM-2.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kulek Dynabeads sprzężonych z przeciwciałem anty-ICAM-2
<ol>
<li>Kule Dynabeads sprzężone z przeciwciałem anty-ICAM-2 są wykorzystywane do dalszej puryfikacji komórek, które zostały wyselekcjonowane za pomocą kulek Dynabeads sprzężonych z przeciwciałem anty-PECAM-1 i hodowane do momentu osiągnięcia konfluencji. Procedurę tę przeprowadza się zgodnie z opisem dla kulek Dynabeads sprzężonych z przeciwciałem anty-PECAM-1 (punkt 1 powyżej), z zastąpieniem przeciwciała anty-PECAM-1 przeciwciałem anty-mysim ICAM-2 (CD-102).</li>
<li>Kule Dynabeads sprzężone z przeciwciałem anty-ICAM-2 mogą być przechowywane w temperaturze 4°C przez maksymalnie 1 miesiąc.</li>
</ol>
4. Sortowanie komórek śródbłonka płuc myszy za pomocą kulek Dynabeads z przeciwciałem anty-ICAM-2
<ol>
<li>Pokryć kolbę do hodowli tkankowej T75 2% żelatyną.</li>
<li>Odssać medium z konfluentnej kolby T75 z komórkami i przemyć 8 ml PBS.</li>
<li>Odssać PBS, dodać 2 ml 0,05% Trypsyny/EDTA i pozostawić do odklejenia się komórek (około 5 minut). Delikatnie opukać kolby, aby ułatwić odklejanie.</li>
<li>Po odklejeniu się komórek dodać 2 ml IM, aby zahamować działanie trypsyny, i zeskrobać pozostałe przylegające komórki. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 15 ml i wirować przez 5 min przy 400x g.</li>
<li>Odssać medium i resuspendować osad komórkowy w 2 ml 0,1% BSA/PBS.</li>
<li>Przenieść do 5 ml polistyrenowej probówki o okrągłym dnie i dodać 10 μl kulek Dynabeads anti-ICAM-2. Mieszać w rotatorze przez 12 minut w RT.</li>
<li>Rozdzielić zawiesinę komórkową do dwóch probówek Eppendorf 1,5 ml i zamocować w MPC.</li>
<li>Odssać nadsącz po jednej minucie od przywierania kulek. Zdjąć probówki z MPC i resuspendować zawartość każdej probówki w 1 ml 0,1% BSA/PBS. Ponownie zamocować w MPC.</li>
<li>Powtórzyć płukanie czterokrotnie (łącznie 5 płukań).</li>
<li>Resuspendować zawartość każdej probówki w 1 ml VL i przeprowadzić zliczenie komórek.</li>
<li>Wysiać komórki w zagęszczeniu 250-350K komórek na kolbę T25 i/lub 750K-1 milion komórek na kolbę T75.</li>
<li>Uzupełnić objętość do 5 ml VL w kolbach T25 oraz do 10 ml w kolbach T75.</li>
<li>Wymieniać medium co drugi dzień. Komórki można wykorzystać do eksperymentów, gdy hodowla osiągnie około 80% konfluencji, zazwyczaj w ciągu 2-3 dni.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Zazwyczaj po 6-7 dniach od wstępnego przygotowania komórek jesteśmy w stanie uzyskać około 1,2 - 1,5 x 106 komórek śródbłonka płuc z trzech 6-8 dniowych szczeniąt. W badaniu pod mikroskopem świetlnym komórki wykazują typową morfologię „brukową” oraz barwienie VE-cadherin (CD144) w połączeniach międzykomórkowych, co jest charakterystyczne dla komórek śródbłonka (Rysunek 1). Większość MLEC wykazuje ekspresję VE-cadherin i VEGFR2, co zostało wykazane w analizie FACS (Rysunek 2). Zazwyczaj wykorzystujemy je do eksperymentów w ciągu dwóch tygodni od wstępnej izolacji MLEC.
<img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="Mysie komórki śródbłonka płuc; obraz mikroskopowy; wizualizacja hodowli komórkowej; analiza fluorescencyjna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Analiza mikroskopowa konfluentnej warstwy MLEC. (A) Obraz z mikroskopii świetlnej pokazuje morfologię brukową hodowanych komórek, typową dla komórek śródbłonka. Jednorodne, okrągłe struktury zlokalizowane w obszarze okojądrowym wielu komórek to kulki magnetyczne użyte do izolacji MLEC. (B) Specyficzna dla śródbłonka VE-cadherin jest zlokalizowana w połączeniach międzykomórkowych, co pokazano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Pasek skali odpowiada 20μm.
<img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="Schemat analizy FACS ekspresji VE-kadheryny, VEGFR2 z użyciem IgG, marker EC; wyniki cytometrii przepływowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Analiza FACS hodowanych MLEC znakowanych przeciwciałami specyficznymi dla markerów śródbłonkowych: VE-kadheryny (CD144) lub VEGFR2, zgodnie z oznaczeniem, a następnie przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fykoerytryną, potwierdza tożsamość śródbłonkową wyizolowanych MLEC. Linia czerwona oznacza kontrolę specyficzną dla izotypu, linia zielona oznacza IgG specyficzne dla anty-VE-kadheryny lub anty-VEGFR2.

