Name: Rekombinowana produkcja retrowirusowa i zakażenie limfocytów B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj metodę rekombinowanej produkcji retrowirusowej do stabilnej ekspresji genu AID w limfocytach B myszy. Technika ta umożliwia analizę funkcji genu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

C.K. otrzymuje wsparcie z programu doktoranckiego Uniwersytetu Columbia. U.B. jest stypendystą Leukemia and Lymphoma Society of America, laureatem New Investigator Award z Leukemia Research Foundation oraz otrzymuje wsparcie z funduszy startowych dla nowej kadry naukowca Uniwersytetu Columbia.

1. Izolacja i stymulacja B-limfocytów śledziony
<ol>
	<li>Pobrać śledziony od myszy z niedoborem AID 12 w wieku od 2 do 3 miesięcy. Izolację śledziony należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, a organy tymczasowo przechowywać w zimnym roztworze soli fosforanowej (PBS) zawierającym 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Śledzionę należy następnie przenieść do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i zhomogenizować w 5 mL PBS uzupełnionego o 2,5% FBS. Homogenizat przelać do probówki Falcon 15 mL.</li>
	<li>Próbkę zhomogenizowanej tkanki śledziony wirować przy 100rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Odlać supernatant po wirowaniu. Osad komórkowy resuspender w 10 mL buforze do lizy erytrocytów (RBC) w temperaturze pokojowej przez 7 minut, aby uniknąć zanieczyszczenia krwinkami czerwonymi.</li>
	<li>Wirować próbkę przy 10 rpm przez 10 minut, odlać supernatant i resuspender komórki w 10 mL PBS zawierającego 2,5% FBS.</li>
	<li>Pobrać 10 μL alikwot i policzyć komórki przy rozcieńczeniu 1:100 za pomocą standardowego komory contamosyjowej, stosując błękit trypanu w celu wykluczenia komórek martwych. Z jednej śledziony można uzyskać około 20-30 milionów komórek.</li>
	<li>Wirować próbkę przy 10rpm przez 10 minut i odlać supernatant.</li>
	<li>Resuspender osad w 0,5% BSA/PBS zawierającym 2mM EDTA do stężenia 107 komórek na 90 μL.</li>
	<li>Do komórek dodać magnetyczne kulki pokryte przeciwciałem anty-CD43, aby specyficznie związać komórki inne niż B. Stosować 10 μL kulek na 90 μL (107 komórek). Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 4°C przez 20 minut.</li>
	<li>Po oznakowaniu komórek przemyć je, dodając 2,5% FBS/PBS do górnej części probówki. Wirować próbkę przy 10 rpm przez 10 minut.</li>
	<li>Odlać supernatant. Resuspender komórki w 0,1% BSA/PBS do stężenia 10x107 komórek na ml.</li>
	<li>Zamontować kolumnę do sortowania magnetycznego na separatorze magnetycznym. Umieścić probówkę stożkową bezpośrednio pod kolumną, aby zbierać przelew, a następnie przygotować kolumnę, przepuszczając przez nią 3mL 0,5% BSA/PBS w celu przepłukania.</li>
	<li>Po przepłynięciu płynu płuczącego wymienić probówkę zbiorczą na nową. Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 1 mL, dostosować ją do 1 mL za pomocą 0,5 %BSA/PBS/EDTA i nanieść próbkę na kolumnę. Na jedną kolumnę nanosić maksymalnie 1 mL komórek; w razie potrzeby użyć wielu kolumn.</li>
	<li>Pozostawić komórki, aby pasywnie przepłynęły przez kolumnę, i zbierać niezwiązane komórki do probówki stożkowej znajdującej się pod kolumną. Przemyć kolumnę 4 razy za pomocą 3 mL 0,5% BSA/PBS, kontynuując zbieranie przelewu.</li>
	<li>Zebrać cały przelew, w którym wzbogacone będą spoczynkowe komórki B negatywne pod względem CD43. Kolumnę wyrzucić. Wirować przelew przy 10 rpm przez 10 minut.</li>
	<li>Odlać supernatant i dodać 10 mL pożywki (15% FCS/ +glutamina, Pen/Strep, niezbędne aminokwasy, 50 μM Β-ME).</li>
	<li>Policzyć komórki i hodować w stężeniu 106 komórek na ml.</li>
	<li>Aby stymulować wzrost i proliferację komórek B, uzupełnić pożywkę rekombinowanym IL-4 oraz przeciwciałem anty-CD40 w taki sposób, aby końcowe stężenia wynosiły odpowiednio 20 μg/mL i 1 μg/mL, a następnie przenieść komórki do kolby hodowlanej.</li>
	<li>Hodować komórki przez noc. Policzyć komórki i rozcieńczyć do 106 komórek na ml, dodając w razie potrzeby IL-4 i CD40.</li>
	<li>Hodować komórki przez 72 godziny przed infekcją wirusową.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek producentów
Należy zastosować uznane protokoły transfekcji z użyciem lipidów kationowych lub fosforanu wapnia. Transfekcję przeprowadza się w płytce 10cm3 na jeden konstrukt DNA, stosując 10 μg plazmidowego DNA na płytkę. W naszej rutynowej praktyce stosujemy metodę transfekcji fosforanem wapnia 13, 14, zauważając wysoki miano wirusa po dodaniu chlorochiny.
