Name: Zapisy elektrofizjologiczne ze szlaku włókien olbrzymich D. melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Poznaj metodę elektrofizjologicznych zapisów potencjałów postsynaptycznych w szlaku włókien olbrzymich Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala badać przekaźnictwo synaptyczne w mięśniach DLM i TTM oraz oceniać właściwości funkcjonalne obwodów neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant Wellcome Trust przyznany L.P.

1. Sprzęt i materiały
<ol>
 <li>W eksperymentach tych wykorzystuje się standardowy zestaw do elektrofizjologii, składający się ze stymulatora, jednostki izolacji bodźców, dwóch wzmacniaczy mikroelektrod, systemu akwizycji danych oraz komputera z oprogramowaniem do zbierania danych. Dodatkowy sprzęt obejmuje klatkę Faradaya, stereomikroskop na statywie wysięgnikowym, stół wibroizolacyjny, źródło światła oraz platformę rejestracyjną.</li>
 <li>Używa się pięciu mikromanipulatorów. Dwa mikromanipulatory wymagają precyzyjnej regulacji w celu pozycjonowania elektrod rejestrujących, natomiast pozostałe trzy wymagają jedynie regulacji grubej do ustawienia dwóch elektrod stymulujących i elektrody uziemiającej. Mikromanipulator dla elektrody rejestrującej DLM umieszcza się przy końcu preparatu (po lewej stronie eksperymentatora), a mikromanipulator dla elektrody rejestrującej TTM pomiędzy eksperymentatorem a bokiem preparatu (nieco na lewo od eksperymentatora). Dwa mikromanipulatory, które będą trzymać elektrody stymulujące, umieszcza się przy głowie preparatu (po prawej stronie eksperymentatora). Mikromanipulator dla elektrody uziemiającej umieszcza się po przeciwnej stronie preparatu.</li>
 <li>Wytwarzamy szklane mikroelektrody rejestrujące o oporności 40-60 MΩ i przechowujemy je na płasko w naczyniu, zabezpieczone woskiem. Do stymulacji wykorzystuje się dwie elektrody wolframowe zaostrzone elektrolitycznie (NaOH). Jako uziemienie stosuje się drut wolframowy lub trzecią elektrodę wykonaną elektrolitycznie. Elektrody stymulujące i uziemiająca są przygotowywane i mocowane do mikromanipulatorów przed rozpoczęciem sesji eksperymentalnej i nie wymagają wymiany przez cały czas trwania sesji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie D. melanogaster
<ol>
 <li>Po przygotowaniu sprzętu należy przygotować muchy. Znieczul muchy poprzez schłodzenie ich na lodzie lub przy użyciu CO2. W przypadku użycia CO2 należy odczekać odpowiedni czas (około 20 min), aby działanie gazu ustało przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
 <li>Za pomocą pęsety delikatnie przenieś muchy za odnóża do naczynia zawierającego platformę z miękkiego wosku ustawioną pod kątem około 45°. Kolejne cztery kroki wykonuje się pod mikroskopem stereoskopowym, z dala od (ale w pobliżu) sprzętu rejestrującego.</li>
 <li>Kolejnym krokiem jest unieruchomienie muchy w wosku. Ustaw muchę stroną brzuszną do dołu, tak aby jej przód był skierowany w górę nachylenia. Używając precyzyjnej pęsety, rozstaw odnóża na zewnątrz parami i wciśnij je w wosk.</li>
 <li>Zlokalizuj mięśnie, z których będzie prowadzony zapis: mięsień grzbietowy podłużny (DLM) oraz mięsień tergotrochanteralny (TTM). Miejsca przyczepu podskórnego DLM odpowiadają obszarowi między linią środkową klatki piersiowej a przednimi szczecinkami grzbietowymi (setae). Miejsca przyczepu TTM znajdują się grzbietowo od tylnych i przednich szczecinek nadskrzydłowych. Upewniając się, że skrzydła nie będą blokować dostępu do włókien DLM lub TTM, odsuń skrzydła na zewnątrz i „przyklej” je do wosku.</li>
 <li>Używając precyzyjnej pęsety, ostrożnie wyciągnij trąbkę na zewnątrz i unieruchom ją, zanurzając w wosku. Jest to krytyczny etap wymagający wprawy, ponieważ trąbka jest miękka i łatwo oddziela się od reszty głowy. Jeśli tak się stanie, odrzuć muchę i zacznij od nowa. Brak odpowiedniego unieruchomienia głowy prowadzi do problemów podczas wprowadzania elektrod stymulujących przez oczy.</li>
</ol>
3. Umieszczanie elektrod
<ol>
 <li>Po przymocowaniu muchy do wosku, przenieś szalkę z przymocowaną muchą pod stereomikroskop znajdujący się wewnątrz klatki Faradaya. Ustaw muchę bokiem, tak aby jej głowa znajdowała się po prawej stronie eksperymentatora.</li>
 <li>Kolejnym krokiem jest wprowadzenie elektrod. Elektrody uziemiające i stymulujące można wprowadzić bez patrzenia przez mikroskop. Wysoka jakość zapisów zależy od precyzyjnego wprowadzenia elektrod, dlatego warto poćwiczyć obsługę mikromanipulatorów. Przybliż elektrody do miejsc wprowadzenia za pomocą mikromanipulatorów, aby ułatwić ich prawidłowe umieszczenie i późniejsze pomiary.</li>