<ol><li>Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+endothelial+cell+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk.+Anat%22%5BJournal%5D)">The human endothelial cell in tissue culture.</a> Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).</li>
<li>Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circ Res. 100, 158-173 (2007).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).</li>
<li>Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).</li>
<li>Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+brain%2C+lung%2C+and+kidney%3A+expression+of+the+multidrug+resistance+P-glycoprotein+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).</li>
<li>Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+murine+inguinal+and+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues.</a> J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).</li>
<li>Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+vascular+endothelial+cadherin+%287B4%2Fcadherin-5%29%2C+an+endothelium-specific+cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).</li>
<li>Zachary, I., Gliki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+transduction+mechanisms+mediating+biological+actions+of+the+vascular+endothelial+growth+factor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family.</a> Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).</li>
<li>Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+heart-derived+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures%3A+isolation%2C+cloning+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization.</a> Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).</li>
<li>Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+angiogenesis%2C+endothelial+migration%2C+proliferation%2C+and+MAPK+signaling+in+Rap1b-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice.</a> Blood. 111, 2647-2656 (2008).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez komitet IACUC Medical College of Wisconsin w ramach protokołu AUA#00001206.

Komórki śródbłonka (EC) mikronaczyniowe okazały się użytecznym modelem w wielu obszarach biologii naczyniowej i uważa się, że są bardziej istotne fizjologicznie do badań (np. angiogenezy) niż szeroko badane HUVEC 3. Wcześniej zgłaszano, że EC mikronaczyniowe można uzyskać z nerek, serca, skóry, siatkówki, mózgu, glejaków, tkanki tłuszczowej, a także z płuc 2, 4-7, 10, 11. Niemniej jednak wciąż istnieje potrzeba opracowania spójnej i niezawodnej metody izolacji EC mikronaczyniowych. Procedura przedstawiona w niniejszym materiale jest modyfikacją wcześniej opublikowanego protokołu 2; różni się ona od większości publikowanych procedur tym, że wykorzystuje szczenięta/myszy nowonarodzone zamiast zwierząt dorosłych. Jest to kluczowe dla sukcesu izolacji, ponieważ komórki od młodych zwierząt mają wyższy potencjał proliferacyjny, a kultury pochodzące z ich tkanek mają tendencję do uzyskiwania większej liczby komórek. Zwierzęta w wieku jednego tygodnia wydają się być optymalne, ale można również użyć młodszych myszy (4-dniowych). W razie potrzeby można również użyć większej lub mniejszej liczby młodych zwierząt, ponieważ z sukcesem izolowaliśmy MLEC z jednego osobnika. Jednak podczas skalowania procesu izolacji w górę lub w dół, gęstość wysiewu komórek musi pozostać niezmieniona, ponieważ jest to również krytyczne dla proliferacji komórek. Dwustopniowy proces oczyszczania MLEC przy użyciu kulek magnetycznych koniugowanych najpierw z przeciwciałami anty-PECAM-1, a następnie anty-ICAM-2, jest znacznie bardziej wydajny w uzyskiwaniu czystych kultur EC niż wcześniej opisane jednostopniowe procedury oczyszczania. Protokół ten eliminuje potrzebę stosowania bardzo żmudnych technik manualnych, wirowania gradientowego i mniej wydajnego sortowania FACS w celu usunięcia komórek zanieczyszczających, takich jak fibroblasty, komórki krwi i komórki mięśni gładkich. Uzyskana populacja MLEC może być wykorzystana do analiz in vitro odpowiedzi angiogennych, przepuszczalności naczyniowej i transmigracji leukocytów, gojenia ran, a także do analizy biochemicznej szlaków sygnalizacyjnych. W razie potrzeby MLEC można wysiać na różnych powierzchniach, takich jak szkiełka nakrywkowe powlekane fibronektyną lub żelatyną do immunofluorescencji, lub na macierzach elektrod do pomiarów oporu transendotelialnego (TER). Uzyskane wyniki można bezpośrednio porównać z fenotypami obserwowanymi in vivo, co jest szczególnie istotne w kontekście rosnącej liczby linii myszy z knockoutem i myszy transgenicznych. Pomyślne wdrożenie tej metody do analiz in vitro mechanizmów komórkowych leżących u podstaw defektów obserwowanych in vivo zostało już zaprezentowane 12.