F Transfer plazmidu i podwójna selekcja antybiotyków w E. coli

Zacznij od komórek E. coli dawcy zawierających plazmid F, w którym gen transferowy jest zastąpiony genem oporności na antybiotyki.

Komórki te zawierają również plazmid ratunkowy, który koduje brakujący gen transferu.

Weźmy równe objętości komórek biorcy E. coli z innym genem oporności na antybiotyki w swoim DNA.

Wymieszaj obie kultury w pożywce bez antybiotyków i inkubuj bez wstrząsania.

Plazmid ratunkowy bakterii dawcy wykazuje ekspresję genu transferowego, umożliwiając komórce dawcy zbudowanie F-pilusa.

Pilus tworzy most między dwiema komórkami, umożliwiając jednokierunkowy transfer plazmidu od dawcy do biorcy, tworząc transkoniuganty.

Wiruj mieszaninę, aby rozbić pary godowe i umieść ją na lodzie, aby zapobiec dalszemu kryciu.

Wykryć kulturę na płytkach agarowych zawierających przezkoniugowane antybiotyki do wyboru i inkubować.

Transkoniuganty, przenoszące oba geny oporności na antybiotyki, przeżywają i tworzą kolonie w obecności obu antybiotyków, potwierdzając udany transfer plazmidu F.

W dwóch egzemplarzach podwielokrotność 100 mikrolitrów komórek dawcy i 100 mikrolitrów komórek biorczych na 800 mikrolitrów sterylnej pożywki LB na jeden mililitr całkowitej objętości. Pozwól komórkom po