 <li>Obniż elektrodę uziemiającą do tylnego końca odwłoka, korzystając z kół regulacyjnych mikromanipulatora. Aby umieścić zaostrzone wolframowe elektrody stymulujące w mózgu, użyj mikromanipulatora, aby ustawić końcówkę jednej z elektrod tak, by ledwo dotykała jednego z oczu muchy. Zrób to samo z drugą elektrodą, aby obie stykały się z zewnętrzną stroną każdego oka. Następnie wsuwaj elektrody po kolei przez każde oko, tak aby ich końcówki dotarły do mózgu znajdującego się z tyłu torebki głowowej (około 2-3mm).</li>
 <li>Prawidłowo umieszczone elektrody aktywują system włókien olbrzymich (Giant Fiber System). Aby sprawdzić, czy elektrody stymulujące są umieszczone prawidłowo, przyłóż krótki (0.03 ms) impuls o napięciu 30-60 V pomiędzy elektrody stymulujące i obserwuj ruchy skrzydeł oraz drżenia mięśni lotnych/odnóży.</li>
 <li>Kolejnym krokiem jest wypełnienie szklanych mikroelektrod od tyłu 3M KCl za pomocą strzykawki Hamiltona lub termicznie wyciąganej strzykawki plastikowej, a następnie umieszczenie ich w mikromanipulatorach precyzyjnych. Prawidłowo wprowadzone mikroelektrody mogą być używane przez kilka serii eksperymentów.</li>
 <li>Pierwszą elektrodę rejestrującą należy wprowadzić do włókna DLM. Istnieją dwa symetrycznie rozmieszczone DLM; każdy z nich składa się z sześciu pojedynczych włókien mięśniowych. Rejestrację można przeprowadzić z dowolnego z sześciu włókien; jednak najczęściej stosuje się włókna DLM 45a i 45b ze względu na ich dobrą dostępność przez grzbietową stronę kutykuli klatki piersiowej oraz fakt, że oba włókna są unerwione przez ten sam neuron ruchowy.</li>
 <li>Używając mikromanipulatora po stronie najdalej oddalonej od Ciebie, wprowadź elektrodę rejestrującą do włókna DLM 45a lub b. Nachylenie platformy pozwala elektrodzie DLM wniknąć w kutykulę grzbietową pod kątem ~60-90°, co ułatwia penetrację. Użyj oprogramowania w trybie oscyloskopu i obserwuj monitor komputera podczas wprowadzania elektrod rejestrujących do klatki piersiowej. Gdy elektroda wniknie do mięśnia, linia bazowa spadnie niemal do zera lub przyjmie wartość ujemną. Wykonaj pojedynczą stymulację, aby sprawdzić, czy można zaobserwować odpowiedź mięśniową.</li>
 <li>Wprowadź drugą elektrodę rejestrującą do TTM znajdującego się najbliżej Ciebie. Tę elektrodę wprowadza się bocznie, przed sobą, ze względu na położenie miejsca przyczepu mięśnia. Ponownie obserwuj monitor podczas tej czynności i wykonaj pojedynczą stymulację, gdy ślad wskaże, że elektroda znajduje się w mięśniu.</li>
</ol>
4. Stymulacja i rejestracja
<ol>
 <li>Można teraz przystąpić do stymulacji mózgu i rejestrowania odpowiedzi z mięśni nogi oraz mięśni lotnych. Przyłóż krótki (0,03 ms) impuls stymulujący przez elektrody stymulujące, zaczynając od 30 V i zwiększając napięcie do 60 V, aż do zaobserwowania odpowiedzi (tj. drgnięcia mięśnia oraz depolaryzacji komórki mięśniowej widocznej na monitorze komputera). W dalszej części eksperymentu ustaw napięcie o 5-10 V wyższe niż próg odpowiedzi.</li>
 <li>Aby zmierzyć latencję odpowiedzi, podaj co najmniej 5 pojedynczych impulsów z 5 sekundową przerwą między każdym z nich.</li>
 <li>Wyznacz „częstotliwość podążania” (frequency of following), podając serie impulsów o różnych częstotliwościach. Zazwyczaj podaje się 10 serii po 10 impulsów przy 100 Hz (10 ms między impulsami), 200 Hz (5 ms między impulsami) oraz 300 Hz (3 ms między impulsami). Między każdą serią impulsów zachowaj 2 sekundy przerwy.</li>
</ol>
5. Wyniki: Opóźnienia odpowiedzi i częstotliwość śledzenia w szlaku włókien olbrzymich
<ol>
 <li>Opóźnienie odpowiedzi to czas między stymulacją mózgu a depolaryzacją mięśnia. Rysunek ten porównuje opóźnienia odpowiedzi dla DLM i TTM w odpowiedzi na pojedynczy bodziec. Opóźnienia w zakresie od 0,7 do 1,2 ms dla ścieżki GF-TTM oraz od 1,3 do 1,7 ms dla ścieżki GF-DLM świadczą o prawidłowym przygotowaniu preparatu i właściwej technice rejestracji. Opóźnienia mogą różnić się w zależności od genotypu, tła genetycznego, temperatury i wieku. 
Rysunek 1 (A i B). Reprezentatywne zapisy pokazujące odpowiedzi zarejestrowane z TTM i DLM po podaniu pojedynczego bodźca do mózgu.</li>