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki chirurgiczne typu Spring</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>pinceta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>kaniula 14G</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 20 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>anty-szczurze IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny koncentrator cząsteczek (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie PECAM-1 (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie ICAM-2 (CD-102) </td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaza/Dyspaza (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>roztwór stokowy 100mg/ml można przygotować i przechowywać w temperaturze -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>kompletny zestaw Vasculife EnGS-Mv (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna/EDTA </td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 70 &amp;mu;m nylon</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>flaska do hodowli tkankowej 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Komórki śródbłonka stanowią użyteczny model badawczy w wielu obszarach biologii naczyniowej. Od czasu ich pierwszej izolacji 1, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs) okazały się wygodne, łatwe do pozyskania i hodowli, przez co są najszerzej badanymi komórkami śródbłonka. Jednakże w badaniach koncentrujących się na procesach takich jak angiogeneza, przepuszczalność czy wielu innych, znacznie bardziej istotnym fizjologicznie modelem do badań są komórki śródbłonka (ECs) mikrokrążenia 2. Co więcej, ECs izolowane z myszy z nokautem genowym stanowią przydatne narzędzie do analizy funkcji białek ex vivo. Do tej pory opisano kilka podejść do izolacji i hodowli mikrokrążeniowych ECs różnego pochodzenia 3-7, ale spójna izolacja i hodowla czystych ECs wciąż stanowi główny problem techniczny w wielu laboratoriach. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół krok po kroku opisujący niezawodną i stosunkowo prostą metodę izolacji i hodowli komórek śródbłonka płuc myszy (MLECs). W tym podejściu tkankę płucną pobraną od szczeniąt w wieku od 6 do 8 dni jest najpierw cięta na kawałki, trawiona roztworem kolagenazy/dispazy (C/D) i rozbijana mechanicznie do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. MLECs są oczyszczane z zawiesiny komórkowej za pomocą selekcji pozytywnej z użyciem przeciwciała anty-PECAM-1 sprzężonego z Dynabeads przy wykorzystaniu koncentratora cząstek magnetycznych (MPC). Tak oczyszczone komórki hoduje się na szalkach hodowlanych (TC) powlekanych żelatyną do momentu osiągnięcia konfluencji. W tym punkcie komórki są dodatkowo oczyszczane przy użyciu Dynabeads sprzężonych z przeciwciałem anty-ICAM-2. MLECs uzyskane za pomocą tego protokołu wykazują fenotyp „brukowca” (cobblestone), co jest widoczne w mikroskopii świetlnej w kontraście fazowym, a ich fenotyp śródbłonkowy został potwierdzony za pomocą analizy FACS z przeciwciałami anty-VE-cadherin 8 i anty-VEGFR2 9 oraz barwienia immunofluorescencyjnego VE-cadherin. W naszych badaniach ta dwuetapowa procedura izolacji w sposób spójny i niezawodny pozwala uzyskać czystą populację MLECs, które można następnie hodować. Metoda ta umożliwi badaczom wykorzystanie rosnącej liczby myszy z nokautem genowym i myszy transgenicznych do bezpośredniego korelowania badań in vivo z wynikami eksperymentów in vitro przeprowadzonych na izolowanych MLECs, co pomoże w odkryciu mechanizmów molekularnych fenotypów naczyniowych obserwowanych in vivo.

