Ocena równowagi ruchowej i koordynacji u myszy z wykorzystaniem belki równowagi

Ogólnym celem tej procedury jest ocena koordynacji ruchowej i równowagi u myszy. Pierwszym krokiem jest przygotowanie belki równoważnej z detektorem ruchu w celu zarejestrowania czasu przejścia przez belkę; rozpoczęcie treningu polega na umieszczeniu zwierzęcia w punkcie startowym belki równoważnej i umożliwieniu mu przejścia na bezpieczną platformę. Czasami konieczne jest zachęcenie zwierzęcia do poruszania się wzdłuż belki w stronę punktu końcowego.

Po 10-minutowym odstępie między próbami, zwierzęta były następnie trenowane na węższej belce, aby uzyskać większą czułość. Ostatnim krokiem procedury jest przetestowanie wytrenowanych zwierząt na belkach o różnych szerokościach. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące deficyty w koordynacji ruchowej i równowadze.

Witam, nazywam się Tim Luong i jestem doktorantem w programie MD PhD na wydziale biologii w California Institute of Technology. Jestem Holly Carlisle, stażystka podoktorska na wydziale biologii w California Institute of Technology. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak oceniać równowagę i koordynację ruchową u myszy za pomocą testu na belce równoważnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak rotarod, jest fakt, że test na belce równoważnej wykazuje zazwyczaj większą czułość nawet w przypadku subtelnych deficytów koordynacji ruchowej.

Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań behawioralnych, takie jak to, czy w określonych modelach chorób neurologicznych dochodzi do zaburzeń koordynacji ruchowej i równowagi oraz czy deficyty ruchowe są łagodzone przez konkretne metody leczenia. Celem tego testu jest pomiar czasu, w jakim mysz pokonuje belkę bez zatrzymywania się, zawieszenia w ruchu i bez stymulacji ze strony badacza. Aby uzyskać prawidłowy wynik w dniu testu, przeprowadzamy trening przez dwa dni poprzedzające badanie.

Wizualna demonstracja tej metody jest pomocna, ponieważ sposób obchodzenia się z myszami i wspomagania ich w przechodzeniu przez belkę może być trudny dla osób mniej zaznajomionych z testami behawioralnymi. Przejdźmy zatem do realizacji. Protokół ten opiera się na pracach Southwella i wsp. oraz Cartera i wsp.

Aparat składa się z belki o długości jednego metra, opartej na dwóch słupkach o wysokości 50 centymetrów. Belki mają płaską powierzchnię o szerokości sześciu lub 12 milimetrów. W przypadku większych myszy lub osobników, które nie są w stanie przejść po węższych belkach, można zastosować belki o większej szerokości.

Na końcu belki umieszcza się czarną skrzynkę, a w jej wnętrzu materiał gniazdowy, aby zachęcić mysz do dotarcia do punktu końcowego; punkt startowy oświetla się lampą, która pełni rolę bodźca awersyjnego. W odległości 0 i 80 centymetrów umieszcza się detektory ruchu w celu rejestracji czasu przejścia przez belkę, a pod belką, około 7,5 centymetra nad blatem stołu, rozciąga się nylonowy hamak, aby amortyzować ewentualne upadki. Myszy wykorzystane w tej procedurze są utrzymywane w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności oraz były aklimatyzowane przez dwa tygodnie przed rozpoczęciem testów.

Wprowadzono zwierzęta do pomieszczenia testowego około 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu; dla uzyskania najlepszych wyników należy zastosować grupę co najmniej 10 myszy na każdy warunek testowy. Aby rozpocząć trening, umieść mysz w punkcie startowym belki o szerokości 12 milimetrów. Stoper uruchamia się, gdy nos myszy przekrocza centralny odcinek 80 centymetrów, i zatrzymuje się, gdy zwierzę dotrze do końca tych 80 centymetrów.

Myszy powinny przejść przez belkę z minimalną liczbą zatrzymań lub zawahań. Jeśli zwierzę przestanie poruszać się naprzód, należy zachęcić je do kontynuacji, delikatnie popychając od tyłu. Po pomyślnym przejściu przez belkę zwierzę należy wyjąć z bezpiecznego pudełka i umieścić z powrotem w klatce domowej na 10 minut przed rozpoczęciem kolejnej sesji treningowej.

Belkę równoważną oraz pudełko należy oczyścić i przetrzeć 70% etanolem przed wprowadzeniem kolejnej myszy. Każda mysz przechodzi trening na belce o szerokości 12 milimetrów trzykrotnie, a następnie trening na belce o szerokości sześciu milimetrów. Dodatkowe trzykrotne powtórzenie treningu może zwiększyć częstotliwość występowania zatrzymań, w miarę jak zwierzę bardziej oswaja się z zadaniem i aparaturą.

Z drugiej strony, jeśli myszy nie zdołają przejść przez całą belkę po dwóch dniach treningu, może być wymagane dodatkowe szkolenie. Należy pamiętać o zarejestrowaniu pomiarów bazowych przed podaniem zwierzętom jakichkolwiek preparatów. Po zakończeniu treningu w danym dniu, należy przenieść myszy z powrotem do ich klatek w pomieszczeniu hodowlanym.

W dniu testowania należy wprowadzić zwierzęta do pomieszczenia na 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, zgodnie z wcześniejszym opisem, umieścić mysz w punkcie startowym i zarejestrować czas potrzebny zwierzęciu na pokonanie środkowych 80 centymetrów belki. Dane raportuje się jako średnią z dwóch udanych prób, w których mysz przeszła bezpośrednio do końca, bez zatrzymywania się i bez stymulacji ze strony badacza. Nagrania wideo mogą być wykorzystane do dokładniejszej analizy poślizgów oraz innych obserwowalnych deficytów motorycznych.

W tym przykładzie myszy szczepu C 57 black six w wieku od dziewięciu do 11 tygodni zostały poddane testom na belkach o szerokości 12 mm i 6 mm. Średni czas przejścia belki o szerokości 12 mm wyniósł 4,6 ± 0,4 s dla samców i 3,3 ± 0,3 s dla samic; czasy na belce 6 mm wyniosły 6,8 ± 0,7 s dla samców i 5,9 ± 0,5 s dla samic.

Wyniki testu na belce równoważnej mogą różnić się w zależności od wieku i szczepu myszy. Myszy C 57 black six wykorzystane w tym przykładzie są zazwyczaj zwierzętami aktywnymi; zaobserwowano u nich kilka poślizgów, ale żadnych upadków. W przypadku zwierząt manipulowanych genetycznie lub farmakologicznie poślizgi i upadki mogą występować częściej i mogą być poddawane kwantyfikacji. Myszy z zaburzeniami mogą chwytać się boku belki, co wydłuża czas przejścia podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby z wytrwałością i konsekwencją zachęcać myszy do poruszania się naprzód, jeśli zatrzymają się lub zostaną rozproszone podczas przebywania na belce. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak trenować myszy w przechodzeniu przez belkę równoważną oraz jak oceniać ich równowagę i koordynację. Dziękujemy za uwagę i mamy nadzieję, że materiał okazał się pomocny.