Hodowla i utrzymanie bakterii wykazujących ekspresję RNAi

Zacznij od płytki zawierającej wstępnie wyhodowane bakterie interferencyjne RNA lub bakterie wyrażające RNAi.

Bakterie te przenoszą plazmidy zawierające gen oporności na antybiotyki i docelową wstawkę genu, która wytwarza dwuniciowy RNA lub dsRNA w celu zahamowania specyficznej ekspresji genów w gospodarzu.

Za pomocą sterylnej szpilki przenieś kolonie do płytki z głęboką studnią zawierającą pożywkę uzupełnioną antybiotykiem.

Inkubuj płytkę, potrząsając, aby zapewnić równomierny wzrost bakterii, gdzie głębokie studzienki zapewniają napowietrzenie.

Antybiotyk eliminuje bakterie, które nie mają plazmidu, zapewniając, że przetrwają tylko bakterie przenoszące plazmid.

Odwirować płytkę, aby oddzielić bakterie i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić bakterie w buforowanym roztworze soli fizjologicznej, aby je ustabilizować.

Dozuj zawieszone bakterie do wielodołkowej płytki zawierającej pożywkę bogatą w składniki odżywcze, uzupełnioną zarówno antybiotykiem, jak i induktorem.

Antybiotyk selekcjonuje bakterie przenoszące plazmid, podczas gdy induktor wyzwala ekspresję dsRNA.

Płytka wysiana bakteriami wykazującymi ekspresję RNAi jest gotowa do dalszych badań.

Aby przetestować wiele szczepów bakteryjnych RNAi równolegle w jednym dołku na 24-dołkowej płytce dołkowej, należy zaszczepić pojedynczą kolonię z każdego klonu wcześniej przygotowanych bakterii zawierających RNAi w czterech mililitrach LB uzupełnionego karbenicyliną. Umieścić płytki w inkubatorze do wytrząsania zoptymalizowanym dla płytek wielodołkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 950 obr./min przez 16 godzin, Następnie zbierz bakterie przez odwirowanie z prędkością 2 000 g przez 5 minut. Zdekantować supernatant poprzez odwrócenie płytki i energiczne potrząśnięcie nią.

Używając 100 mikrolitrów S Basal, ponownie zasymij bakterie RNAi. Odpipetować zawieszone bakterie do odpowiedniej liczby dołków wielodołkowej płytki NGM uzupełnionej IPTG i karbenicyliną i pozostawić płytkę do wyschnięcia.