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Komórki śródbłonka stanowią użyteczny model badawczy w wielu obszarach biologii naczyniowej. Od czasu pierwszej izolacji 1, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc od noworodków myszy. Osiąga się to poprzez stworzenie jednorodnej zawiesiny komórkowej z nowo pobranych płuc. Następnie tkankę rozdrabnia się i poddaje trawieniu enzymatycznemu, a następnie wzbogaca w komórki śródbłonka przy użyciu magnetycznych kuleczek sprzężonych z przeciwciałem przeciwko CD31.Kultura CETA oczyszcza populację komórek śródbłonka. Następnie, przy użyciu kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałem anty-CD31, komórki te są namnażane w kolbie pokrytej żelatyną. Otrzymane pierwotne komórki śródbłonka płuc pochodzą głównie z naczyń mikrokrążenia i wykazują ekspresję specyficznych markerów komórek śródbłonka, takich jak CD31 i VEGFR2.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wyciszanie genów za pomocą irna, jest możliwość wykorzystania myszy transgenicznych do pozyskania genetycznie zmodyfikowanych komórek śródbłonka. Co więcej, komórki śródbłonka uzyskane tą metodą pochodzą głównie z naczyń mikrokrążenia, a zatem mogą być bardziej istotne w niektórych obszarach badań naczyniowych. Komórki śródbłonka pozyskane tą metodą mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii naczyniowej, takie jak te dotyczące molekularnych mechanizmów angiogenezy i przepuszczalności naczyniowej.Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ etapy trawienia pobranej tkanki oraz przemywania komórek związanych z kuleczkami są trudne do opanowania. Nieprawidłowe wykonanie tej procedury może prowadzić do zanieczyszczenia komórkami nieendotelialnymi oraz niskiej wydajności i słabego wzrostu komórek. W przypadku tego protokołu z użyciem dyna beads należy przygotować 50 milliliters 0,1%BSA w PBS i mieszać w wirówce aż do rozpuszczenia BSA, a następnie wysterylizować roztwór, przepuszczając go przez strzykawkę z filtrem 0,22 micron.W warunkach sterylnych, w komorze do hodowli tkanek, resuspenduj DynaBeads przeciwko IgG szczura z owczymi przeciwciałami, a następnie przenieś 200 µL do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml. W celu wypłukania kulek, umieść probówkę w magnetycznym koncentratorze cząstek (MPC) i odczekaj jedną minutę do osadzenia się kulek, po czym odessaj nadsącz. Wyjmij probówkę z MPC i resuspenduj kulki w 1 ml sterylnego 0,1% B-S-A-P-B-S.Powtórz to płukanie jeszcze trzy razy po czwartym płukaniu. Wyjmij probówkę z MPC i Resus. Resuspenduj kulki w 500 µL 0,1% B-S-A-P-B-S.Do probówki należy dodać 10 µL przeciwciała szczurzego przeciwko mysiej PCAM-1 i inkubować w urządzeniu do mieszania obrotowego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, zgodnie z wcześniejszym opisem. Kuleczki należy przemyć czterokrotnie sterylnym 0,1% BSA w PBS. Należy wyjąć probówkę z urządzenia MPC i resuspender osad.Kuleczki w 200 µL 0,1% B-S-A-P-B-S przechowywać. Tę preparację przeciwciał anty-P chem one sprzężonych z dyna beads przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać komórki pierwotne, znieczulić trzy szczenięta w wieku od sześciu do ośmiu dni.Aby upewnić się, że znieczulenie jest skuteczne, należy uszczysknąć ogony pęsetą. Zwierzęta należy sekcjonować sekwencyjnie. Najpierw przypnij szczenię do podkładki i usuń skórę z okolicy klatki piersiowej.Za pomocą nożyczek anatomicznych wyciąć klatkę piersiową, aby odsłonić płuca. Następnie w warunkach aseptycznych wyciąć poszczególne płaty płuc. Należy uważać, aby nie przeciąć oskrzeli ani widocznej tkanki łącznej otaczającej płuca.Połączyć wszystkie płuca w lodowatym medium DMEM, a następnie uśmiercić szczenięta. Przenieść się teraz do komory z laminarnym przepływem powietrza. Wyjąć płaty płuc z DMEM i umieścić je w 100 milimetrowej szalce hodowlanej.Odssać nadmiar DMEM i posiekać tkankę sterylnymi nożyczkami. Na koniec wykonać około stu cięć w celu przygotowania do trawienia enzymatycznego. Przenieść przygotowaną tkankę do 15 ml ciepłego roztworu kolagenazy i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37°C na rotatorze, używając strzykawki 20 ml połączonej z kaniulą 14G, aby rozbić grudki strawionej tkanki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.Następnie należy przepuścić zawiesinę komórkową przez sito komórkowe o oczkach 70 µm i przemyć