 <li>Jak pokazano tutaj, zapisy z TTM wykazują większą zmienność pod względem amplitudy i kształtu potencjału postsynaptycznego (PSP) w porównaniu do zapisów z dużych włókien DLM; zwiększona zmienność ta wynika z niewielkiego rozmiaru włókien mięśniowych TTM. Zmienność ta nie wpływa jednak na wartości opóźnienia odpowiedzi dla ścieżki Giant Fiber-to-TTM. Rysunek 1 (C i D). Dalsze zapisy „opóźnienia odpowiedzi” u 4 poszczególnych much dla TTM i DLM. Należy zauważyć, że zapisy TTM wykazują zmienność kształtu PSP, ale opóźnienie odpowiedzi pozostaje niezmienione. Dla DLM zmienność kształtu PSP jest mniejsza. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="Wykres opóźnienia odpowiedzi; wykres TTM/DLM; pomiar bodźca; analiza opóźnienia; dane neurobiologiczne" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1 A-D"> </li>
 <li>Porównaj „częstotliwość nadążania” przy 100 Hz, 200 Hz i 300 Hz, obliczając proporcję udanych odpowiedzi (z 10) dla ścieżek DLM i TTM przy każdej częstotliwości stymulacji. Przy 100 Hz zarówno TTM, jak i DLM nadążają za bodźcami w stosunku 1:1. Przy częstotliwościach stymulacji powyżej 100 Hz w odpowiedziach DLM zaczynają pojawiać się niepowodzenia, ponieważ pośrednia synapsa chemiczna między dwoma neuronami pośredniczącymi nie ma wystarczająco dużo czasu na regenerację między bodźcami. Odpowiedzi TTM pozostają jednak w stosunku 1:1 do bodźców nawet powyżej 300 Hz. Rysunek 2. Reprezentatywne zapisy pokazujące rejestrację „częstotliwości nadążania”. Przy 100 Hz zarówno TTM, jak i DLM odpowiadają na wszystkie 10 bodźców (lewo). Przy 200 Hz odpowiedzi DLM zaczynają zanikać (gwiazdka). <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Wykres odpowiedzi częstotliwościowej ECG przy 100 Hz i 200 Hz, porównujący wzorce sygnałów TTM i DLM." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> </li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Reakcje o krótkim czasie utajenia u typu dzikiego (elektrody stymulujące umieszcza się w oczach, omijając receptory sensoryczne i bezpośrednio aktywując obwód GF) zależą od genotypu, tła genetycznego, temperatury i wieku, a ich wartości mieszczą się w zakresie od 0,7 do 1,2 ms dla ścieżki GF-TTM oraz od 1,3 do 1,7 ms dla ścieżki GF-DLM (Tanouye and Wyman, 1980; Thomas and Wyman, 1984; Engel and Wu, 1992; Allen and Murphey, 2007; Phelan et al., 2008; Augustin et al., unpublished). Bardzo krótki czas utajenia TTM wynika z obecności silnej synapsy elektrochemicznej GF-TTMn w ścieżce monosynaptycznej, natomiast dłuższy czas utajenia DLM wynika z disynaptycznego charakteru tej ścieżki oraz obecności synapsy chemicznej (PSI-DLMn). Reakcje o średnim i długim czasie utajenia (&gt;3 ms) są wynikiem aktywacji aferentów GF i uzyskuje się je albo poprzez zastosowanie stymulacji o niższej intensywności, albo poprzez podanie sygnału wizualnego („wyłączenie światła”). Przy 100Hz zarówno TTM, jak i DLM powinny podążać za bodźcami w stosunku 1:1. Powyżej 100Hz w reakcjach DLM zaczną pojawiać się niepowodzenia, ponieważ synapsa chemiczna między PSI a DLMns nie ma wystarczająco dużo czasu na regenerację między bodźcami oddalonymi od siebie o mniej niż 10ms. Reakcje TTM pozostaną jednak w stosunku 1:1 do bodźców nawet powyżej 300Hz (Tanouye and Wyman, 1980; Engel and Wu, 1992; Allen et al., 2007; Martinez et al., 2007). Mutacje w genie shakB, kodującym kanał połączenia szczelinowego u Drosophila („inneksynę”), znacząco zwiększają czas utajenia reakcji w ścieżce GF-TTM (~1,5 ms), podczas gdy odgałęzienie GF-DLM nie wykazuje reakcji (Allen and Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). Reakcję mutantów można przywrócić poprzez bezpośrednią stymulację zwojów piersiowych, co dowodzi, że opóźniony efekt nie wynika z zaburzeń przekazu nerwowo-mięśniowego. Zdolność do podążania za stymulacją o wysokiej częstotliwości jest również upośledzona u tych mutantów w porównaniu z muchami typu dzikiego, u których ścieżki GF-DLM i GF-TTM są zazwyczaj w stanie podążać za 10 bodźcami w stosunku 1:1 do odpowiednio 100 Hz i 300 Hz. Należy zauważyć, że częstotliwości te są znacznie wyższe niż normalne częstotliwości stymulacji docierające do kurczących się mięśni podczas lotu podtrzymywanego (3-10 Hz) (Hummon and Costello, 1989).
Kolejnym parametrem służącym do opisu stabilności wyników GFS jest „okres refrakcji”, czyli minimalny czas między dwoma impulsami stymulującymi, który nadal wywołuje dwie odpowiedzi mięśnia. Czas refrakcji wynosi od 1-4 ms dla TTMs oraz od 7-15 ms dla DLMs. Stosunkowo długi okres refrakcji w przypadku DLMs wynika z względnej labilności synaps chemicznych w złączeniu PSI-DLMn (Tanouye and Wyman, 1980; Gorczyca and Hall, 1984; Engel and Wu, 1992; Banerjee et al., 2004; Allen and Godenschwege, 2010).

