Adaptacyjna ewolucja bakterii przy użyciu mikrobiologicznego systemu hodowli mikrokropelek

Wstrzyknąć kulturę bakteryjną zaprojektowaną pod kątem tolerancji metanolu do jednej butelki z odczynnikiem, a pożywkę stresową o wysokim stężeniu metanolu do drugiej.

Dodaj olej do obu i umieść je w systemie hodowli mikrokropelek drobnoustrojów, aby osiągnąć temperaturę inkubacji.

Za pomocą pompy przepchnij płyny przez chip mikroprzepływowy.

Kultura bakteryjna miesza się z podłożem stresowym. Olej rozdziela mieszaninę na mikrokropelki, które przemieszczają się tam iz powrotem podczas uprawy.

Początkowo wysoki poziom stresu metanolowego spowalnia rozwój bakterii.

Z biegiem czasu niektóre komórki nabywają mutacje, które poprawiają wykorzystanie metanolu i proliferują.

System mierzy gęstość bakterii i selekcjonuje kropelki wykazujące wyższy wzrost.

Są one ponownie mieszane z podłożem stresowym w celu wzbogacenia w celu większego wykorzystania metanolu.

Po kilku cyklach ekstrahuj kropelki o dużej gęstości bakteryjnej, rozprowadź je na agarze i inkubuj.

Wyizoluj i hoduj utworzone kolonie w płynnym podłożu, aby uzyskać szczepy przystosowane do metanolu.

Wstrzyknąć wymagane objętości początkowego roztworu bakterii, świeżej pożywki i oleju MMC do oddzielnych wysterylizowanych butelek z odczynnikiem dla początkowego roztworu bakterii w świeżej pożywce, jak wyjaśniono wcześniej.

Aby wybrać funkcję ewolucji adaptacyjnej, kliknij ALE w oprogramowaniu. W interfejsie ustawiania parametrów włącz przełącznik wykrywania OD, a następnie ustaw wszystkie parametry opisane w manuskrypcie i naciśnij zakładkę Start, aby rozpocząć generowanie kropel. Proces zajmie około 25 minut.

Podczas każdego okresu poduprawy należy obserwować, czy maksymalne wartości OD kropel znacznie wzrosły. Jeśli wzrost nastąpi i spełni wymagania eksperymentu, kliknij przycisk eksportu danych, aby wyeksportować dane OD. Aby wyodrębnić docelowe kropelki z MMC, kliknij zakładkę przesiewania, aby wybrać funkcję ekstrakcji kropel.

Następnie wybierz opcję Collect i kliknij liczbę docelowych kropel. Po zakończeniu kliknij OK. Poczekaj, aż pojawi się wyskakujące okienko z komunikatem. Następnie włóż szybkozłączkę CF do probówki mikrowirówki w celu pobrania i kliknij OK. Po jednej lub dwóch minutach, gdy w interfejsie oprogramowania pojawi się nowe okno z komunikatem, włóż z powrotem szybkozłącze CF i kliknij OK, aby program MMC kontynuował działanie.

Gdy następna kropla docelowa dotrze do miejsca rozpoznawania kropli, zbierz ją zgodnie z wcześniejszymi opisami. Użyj pipety o pojemności 2,5 mikrolitra, aby wyjąć i umieścić kroplę na 90-milimetrowej solidnej płytce, a następnie równomiernie rozprowadź kroplę za pomocą szklanego trójkątnego pręta o boku długości trzech centymetrów, a następnie hoduj kroplę w inkubatorze o stałej temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Później wybierz od trzech do pięciu niezależnych kolonii bakterii, aby hodować każdą kolonię osobno w 50-mililitrowej kolbie do wytrząsania z 10 mililitrami świeżej pożywki w inkubatorze do wytrząsania przy 200 obrotach na minutę i 37 stopniach Celsjusza przez 48 do 72 godzin.

Po inkubacji należy postępować zgodnie z odpowiednimi standardowymi przepisami dotyczącymi przechowywania roztworu bakterii hodowlanych w probówce z glicerolem.