sito 15 ml Im w celu zatrzymania reakcji trawienia. Aby zebrać komórki płucne, odwiruj zawiesinę przy 400 ×g przez pięć minut i odessij nadsącz. Następnie zawiesić osad komórkowy w 3 ml 0,1% B-S-A-P-B-S i przenieść do 5 ml polistyrenowej probówki z okrągłym dnem.Aby wyizolować komórki śródbłonka, dodać 22,5 µL przeciwciał anty-P chem one sprzężonych z dyna-beads i inkubować w rotacji w temperaturze pokojowej przez 12 minut. W międzyczasie pokryć kolbę T 75 dwiema ml 2% żelatyny. Odessać nadmiar roztworu żelatyny i pozostawić do wyschnięcia wewnątrz komory do hodowli tkanek przez około pół godziny. Po zakończeniu inkubacji z kuleczkami, podzielić zawiesinę komórkową w równych częściach do trzech probówek typu fendor i zamocować na MPC.Używając systemu MPC, przemyj kulek dynabeads pięciokrotnie około jednym mililitrem 0,1% B-S-A-P-B-S. Po ostatnim przemyciu zawieś kuleczki ponownie w jednym mililitrze pożywki VAs life na probówkę. Wymieszaj dokładnie, łącząc zawartość wszystkich probówek. Wysej przygotowany preparat komórek na kuleczkach dynabeads do wcześniej zakodowanej kolby T 75 i uzupełnij całkowitą objętość w kolbie do 10 mililitrów za pomocą pożywki VAs life.Następnie umieść kolby w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 °C. Wymień pożywkę następnego dnia, pozwól komórkom rosnąć przez jeden pełny dzień, a następnie wymieniaj połowę pożywki co drugi dzień, aż komórki osiągną konfluencję powyżej 70-80%. Aby dodatkowo oczyścić pierwotną kulturę komórek, przygotuj kuleczki dyna sprzężone z przeciwciałem, zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami, ale tym razem stosując przeciwciała CD 1 0 2 oraz muse I chem two.Należy również pokryć kolbę do hodowli tkanek T 75 2% żelatyną, zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie należy wyjąć z inkubatora kolbę T 75 z komórkami. Odessać medium i przemyć komórki pierwotne ośmioma mililitrami PBS.Do PBS dodaj 2 mL 0,05% trypsyny EDTA i odczekaj około pięciu minut, aż komórki się odłączą. Delikatnie ostukaj kolbę, aby wspomóc odłączanie komórek. Dodaj 2 mL pożywki kompletnej (IM), aby zahamować działanie trypsyny, a następnie zeskrob pozostałe przylegające komórki.Przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml. Odwirowuj komórki przez pięć minut przy 400 ×g, odessij medium i resuspenduj osad komórkowy w dwóch ml 0,1% BSA w PBS. Przenieś zawiesinę do polistyrenowej probówki z okrągłym dnem o pojemności 5 ml i dodaj 10 µL kuleczek Dynabeads anty-ICAM-2. Mieszaj w rotatorze przez 12 minut w temperaturze pokojowej, rozdziel zawiesinę komórkową do dwóch probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml i zamontuj w systemie MPC.Podobnie jak poprzednio, przemyj kuleczki 1 mL 0,1% B-S-A-P-B-S-A łącznie pięć razy. Następnie resuspenduj zawartość każdej probówki w 1 mL VAs life i wykonaj zliczenie komórek. Na koniec wysiej komórki w zagęszczeniu od 800 do 1000 K komórek na kolbę T 75 w 10 mL VAs life. Umieść kolby w inkubatorze do hodowli komórkowej.Wymieniaj pożywkę co drugi dzień, aż hodowle osiągną około 80% konfluencji. Oczyszczone komórki śródbłonka płuc myszy są gotowe do wykorzystania w eksperymentach. Zazwyczaj preparat komórkowy z trzech szczeniąt w wieku od sześciu do ośmiu dni daje od 1,2 do 1,5 × 10⁶ komórek śródbłonka płuc po tygodniu hodowli.Zgodnie z oczekiwaniami, te pierwotne komórki śródbłonka wykazują morfologię brukową w mikroskopii świetlnej, a także spójne barwienie VE w połączeniach międzykomórkowych. Z zastosowaniem niniejszego protokołu większość komórek śródbłonka płuc myszy wykazuje ekspresję VE oraz VEGF R dwa, co zostało wykazane w analizie FACS. Linia czerwona oznacza swoistą kontrolę izotypową, a linia zielona specyficzne IgG przeciwko VE lub przeciwko VEGF R dwa.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pobrać wyłącznie docelową tkankę, unikać nadmiernej digestii komórek oraz dokładnie przemyć komórki związane z kuleczkami. Uzyskano komórki śródbłonka. Metoda ta może być wykorzystana w testach funkcjonalnych z zakresu biologii naczyniowej do analizy odpowiedzi istotnych dla angiogenezy i przepuszczalności naczyniowej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat izolacji pierwotnych komórek śródbłonka mysiego z wykorzystaniem przeciwciał chem one oraz chem two związanych z dyna beeps, a także wiedzieć, jak uzyskać czyste hodowle komórek śródbłonka.

