Wytwarzanie mutantów znakowanych antybiotykami w sinicach poprzez rekombinację homologiczną

Zacznij od kultury sinic.

Odwiruj kulturę, a następnie delikatnie umyj osad, aby zachować pilusy na powierzchni bakterii.

Ponownie odwirować, ponownie zawiesić osad w świeżym podłożu i przenieść do probówki.

Wprowadź wektor niereplikujący się z genem oporności na antybiotyki. Gen ten jest otoczony sekwencjami DNA, które są homologiczne do regionów znajdujących się przed i za genem docelowym w genomie bakteryjnym.

Inkubuj, aby umożliwić internalizację plazmidu za pośrednictwem pili, który dostosowuje się do sekwencji homologicznych i zastępuje gen docelowy poprzez rekombinację, wprowadzając w ten sposób mutację.

Rozłóż komórki na agarze i inkubuj, pozwalając genowi oporności na antybiotyki na ekspresję białka oporności.

Pokryj powierzchnię agaru agarem zawierającym antybiotyk i inkubuj. Białko oporności w zmutowanych komórkach dezaktywuje antybiotyk, ułatwiając im przetrwanie i tworzenie kolonii.

Wybierz kolonie, które przeżyły i ponownie nałóż na agar zawierający antybiotyk, aby oddzielić mutanty oporne na antybiotyki.

Po przygotowaniu pożywki, szczepów cyjanobakterii i plazmidów, zgodnie z protokołem tekstowym, należy utworzyć świeżą hodowlę, zaszczepiając pętlę pełną komórek cyjanobakter