<ol><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllen%2C+MJ+%22Drosophila+Neurobiology%3A+A+Laboratory+Manual%22">Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual</a>. Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. , 1st Lab ed, Cold Spring Harbor Press. (2010).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li>
<li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li>
<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila%3A+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li>
<li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila%3A+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li>
<li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li>
<li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li>
<li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , 2nd, Hafner. New York. 502-503 (1965).</li>
<li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li>
<li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li>
<li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li>
<li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Jednym z najważniejszych aspektów, na które należy zwrócić uwagę w celu uzyskania wysokiej jakości rejestracji, jest odpowiednia orientacja i stan zdrowotny preparatu. Idealnie, mucha powinna pozostać żywa do końca sesji nagraniowej i reagować na bodźce elektryczne. Aby elektrody rejestrujące mogły najskuteczniej przeniknąć przez egzoszkielet klatki piersiowej, mucha powinna zostać przyklejona do powierzchni w taki sposób, aby tworzyła kąt prosty z elektrodami; w razie potrzeby wprowadzenie elektrod można ułatwić, usuwając fragment grzbietowej kutykuli klatki piersiowej za pomocą skalpela wolframowego, odsłaniając tym samym mięsień lotny DLM (krok ten daje dodatkową zaletę w postaci zmniejszenia ryzyka złamania końcówek elektrod szklanych). Należy również zachować ostrożność, aby nie przesunąć elektrod przez położone podkutykularnie mięśnie DLM i TTM. Głowa muchy powinna być dobrze przymocowana, aby umożliwić prawidłowe wprowadzenie elektrod stymulujących do mózgu i zapobiec ich wysunięciu podczas sesji nagraniowej.
Ze względu na swój rozmiar i dobrze opisaną morfologię, GFS stanowi jedną z najbardziej dostępnych ścieżek neuronalnych u Drosophila. Przepuszczalność synaps elektrycznych dla barwników śledzących o niskiej masie cząsteczkowej umożliwia wizualizację neuronów sprzężonych elektrycznie, a kilka dostępnych linii GAL4 pozwala na manipulowanie poziomami ekspresji genów w podzbiorze komórek lub grup komórek (Jacobs et al., 2000; Allen et al., 2006). Oprócz wyżej wymienionych zalet, zarówno komponenty doprowadzające, jak i torakalne tego obwodu wykazują takie właściwości jak habituacja, spontaniczny powrót oraz dyshabituacja, co czyni GFS u Drosophila wygodnym systemem modelowym do badania plastyczności neuronalnej (Engel and Wu, 1996).