isolation-culture-pulmonary-endothelial-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płucnego z myszy noworodków

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Opracowaliśmy nowatorską i powtarzalną technikę izolowania pierwotnych kultur komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej (PASMC) od myszy w wieku P7, umożliwiając tym samym lepsze badanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w skurcz i rozluźnienie komórek mięśni gładkich noworodków.

Izolacja komórek mięśni gładkich tętnicy płucnej od nowonarodzonych myszy

Ten film demonstruje łatwą i niezawodną strategię przygotowania czystych kultur komórek śródbłonka z embrionalnej przodomózgowia w ciągu 10-12 dni i będzie przydatny do badań skoncentrowanych na wielu aspektach angiogenezy mózgowej.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Ten protokół jest przygotowany, aby podzielić się naszą metodą izolowania komórek śródbłonka naczyń wieńcowych myszy w celu obrazowania lub przeprowadzania eksperymentów z biologii molekularnej.

Izolacja mysich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych

W tym artykule, pierwotne komórki śródbłonka płuc zostały wyizolowane i wyhodowane od nowonarodzonych myszy.

Izolacja pierwotnych komórek śródbłonka płuc myszy

Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc

Protokół ten przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej, która izoluje żywotne komórki nabłonkowe typu II (AECII) z płuc noworodków, młodocień lub dorosłych myszy (zakażonych lub niezakażonych). Takie podejście umożliwia późniejszym badaniam molekularnym i/lub funkcjonalnym AECII identyfikację ich roli podczas zapalenia i infekcji płuc.

Izolacja komórek nabłonkowych typu II pęcherzyka z płuc noworodkowych, młodociowych i dorosłych myszy, przystosowanych do zakaźnych warunków eksperymentalnych

Przedstawiono protokół do izolacji i pierwotnej kultury komórek endotelialnych drobnych naczyń krwionośnych mózgu (BMEC) z mózgu mysiego noworodka w celu stworzenia solidnego modelu in vitro do badania funkcji bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Izolacja i hodowla komórek endoteliowych mikrokrążenia mózgu myszy

Poznaj metodę izolacji i hodowli komórek śródbłonka płuc od nowonarodzonych myszy przy użyciu przeciwciał sprzężonych z kulkami magnetycznymi. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości kultur mikronaczyniowych komórek endotelialnych.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Przeglądaj więcej filmów