Indukowalna ekspresja łańcucha toksyny rycynowej A oznaczonej hastydyną w E. coli

Zacznijmy od kolonii E. coli zawierających gen polimerazy T7 regulowany przez operatora lac oraz plazmid ekspresji.

Plazmid zawiera geny oporności na antybiotyki oraz łańcuch toksyny A na rycynie.

Gen oporności jest konstytutywnie wyrażany, tworząc białko oporne na antybiotyki.

Gen RTA jest oznaczony histidyną i regulowany przez promotor T7 oraz operatora lac.

Zaszczep kolonie do podłoża uzupełnionego antybiotykami i inkubuj poprzez potrząsanie wodą.

Białko oporności na antybiotyki inaktywuje biotyk, umożliwiając selektywny wzrost bakterii zawierających plazmid.

Przenieś hodowlę do podłoża z antybiotykami i inkubuj poprzez potrząsanie, aby wspomóc wzrost bakterii.

Obniż temperaturę hodowli, aby poprawić prawidłowe składanie białka RTA.

Dodaj induktor, aby złagodzić represję mękową. To wywołuje ekspresję polimerazy T7, inicjując transkrypcję RTA i syntezę białek.

Wiruj w wirówce, aby zebrać bakterie i wyrzucić supernatant.

Przemyj buforem, wiruję i usuwam supernatant.

Ponownie zawiesij bakterie wyrażające RTA z tagiem His w buforze.

Rozpocznij ten protokół od transformacji komórki, zgodnie z opisem protokołu tekstowego. Zaszczepić pięć mililitrów pożywki z LB kanamycyną komórkami zawierającymi