Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego z Vibrio natriegens

Weź zawiesinę Vibrio natriegens, która ma wysoką szybkość syntezy białek, w schłodzonym buforze, aby zapobiec degradacji komórkowej.

Wirować w niskich temperaturach.

Usunąć sklarowany osad w celu usunięcia zanieczyszczeń.

Zawiesić osad w małej objętości schłodzonego buforu.

Za pomocą końcówki o szerokim otworze przenieś zawiesinę do probówki mikrowirówkowej, aby zapobiec mechanicznemu ścinaniu.

Wymieszać zawiesinę i umieścić probówkę w uchwycie umieszczonym na lodzie.

Opuść końcówkę sonikatora do zawiesiny.

Zainicjuj sonikację, aby przerwać błonę komórkową i uwolnić zawartość cytoplazmatyczną.

Odwirować w celu oddzielenia nierozpuszczalnych resztek komórek.

Zebrać sklarowany nad osadem lub surowy ekstrakt komórkowy zawierający zawartość cytoplazmatyczną do świeżej probówki.

Błyskawiczne zamrożenie ekstraktu komórkowego w ciekłym azocie, aby zachować jego bioaktywność.

Przechowywać w bardzo niskich temperaturach do dalszego wykorzystania w ekspresji białek bezkomórkowych.

Schłodzić świeżo przygotowany bufor do lizy S30 pH 7,7 do około czterech stopni Celsjusza, Użyj 10 mililitrów tego zimnego buforu do lizy S30, aby ponownie zawiesić wszystkie granulki powstałe z tej samej jednolitrowej kultury