<table><tbody><tr><td>Stymulator impulsów prostokątnych S48 Square Pulse Stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednostka stymulująca</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izolator transformatorowy RF SIU5 RF Transformer Isolation Unit</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DwuKanałowy wzmacniacz mikro&amp;#8211;elektrod wewnątrzkomórkowych 5A</td><td>Getting Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych Digidata 1440A</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy Digidata 1320 oraz oprogramowanie Axoscope 9.0</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma rejestracyjna z manualnymi mikromanipulatorami</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Fostec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop Wild M5</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki borokrzemianowe do mikro&amp;#8211;elektrod</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet P-95</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 gauge, 67 mm (wypełniacz elektrod)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do mikrodissekcji (pincety,&amp;#8230;)</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do dyssekcji (stereo)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Nieznany</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Inne: plastikowe strzykawki, wolframowy przewód uziemiający i elektrody wolframowe ostrzone w NaOH, KCl, platforma woskowa, komputer z monitorem...</td></tr></tbody></table>

rejestracje elektrofizjologiczne z drogi włókna olbrzymiego d. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

W przypadku wystraszenia dorosłe D. melanogaster reagują wyskokiem w górę i odlotem. U wielu gatunków bezkręgowców, w tym u D. melanogaster, odpowiedź „ucieczkowa” (lub „zaskoczenia”) w stadium dorosłym jest pośredniczona przez wieloskładnikowy obwód neuronalny nazywany systemem włókien olbrzymich (Giant Fiber System, GFS). Stosunkowo duży rozmiar neuronów, ich charakterystyczna morfologia i proste połączenia sprawiają, że GFS jest atrakcyjnym systemem modelowym do badania obwodów neuronalnych. Ścieżka GFS składa się z dwóch obustronnie symetrycznych interneuronów włókien olbrzymich (GF), których aksony schodzą z mózgu wzdłuż linii środkowej do zwoju torakalnego poprzez koneksję szyjną. W neuromerze mezotorakalnym (T2) zwojów brzusznych GF tworzą synapsy elektrochemiczne z 1) dużym przyśrodkowym dendrytem ipsilateralnego neuronu ruchowego (TTMn), który steruje mięśniem tergotrochanteralnym (TTM), głównym prostownikiem uda/nogi mezotorakalnej, oraz 2) kontralateralnym interneuronem synaptycznym obwodowym (PSI), który z kolei tworzy synapsy chemiczne (cholinergiczne) z neuronami ruchowymi (DLMns) grzbietowych mięśni podłużnych (DLMs), będących depresorami skrzydeł. Ścieżki neuronalne prowadzące do mięśni grzbietowo-brzusznych (DVMs), czyli elewatorów skrzydeł, nie zostały jeszcze w pełni poznane (DLMs i DVMs są znane wspólnie jako pośrednie mięśnie lotne – nie są one przyczepione bezpośrednio do skrzydeł, lecz poruszają nimi pośrednio poprzez odkształcanie pobliskiej kutykuli torakalnej) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). Disynaptyczna aktywacja DLMs (poprzez PSI) powoduje niewielkie, ale istotne opóźnienie w czasie skurczu tych mięśni w stosunku do monosynaptycznej aktywacji TTM (~0,5 ms), co pozwala mięśniom TTM najpierw wyprostować udo i odepchnąć muchę od podłoża. Mięśnie TTM jednocześnie aktywują DLMs poprzez rozciąganie, które z kolei wzajemnie aktywują DVMs poprzez rozciąganie przez cały czas trwania lotu. Ścieżka GF może być aktywowana pośrednio poprzez zastosowanie bodźca sensorycznego (np. „podmuchu powietrza” lub „wygaszenia światła”) lub bezpośrednio za pomocą nadprogowego bodźca elektrycznego przyłożonego do mózgu (opisane tutaj). W obu przypadkach potencjał czynnościowy dociera do TTMs i DLMs wyłącznie za pośrednictwem GF, PSI oraz motoneuronów TTM/DLM, choć TTMns i DLMns posiadają inne, jak dotąd niezidentyfikowane wejścia sensoryczne. Pomiar „latencji odpowiedzi” (czasu między stymulacją a depolaryzacją mięśnia) oraz „podążania za stymulacją o wysokiej częstotliwości” (liczby udanych odpowiedzi na określoną liczbę bodźców o wysokiej częstotliwości) umożliwia powtarzalną i ilościową ocenę stanu funkcjonalnego komponentów GFS, w tym zarówno synaps centralnych (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn), jak i chemicznych (glutamatergicznych) złączy nerwowo-mięśniowych (TTMn-TTM i DLMn-DLM). Metoda ta była wykorzystywana do identyfikacji genów zaangażowanych w tworzenie synaps centralnych oraz do oceny funkcji OUN.

System Gigantycznych Włókien jest prostym obwodem neuronalnym u dorosłych Drosophila melanogaster, zawierającym największe neurony w organizmie muchy. Opisujemy protokół monitorowania przekaźnictwa synaptycznego w tej ścieżce poprzez rejestrację potencjałów postsynaptycznych w mięśniach grzbietowych podłużnych (DLM) i tergotrochanteralnych (TTM) po bezpośredniej stymulacji interneuronów Gigantycznych Włókien.