<ol>
	<li>Jako komórki producenta do transfekcji wykorzystać komórki Phoenix o stopniu konfluencji 60%-70%. Przy takiej konfluencji liczba komórek powinna wynosić 5 milionów na płytkę 10 cm. </li>
	<li>Na godzinę przed transfekcją wymienić medium na świeże, kompletne medium do wzrostu komórek Phoenix. </li>
	<li>W sterylnej probówce typu Eppendorf połączyć 10 μg DNA konstruktu opakowującego oraz 250 μL 0,5M CaCl2, a następnie uzupełnić objętość końcową do 50 μL sterylną wodą. </li>
	<li>Za pomocą pipety 1 mL energicznie wymieszać ten roztwór z 500 μL 2X HNP w 15-mililitrowej probówce polipropylenowej. </li>
	<li>Pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 8-10 minut. W tym czasie utworzy się osad. </li>
	<li>Dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami do komórek, delikatnie kołysząc naczyniem, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę w medium. </li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez 12 godzin. </li>
	<li>12 godzin po transfekcji wymienić medium na 8 ml kompletnego medium do wzrostu komórek B i przenieść komórki z powrotem do inkubatora w temperaturze 37°C.</li>
</ol>
3. Zakażanie stymulowanych limfocytów B śledziony
<ol>
	<li>Usunąć supernatant z komórek Phoenix 48 h po transfekcji i przepuścić go przez filtr 0,2 mikrona, aby usunąć szczątki komórkowe.</li>
	<li>Wymieszać 3 mL supernatantu zawierającego wirusa z 3 mL uprzednio aktywowanych limfocytów B (zgodnie z krokiem 1). Aby zwiększyć adsorpcję wirusa do komórek, dodać polybrene do stężenia końcowego 16 μg/mL.</li>
	<li>Zainfekować komórki poprzez wirowanie przy 250 rpm przez 90 minut w temperaturze 30°C.</li>
	<li>Bezpośrednio po wirowaniu inkubować przez kolejne 48-72 h w temperaturze 37°C, aby umożliwić wzrost i proliferację komórek.</li>
</ol>
4. Analiza cytometryczna
<ol>
	<li>Za pomocą cytometru przepływowego przeanalizowano komórki pod kątem ekspresji powierzchniowej B20 oraz powierzchniowego IgG1. Obecność IgG1 na powierzchni komórek wskazuje, że doszło do rekombinacji przełączającej klasę w wyniku skutecznego ratunku poprzez retrowirusową komplementację genu AID.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Z powodzeniem przywróciliśmy niedobór białka aktywacyjnej cytydyny deaminase indukowanej (AID) w limfocytach B z deficytem AID (AID-/-) za pomocą transdukcji retrowirusowej. W skrócie: wygenerowaliśmy rekombinowane retrowirusy wykazujące ekspresję białka AID mysiego (mAID) poprzez transfekcję komórek Phoenix plazmidem pMX-mAID-GFP. 15-18Zbiór wirusów zakażono do komórek B z niedoborem AID, otrzymanych od myszy z niedoborem AID w ex vivo warunki stymulacji rekombinacji przełączającej klasy (CSR) 19Następnie analizowano zainfekowane limfocyty B pod kątem CSR do IgG1 po 72 godzinach inkubacji w hodowli, wykorzystując analizę cytometryczną. Rycina 2 przedstawia detekcję IgG1 na powierzchni limfocytów B z AID, czego nie zaobserwowano w przypadku pustego konstruktu, co wskazuje, że CSR nastąpiło w wyniku przywrócenia ekspresji AID. 
<img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig1.jpg" alt="Schemat wektora do edycji genów z sekwencją LTR i IRES-GFP; składanie wirusa, ekspresja białka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1: Schemat pakowania retrowirusowego w komórkach producentach: Geny zainteresowania, reprezentowane przez Ψ, podklonowano do wektora pMX-IRES-GFP zgodnie z wcześniejszym opisem 15Plazmid wprowadzono do ekotropowej linii komórkowej do pakowania wirusów, zdolnej do produkcji białek gag-pol oraz białka otoczki (Phoenix, Orbigen), stosując metodę fosforanu wapnia. 13, 14Czterdzieści osiem godzin po transfekcji zebrano nadsącz zawierający cząsteczki wirusowe w celu zakażenia docelowych pierwotnych limfocytów B uzyskanych od myszy. 
<img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig2.jpg" alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej; ekspresja IgG1 w stosunku do GFP w mutantach AID; dane dotyczące rekonstrukcji genetycznej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2: Komórki B z niedoborem AID, stymulowane przeciwciałem anty-CD40 oraz IL-4, zostały zainfekowane retrowirusem zawierającym pMX-mAID-GFP lub retrowirusem wykazującym ekspresję samego GFP. Poziom CSR do IgG1 oceniono za pomocą analizy FACS.

