JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuronauka
0 wyświetleń • 1:30 min • March 4th, 2025
Zacznij od wstępnie utrwalonego, odparafinowanego i ponownie uwodnionego koronalnego wycinka mózgu zawierającego neurony ulegające apoptozie, charakteryzującej się śmiercią komórki i fragmentacją DNA.
Aby wykryć apoptozę śmierci komórki za pomocą testu TUNEL, należy potraktować wycinek mózgu enzymem proteinazą-K.
Proteinaza-K dostaje się do neuronów i dezaktywuje DNazy, zapobiegając degradacji DNA.
Opłucz plasterek, aby usunąć wszelkie pozostałości enzymów.
Dodać bufor zawierający trifosforany deoksyurydyny znakowane barwnikiem fluorescencyjnym lub dUTP oraz końcową transferazę deoksynukleotydylu lub enzym TdT, a następnie inkubować.
W neuronach apoptotycznych z licznymi fragmentami DNA enzym TdT przyłącza te fluorescencyjne dUTP do wolnych grup 3′-hydroksylowych fragmentów DNA.
W przeciwieństwie do tego, DNA zdrowych neuronów pozostaje nieoznakowane.
Zabarwić tkankę DAPI, barwnikiem jądrowym, który wiąże się z DNA zarówno w zdrowych, jak i apoptotycznych neuronach, barwiąc ich jądra na niebiesko.
Po wizualizacji neurony zawierające zarówno niebieską, jak i zieloną fluorescencję potwierdzają apoptotyczną śmierć komórki w tkance mózgowej.