Rejestracje elektrofizjologiczne z drogi włókna olbrzymiego D. melanogaster

W sytuacji wystąpienia bodźca alarmowego dorosłe osobniki *D. melanogaster* reagują poprzez wyskok w górę i odlot. U wielu gatunków bezkręgowców, w tym u *D. melanogaster*, „ucieczka”...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie przekaźnictwa synaptycznego w obrębie szlaku włókien olbrzymich poprzez rejestrację potencjałów postsynaptycznych z grzbietowego mięśnia podłużnego (DLM) oraz mięśnia TTM po bezpośredniej stymulacji neuronów włókien olbrzymich. Jest to realizowane poprzez uprzednie odpowiednie unieruchomienie znieczulonej muchy w naczyniu zawierającym kropkę wosku. Kolejnym krokiem procedury jest wprowadzenie elektrod stymulujących, uziemiających i rejestrujących do organizmu muchy.Ostatnim krokiem procedury jest stymulacja mózgu i rejestracja odpowiedzi z mięśni skoku i lotu. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące zmiany we właściwościach funkcjonalnych drogi włókna olbrzymiego w zależności od genotypu, wieku, temperatury i innych czynników. Odbywa się to poprzez pomiar czasu między bodźcem a odpowiedzią oraz zliczenie liczby skutecznych odpowiedzi po serii bodźców o wysokiej częstotliwości.Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu niektórych kluczowych kwestii w dziedzinie neurofizjologii oraz pomóc w zbadaniu właściwości funkcjonalnych szlaków neuronalnych. Technikę tę można zastosować zarówno jako eksperyment wstępny, po którym następuje analiza genetyczna lub molekularna, jak i jako sposób oceny właściwości fizjologicznych i funkcjonalnych u zwierząt z określoną mutacją. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa.Ponieważ etapy przygotowania i uszkodzenia wymagają czasu na naukę, a muchy są stosunkowo małe, przed prawidłowym przeprowadzeniem eksperymentów należy nabyć odpowiedni poziom stabilności i koordynacji. W eksperymentach tych wykorzystuje się standardowy zestaw do elektrofizjologii, składający się ze stymulatora, jednostki izolacji bodźca, dwóch wzmacniaczy mikroelektrod, systemu akwizycji danych oraz komputera z oprogramowaniem do gromadzenia danych.Dodatkowe wyposażenie obejmuje klatkę Faradaya, stereomikroskop na statywie ramieniowym, stół wibroizolacyjny, źródło światła oraz platformę rejestracyjną. Wykorzystuje się pięć mikromanipulatorów. Dwa mikromanipulatory wymagają precyzyjnych elementów sterujących do pozycjonowania elektrod rejestrujących, natomiast pozostałe trzy mikromanipulatory wymagają jedynie regulacji grubych.Aby ustawić dwie elektrody stymulujące oraz elektrodę uziemiającą, manipulator elektrody rejestrującej DLM umieszcza się na końcu ogonowym preparatu. Mikromanipulator elektrody rejestrującej TTM umieszcza się pomiędzy eksperymentatorem a bokiem preparatu. Dwa mikromanipulatory elektrod stymulujących umieszcza się przy głowie preparatu.Mikromanipulator dla elektrody uziemiającej zostaje umieszczony po przeciwnej stronie preparatu. Wyciągnij szklane mikroelektrody rejestrujące o rezystancji od 40 do 60 megaomów i przechowuj je płasko w naczyniu z podkładem z wosku. Do stymulacji użyj dwóch elektrod wolframowych ostrzonych elektromagnetycznie.Użyć drutu prowadzącego lub trzeciej elektrody wykonanej metodą elektromagnetyczną. Jako uziemienie podłączyć elektrody stymulujące i uziemiające do mikromanipulatorów przed rozpoczęciem sesji eksperymentalnej. Nie będą one wymagały wymiany przez cały czas trwania sesji.Po przygotowaniu aparatury należy przygotować muchy. Znieczul muchy, chłodząc je na lodzie przez 10 do 15 minut. Za pomocą pęsety delikatnie przenieś muchę, chwytając ją za odnóża, do naczynia zawierającego platformę z miękkiego wosku ustawioną pod kątem około 45 stopni.Kolejnym krokiem jest zabezpieczenie muchy w wosku. Ułóż muchę stroną brzuszną do dołu, tak aby jej przód był skierowany w górę stoku. Za pomocą pęsety precyzyjnej rozsuń pary nóg na zewnątrz i wciśnij je w wosk.Przed rozpoczęciem eksperymentu należy zapoznać się z położeniem mięśni, z których będą rejestrowane sygnały: mięśnia podłużnego grzbietowego (DLM) oraz mięśnia TTM. Podskórne miejsca przyczepu DLM odpowiadają obszarowi między linią środkową klatki piersiowej a przednimi szczecinkami grzbietowymi. Miejsca przyczepu TTM znajdują się grzbietowo w stosunku do tylnych i przednich szczecinek nadskrzydłowych. Aby upewnić się, że skrzydła nie będą blokować dostępu do włókien DLM lub TTM, należy odsunąć je na zewnątrz i przykleić do wosku. Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie odsunąć psis na zewnątrz i zabezpieczyć, zanurzając w wosku.Jest to krytyczny etap, który wymaga wprawy, ponieważ proboscis jest miękki i łatwo oddziela się od reszty głowy. Jeśli tak się stanie, należy odrzucić muchę i rozpocząć procedurę od nowa. Niezabezpieczenie głowy w ten sposób powoduje problemy podczas wprowadzania elektrod stymulujących przez oczy.Po przymocowaniu muchy do wosku, umieść preparat pod stereomikroskopem wewnątrz klatki Faradaya, orientując muchę bokiem, tak aby jej głowa znajdowała się po prawej stronie eksperymentatora. Kolejnym krokiem jest wprowadzenie elektrod. Przybliż elektrody do miejsc wkłucia za pomocą mikromanipulatorów, aby ułatwić ich prawidłowe rozmieszczenie i późniejsze rejestracje; nie patrząc przez okular mikroskopu, opuść elektrodę uziemiającą do tylnego końca odwłoka, używając kół regulacyjnych mikromanipulatora, aby umieścić zaostrzone wolframowe elektrody stymulujące w mózgu.Używając mikromanipulatora, ustaw końcówkę jednej z elektrod tak, aby lekko dotykała jednego z oczu muchy. Postąp tak samo z drugą elektrodą, tak aby obie elektrody dotykały powierzchni zewnętrznej każdego z oczu. Następnie wsuń elektrody do środka.Przesuń każdą elektrodę o około dwa do trzech milimetrów, tak aby ich końcówki dotarły do mózgu znajdującego się w tylnej części torebki głowowej. Prawidłowo umieszczone elektrody aktywują system włókien olbrzymich, co pozwoli sprawdzić poprawność ich rozmieszczenia. Przyłóż krótki impuls o napięciu od 30 do 60 V pomiędzy elektrody stymulujące i obserwuj ruchy skrzydeł oraz drżenia mięśni lotnych lub odnóży.Kolejnym krokiem jest wypełnienie szklanych mikroelektrod 3 M chlorkiem potasu za pomocą strzykawki Hamiltona lub plastikowej strzykawki wyciąganej termicznie, a następnie umieszczenie ich w mikromanipulatorach precyzyjnego sterowania. Prawidłowo wstawione mikroelektrody mogą być wykorzystywane w kilku seriach eksperymentów. Pierwszą elektrodę rejestrującą należy wprowadzić do włókna DLM.Występują dwa dwustronnie symetryczne mięśnie DLM. Każdy z nich składa się z sześciu pojedynczych włókien mięśniowych. Rejestrację można przeprowadzić z dowolnego z sześciu włókien, jednak najczęściej stosowane są włókna DLM 45 A i 45 B, ze względu na ich dobrą dostępność od strony grzbietowej kutykuli klatki piersiowej oraz fakt, że oba włókna są unerwione przez ten sam neuron ruchowy.Używając mikromanipulatora umieszczonego przy końcu insertora preparatu, wprowadź elektrodę rejestrującą do włókna 45 A lub B DLM po stronie muchy znajdującej się najdalej. Nachylenie platformy pozwala elektrodzie DLM wniknąć w kutykulę grzbietową pod kątem od 60 do 90 stopni, co ułatwia penetrację przy zastosowaniu oprogramowania w trybie oscyloskopu. Obserwuj monitor komputera podczas wprowadzania elektrody rejestrującej do klatki piersiowej.Gdy elektroda zostanie wprowadzona do mięśnia, linia bazowa spadnie do wartości bliskiej zeru lub ujemnej; wykonaj test z pojedynczym bodźcem, aby sprawdzić, czy można zaobserwować odpowiedź mięśniową. Wprowadź drugą elektrodę rejestrującą do TTM po stronie muchy znajdującej się najbliżej Ciebie. Tę elektrodę wprowadza się bocznie przed Tobą, ze względu na położenie miejsca przyczepu mięśnia.Ponownie obserwuj monitor podczas wykonywania tej czynności. Gdy zapis wskaże, że elektroda znajduje się w mięśniu, wykonaj pojedynczą stymulację w celu wywołania odpowiedzi mięśniowej. Aby rozpocząć stymulację mózgu i rejestrację odpowiedzi z mięśni nogi i mięśni lotnych, przyłóż impuls o czasie trwania 0,03 ms przez elektrody stymulujące, zaczynając od 30 V i zwiększając napięcie do 60 V, aż zaobserwujesz drgnienie mięśnia oraz depolaryzację komórki mięśniowej na monitorze komputera.W pozostałej części eksperymentu ustaw napięcie o 5 do 10 V powyżej progu odpowiedzi. Aby zmierzyć opóźnienie odpowiedzi, podaj co najmniej pięć pojedynczych bodźców z pięciosekundową przerwą między każdym bodźcem.Wyznacz częstotliwość następującą po sobie, podając serie bodźców z różną częstotliwością. Typowo podaje się 10 serii po 10 bodźców przy 100 hertz, 200 hertz i 300 hertz, zachowując dwusekundowy okres odpoczynku między każdą serią bodźców. Rycina ta przedstawia odpowiedzi zarejestrowane z TTMs oraz dlms po pojedynczym bodźcu podanym do mózgu.Latencja odpowiedzi to czas między stymulacją mózgu a depolaryzacją mięśnia. O prawidłowym przygotowaniu preparatu oraz właściwej technice rejestracji świadczą latencje wynoszące od 0,7 do 1,2 milisekund dla ścieżki G-F-T-T-M oraz od 1,2 do 1,7 milisekund dla ścieżki GF DLM. Latencje mogą się różnić w zależności od genotypu, tła genetycznego, temperatury i wieku, co pokazano tutaj.Rejestracje z TTM wykazują większą zmienność pod względem amplitudy i kształtu potencjału postsynaptycznego w porównaniu do rejestracji z dużych włókien DLM. Zwiększona zmienność wynika z niewielkiego rozmiaru włókien mięśniowych TTM. Ta zmienność nie wpływa jednak na wartości opóźnienia odpowiedzi dla ścieżki od włókna olbrzymiego do TTM.Rysunek ten przedstawia stymulację TTM i DLM przy częstotliwości 100 Hz oraz 200 Hz. Zarówno TTM, jak i DLM odpowiadają na wszystkie 10 bodźców przy 200 Hz. Odpowiedzi TTM pozostają w relacji jeden do jednego, natomiast odpowiedzi DLM zaczynają zanikać.Przyczyną braku możliwości śledzenia DLM przy częstotliwościach stymulacji powyżej 100 hertz jest fakt, że pośrednia synapsa chemiczna między dwoma neuronami pośredniczącymi nie ma wystarczająco dużo czasu na regenerację pomiędzy bodźcami. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w około 30 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat monitorowania neurotransmisji w obrębie drogi włókien olbrzymich.Osiąga się to poprzez stymulację włókna olbrzymiego w neuronach mózgu, a następnie rejestrację sygnałów z mięśnia skocznego oraz mięśni lotnych w klatce piersiowej.