<ol><li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li>
<li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+during+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li>
<li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+plasticity+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation plasticity of hematopoietic cells.</a> Blood. 99, 3089-30101 (2002).</li>
<li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+in+the+immune+system%3A+basic+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li>
<li>Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420, 520-562 (2002).</li>
<li>Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffiths%2C+AJF+%22Introduction+to+Genetic+Analysis%22">Introduction to Genetic Analysis</a>. , W. H. Freeman. New York. (2000).</li>
<li>Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+targeting+in+the+mouse+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics.</a> BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).</li>
<li>Plachy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviruses+selected+for+high+and+stable+expression+of+transduced+genes+accumulate+in+broadly+transcribed+genome+areas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas.</a> J Virol. 84, 4204-4211 (2010).</li>
<li>Felice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+genetic+determinants+of+retroviral+integration+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome.</a> PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).</li>
<li>Karavanas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+targeting+by+murine+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Cell targeting by murine retroviral vectors.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).</li>
<li>Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+39-kDa+protein+on+activated+helper+T+cells+binds+CD40+and+transduces+the+signal+for+cognate+activation+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+switch+recombination+and+hypermutation+require+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+potential+RNA+editing+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme.</a> Cell. 102, 553-563 (2000).</li>
<li>Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+viral+DNA+in+optimal+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions.</a> J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413, 639-6343 (2001).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AID+antibody+diversification+enzyme+is+regulated+by+protein+kinase+A+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.</a> Nature. 438, 508-5011 (2005).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Barreto, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+from+bony+fish+catalyzes+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">AID from bony fish catalyzes class switch recombination.</a> J Exp Med. 202, 733-738 (2005).</li>
<li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE%3A+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li>
<li>Castigli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+expression+and+function+in+murine+B+cell+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40 expression and function in murine B cell ontogeny.</a> Int Immunol. 8, 405-411 (1996).</li>
<li>Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+of+a+switch+substrate+retrovector+in+CD40-+activated+B+lymphocytes%3A+implications+for+the+control+of+CH+gene+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination.</a> J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów B śledziony, opisana w niniejszej pracy i przedstawiona na Rysunku 1, jest podejściem genetycznym przydatnym w badaniu limfocytów B, ponieważ wiele zdarzeń rozwojowych w limfopoezie jest kontrolowanych przez regulację transkrypcyjną 1, 2. W późniejszych etapach dojrzewania limfocytów B aktywacja poprzez CD40L jest niezbędna do indukcji wzrostu limfocytów B, wejścia w cykl komórkowy i proliferacji 11, 20. Jak pokazano na Rysunku 2...

