Transfer genów do komórek Schwanna nerwu kulszowego gryzoni za pomocą elektroporacji

Zacznij od znieczulonego noworodka szczura umieszczonego na poduszce grzewczej z odsłoniętym nerwem kulszowym.

Podnieś dystalne miejsce nerwu i wstrzyknij roztwór plazmidowego DNA zmieszany z barwnikiem. Barwnik pomaga śledzić dostarczanie plazmidu.

Umieść elektrodę typu pęseta wokół nerwu, zachowując niewielką szczelinę między ramionami elektrody.

Wprowadź sól fizjologiczną do tej szczeliny w celu przewodzenia prądu.

Zastosuj impuls elektryczny otaczający włókna nerwowe, który tworzy przejściowe pory błonowe w komórkach Schwanna. Następnie odwróć pozycje elektrod i zastosuj drugi impuls elektryczny. Zwiększa to wnikanie plazmidowego DNA przez pory.

Po elektroporacji błona komórkowa ponownie uszczelnia się i zatrzymuje plazmid.

Oczyść miejsce, uszczelnij nacięcie skóry, zdezynfekuj je i pozwól szczurowi dojść do siebie.

Później plazmidowe DNA przemieszcza się do jądra i integruje się z DNA komórki Schwanna, umożliwiając pomyślny transfer genów.

Delikatnie pociągnij dystalną stronę nerwu za pomocą igły, aby podnieść odsłonięty nerw. Włóż szklaną mikropipetę do dystalnego miejsca na nerwie i wstrzyknij roztwór DNA, wywierając lekki dodatni nacisk, aż nerw stanie się zielony. Następnie umieść platynową elektrodę typu pęseta w odległości około jednego do dwóch milimetrów od nerwu.

Wypełnij szczelinę między elektrodą a nerwem 0,9% roztworem chlorku sodu. Zastosować impulsy elektryczne w miejscu wstrzyknięcia za pomocą elektroporatora. Po pierwszym ustawieniu impulsu odwróć elektrodę i zastosuj kolejny zestaw impulsów.

Następnie oczyść miejsce elektroporacji 0,9% roztworem chlorku sodu. Po elektroporacji zamknij nacięcie klejem cyjanoakrylowym. Następnie oczyść ranę jodonem powidonu.

Zdejmij maskę na twarz ze zwierzęcia i trzymaj ją na podgrzewaczu elektrycznym przez co najmniej godzinę, aby umożliwić pełne wyzdrowienie po znieczuleniu