electrophysiological-recordings-from-giant-fiber-pathway-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestracje elektrofizjologiczne z drogi włókien gigantycznych D. melanogaster

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Przedstawiono metodę sekcji in vivo brzusznego sznura nerwowego (VNC) dorosłego owada Drosophila. Ta konkretna metoda sekcji powoduje niewielkie uszkodzenia VNC, co umożliwia późniejsze znakowanie neuronów włókien olbrzymich barwnikiem fluorescencyjnym w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie całego preparatu brzusznego sznura nerwowego dorosłej Drosophila do wstrzykiwania barwnika do włókien olbrzymich

Opisano szybki test in vivo służący do badania związków neuromodulacyjnych z wykorzystaniem systemu włókien olbrzymich (Giant Fiber System, GFS) u Drosophila melanogaster. Nanowstrzyknięcia do głowy zwierzęcia wraz z rejestracją elektrofizjologiczną GFS mogą ujawnić bioaktywność związków w obrębie neuronów lub mięśni.

Połączony test nanoiniekcji i elektrofizjologii do przesiewowej oceny bioaktywności związków z wykorzystaniem systemu włókien olbrzymich Drosophila melanogaster

Wideo demonstruje zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) larw Drosophila. Przecięty OUN jest umieszczany w komorze rejestracyjnej, a aktywność elektryczna z nerwu zstępującego jest rejestrowana w celu ustalenia podstawowej częstotliwości wypalania. Następnie wprowadza się czynnik testowy i rejestruje się zmianę częstotliwości wypalania w celu określenia działania pobudzającego lub hamującego czynnika.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności elektrycznej w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Ten protokół demonstruje laserową ablację komórek pojedynczych neuronów u nienaruszonych larw Drosophila. Metoda umożliwia badanie efektu zmniejszenia konkurencji między neuronami w rozwijającym się układzie nerwowym.

Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną

Poznaj metodę elektrofizjologicznych zapisów potencjałów postsynaptycznych w szlaku włókien olbrzymich Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala badać przekaźnictwo synaptyczne w mięśniach DLM i TTM oraz oceniać właściwości funkcjonalne obwodów neuronalnych.

Rejestracje elektrofizjologiczne z drogi włókna olbrzymiego D. melanogaster

Przeglądaj więcej filmów