<table><tbody><tr><td>FCS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy erytrocytów (RBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki CD43</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pełna pożywka dla limfocytów B</td><td>Różne</td><td>Różne komponenty</td><td>RPMI, 15% FCS, 1% nieessentialnych aminokwasów, 1% pirogronianu sodu, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50&amp;#x03BC;M &amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanolu</td></tr><tr><td>IL-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD40</td><td>BD Biosciences</td><td>553787</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689 &amp;#8232;</td><td></td></tr><tr><td>Sól difosforanu chlorochiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>Stosowana w stężeniu 100mM</td></tr><tr><td>Komórki Ph&amp;#8211;nix Eco (mysie)</td><td>Orbigen</td><td>RVC-10002</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5-&amp;alpha;-mouse-CD45R (B220)</td><td>eBioscience</td><td>15-0452-81</td><td></td></tr><tr><td>PE-&amp;alpha;-mouse-IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>A85-1</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów b

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Transgeniczna ekspresja genów w komórkach eukariotycznych to potężne podejście genetyki odwrotnej, w którym geny zainteresowania są eksprimowane pod kontrolą heterologicznego systemu ekspresji, aby ułatwić analizę wynikowego fenotypu. Metodę tę można wykorzystać do ekspresji genu, który normalnie nie występuje w danym organizmie, do ekspresji zmutowanej formy produktu genu lub do nadekspresji formy dominująco-negatywnej produktu genu. Jest ona szczególnie przydatna w badaniach układu krwiotwórczego, w którym regulacja transkrypcyjna stanowi główny mechanizm kontrolny w rozwoju i różnicowaniu limfocytów B 1, co zostało omówione w 2-4.
Genetyka myszy stanowi potężne narzędzie w badaniach nad ludzkimi genami i chorobami. Analiza porównawcza genomu myszy i człowieka wykazuje zachowanie syntenii w ponad 90% genomu 5. Ponadto wiele technologii stosowanych w modelach mysich znajduje zastosowanie w badaniu genów ludzkich, na przykład w przypadku delecji genów i wymiany allelicznej 6. Jednak stworzenie myszy transgenicznej wymaga znacznych zasobów, zarówno finansowych, jak i technicznych. Kilka projektów rozpoczęło gromadzenie bibliotek szczepów myszy typu knockout (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) lub szczepów indukowanych mutagenezą (RIKEN), co wymaga wysiłków na szeroką skalę i współpracy 7. Dlatego też wskazane jest, aby przed przejściem do modelu mysiego najpierw zbadać fenotyp pożądanego genu w modelu hodowli komórkowej z komórek pierwotnych. 
Retrowirusowe DNA integruje się z DNA gospodarza, najlepiej w obrębie lub w pobliżu jednostek transkrypcyjnych lub wysp CpG, co prowadzi do stabilnej i dziedzicznej ekspresji zapakowanego genu docelowego przy jednoczesnym uniknięciu wyciszenia transkrypcyjnego 8 9. Geny są następnie transkrybowane pod kontrolą wysokowydajnego promotora retrowirusowego, co skutkuje wysoką wydajnością transkrypcji i produkcji białek. W związku z tym ekspresja retrowirusowa może być stosowana w przypadku komórek trudnych do transfekcji, pod warunkiem, że komórki te znajdują się w aktywnym stanie podczas mitozy. Ponieważ geny strukturalne wirusa znajdują się w linii komórkowej do pakowania, wektory ekspresyjne używane do klonowania genu docelowego nie zawierają genów strukturalnych wirusa, co eliminuje możliwość powstania rewersantów wirusowych i zwiększa bezpieczeństwo pracy z nadsączkami wirusowymi, gdyż nie powstają w nich zakaźne wiriony 10.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół produkcji rekombinowanych retrowirusów i następczego zakażania limfocytów B śledziony. Po izolacji hodowlane komórki śledziony są stymulowane limfokinami pochodzącymi z komórek Th oraz przeciwciałem anty-CD40, co indukuje gwałtowną proliferację i różnicowanie limfocytów B 11. Protokół ten jest idealny do badania zdarzeń występujących w późnych etapach rozwoju i różnicowania limfocytów B, ponieważ komórki te są izolowane ze śledziony po początkowych procesach hematopoetycznych, ale przed stymulacją antygenową indukującą różnicowanie plazmacytowe.

Opisano wydajny system analizy struktury i funkcji genu w kulturze ex vivo limfocytów B śledziony. Metoda ta wykorzystuje produkcję rekombinowanych retrowirusów w wolnej od komórek pomocniczych (helper-free), ekotropowej linii komórkowej pakującej. Osiągnięto stabilną, dziedziczną ekspresję badanego genu w pierwotnych limfocytach, co prowadzi do generowania przeciwciał powierzchniowych na komórkach B przechodzących rekombinację zmiany klasy.

Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B

Transgeniczna ekspresja genów w komórkach eukariotycznych jest potężnym podejściem genetyki odwrotnej, w którym geny zainteresowania są eksprymowane pod kontrolą...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie stabilnej, dziedzicznej ekspresji interesującego genu. W tym przypadku jest to regulator przełączania klas AID w pierwotnych limfocytach B myszy z deficytem tego genu; limfocyty B śledzionowe są pozyskiwane, oczyszczane i aktywowane przy użyciu przeciwciał anty-CD40 oraz IL-4. Konstrukt kodujący AID jest transfekowany do linii komórkowej pakującej w celu produkcji cząsteczek wirusowych zawierających ten gen. Następnie uprzednio aktywowane limfocyty B są infekowane rekombinowanym retrowirusem wytworzonym przez komórki pakujące.Następnie komórki hoduje się przez kolejne 47 do 72 godzin, aby umożliwić ich wzrost, proliferację oraz ekspresję wprowadzonego konstruktu. Na koniec komórki barwi się i analizuje za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem obecności powierzchniowych przeciwciał po przełączeniu klas. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak modelowanie mysie, jest fakt, że wymaga ona znacznie mniejszych zasobów finansowych i technicznych, zapewniając jednocześnie wydajny system analizy struktury i funkcji badanego genu przy zastosowaniu rygorystycznych zasad pracy w warunkach sterylnych.Pobier

recombinant-retroviral-production-and-infection-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Produkcja rekombinowanych wirusów retro i zakażenie komórek B

Niniejsza technika przedstawia efektywny sposób przygotowania defekcyjnych replikacyjnie zapasów retrowirusów kodujących ludzki onkogen, które następnie wykorzystano do indukowania choroby mieloproliferacyjnej w modelu mysim.

Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Metoda przygotowania komórek owadzie i zakażania ich bakulowirusem w celu produkcji rekombinowanego białka mCD1d oraz generowania tetramerów mCD1d.

Metoda produkcji rekombinowanego białka mCD1d w komórkach owadzych.

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Źródło: Zjablovskaja, P., et al., Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (2018)Niniejszy film prezentuje metodę produkcji rekombinowanych cząstek retrowirusowych poprzez transfekcję ludzkich komórek opakowujących pochodzących z nerki, co umożliwia stabilną dostawę genów do komórek docelowych w zastosowaniach takich jak modyfikacje genetyczne, testy funkcjonalne lub badania nad różnicowaniem linii komórkowych.

Produkcja cząstek retrowirusowych do transferu genów

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Tutaj opisujemy nowatorską metodę generowania specyficznych dla antygenu receptorów limfocytów T (TCR) poprzez parowanie TCRα lub TCRβ istniejącego TCR, posiadającego swoistość antygenową będącą przedmiotem zainteresowania, z komplementarnym półłańcuchem repertuaru obwodowych receptorów limfocytów T. Generowane de novo TCR zachowują swoistość antygenową z różnym powinowactwem.

Generowanie receptorów ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu de novo poprzez transdukcję retrowirusową centralnego hemiłańcucha

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Przedstawiamy 9-dniowy protokół transdukcji i ekspansji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej makaków rezusów, który daje komórki o doskonałej koekspresji interesujących genów w liczbie wystarczającej do badań infuzyjnych skuteczności komórek.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Tutaj opisujemy metodę retrowirusowej nadekspresji i adoptywnego transferu mysich komórek B-1a w celu zbadania in vivo migracji i lokalizacji komórek B-1a. Protokół ten można rozszerzyć o różne dalsze testy funkcjonalne, w tym kwantyfikację lokalizacji komórek B-1a dawcy lub analizę czynników wydzielanych przez komórki dawcy po transferze adopcyjnym.

Retrowirusowa nadekspresja CXCR4 na mysich komórkach B-1A i transfer adoptywny w celu ukierunkowanej migracji komórek B-1A do szpiku kostnego i produkcji IgM

Poznaj metodę rekombinowanej produkcji retrowirusowej do stabilnej ekspresji genu AID w limfocytach B myszy. Technika ta umożliwia analizę funkcji genu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej w badaniach immunologicznych.

Produkcja rekombinowanych retrowirusów i infekcja limfocytów B

Przeglądaj więcej filmów