JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiologia
0 wyświetleń • 2:30 min • September 26th, 2025
Weź metabolicznie aktywną kulturę Mycobacterium marinum. Zapewnia to wysoką żywotność bakterii i optymalny stan fizjologiczny.
Odwirować kulturę, aby osadzać bakterie.
Odrzucić nadmiar supernatantu i ponownie zawiesić osad w świeżych pożywkach zawierających środek dyspergujący.
Przenieść zawiesinę do probówek mikrowirówkowych i poddać sonizacji w kontrolowanych warunkach.
Sonikacja rozbija agregaty bakteryjne i rozprasza komórki, w wyniku czego powstaje żywotna zawiesina jednokomórkowa.
Zebrać sonikowaną zawiesinę do strzykawki i przepuścić ją przez filtr membranowy, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki, zapewniając jednolitą populację pojedynczych komórek.
Za pomocą spektrofotometru zmierz gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej.
Rozcieńczyć zawiesinę świeżą pożywką zawierającą krioprotektant, aby osiągnąć pożądane stężenie bakterii przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek.
Podzielić na porcje końcową zawiesinę jednokomórkową i przechowywać ją w bardzo niskich temperaturach. Krioprotektant pomaga utrzymać żywotność bakterii podczas długotrwałego przechowywania.
Po zaszczepieniu zgodnie z manuskryptem, odwirować kulturę w temperaturze 3000 razy G przez 10 minut, aby zebrać Mycobacterium marinum w postaci osadu. Wyrzucić wszystko, z wyjątkiem 300 mikrolitrów supernatantu, i ponownie zawiesić osad.
Dodaj trzy mililitry pożywki 7H9 z 10% glicerolem, aby dalej ponownie zawiesić osad, a następnie poddać sonikę zawiesinie w łaźni wodnej o mocy 100 watów, z 15 sekundami włączenia i 15 sekundami przerwy, w sumie dwie minuty, aby uzyskać jednorodność pojedynczej komórki. Przenieś zawiesinę bakteryjną do 10-mililitrowej strzykawki i przepuść przez filtr o grubości pięciu mikronów, aby usunąć wszelkie grudki bakteryjne. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć gęstość optyczną zawiesiny i rozcieńczyć ją pożywką 7H9 zawierającą 10% glicerolu do jednorazowego OD 600.
Podziel zawiesinę na 10 mikrolitrów porcji i przechowuj w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania.